Utilizzando questo protocollo, qualsiasi laboratorio dotato di un microscopio confocale standard dotato di un laser da 405 nanometri può eseguire ablazioni laser progenitore di cellule ciliate e monitorarne la rigenerazione. A differenza dell'elettro-ablazione, questa tecnica limita i danni alle cellule circostanti ed è più accessibile di una potente configurazione laser UV pulsata. L'imaging confocale può anche essere eseguito immediatamente prima e dopo l'ablazione.
Questa tecnica ci consente di comprendere meglio il comportamento rigenerativo dei progenitori sensoriali, che può aiutare nello sviluppo di terapie per la perdita dell'udito umano. Per il montaggio, prima pipetta da tre a quattro larve anestetizzano in una piccola goccia di soluzione di tricaina E3 al centro del piatto da 35 millimetri, con un fondo di scorrimento di copertura di 14 millimetri numero 1,5. Rimuovere la soluzione in eccesso in modo che le larve rimangano in una piccola goccia abbastanza grande da contenerle.
E posizionare il piatto sul palco di un microscopio stereo binoculare. Manipolare lo zoom e la messa a fuoco in modo che tutte le larve siano nel campo visivo e utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere un sottile strato di agro-soluzione sullo scivolo di copertura. Rimuovere gli agro in eccesso fino a quando il liquido riempie il pozzo sul fondo del piatto, facendo attenzione a non aspirare larve.
E usa un coltello per capelli per orientare rapidamente le larve nell'agro-soluzione con il lato rostrale rivolto a sinistra. Premi delicatamente le larve contro il vetro, in modo che le larve giacciono di profilo con i loro lati destro rivolti verso il basso. Dopo circa 60 secondi, gli agro inizieranno a solidificarsi e le larve non potranno essere riorientate.
Dopo cinque minuti, utilizzare una pipetta di trasferimento per riempire il piatto a metà strada con E3 integrato con 1X tricaina. Per individuare i potenziali bersagli, accendere l'alimentazione al sistema di microscopia confocale a scansione laser e inizializzare il laser attraverso il software di imaging integrato. Selezionare l'obiettivo di immersione dell'olio Plan-Apochromat 63X e applicare l'olio ad immersione sull'obiettivo.
Fissare il piatto in un inserto circolare con l'aspetto rostrale delle larve rivolte a sinistra. Utilizzando l'illuminazione a contrasto di campo luminoso o interferenza differenziale, selezionare una delle larve montate per l'imaging e utilizzare la manopola di messa a fuoco per mettere a fuoco la pelle sul lato del pesce più vicino al coperchio. Passare all'illuminazione epifluorescente nel canale GFP e individuare la linea laterale posteriore per espressione GFP lungo il miosio orizzontale.
Anelli di cellule fluorescenti sono indicativi delle cellule del mantello neuromast e i filamenti allungati delle cellule sono le cellule interneuromast. A partire dal primo neuromast primordium migratore, usa il joystick di controllo dello stadio per scansionare visivamente caudally lungo il mioosepto orizzontale. Seguendo la stringa di cellule interneuromast fino a raggiungere la regione tra la terza e la quarta neuromaste primordium migratorie.
Se devono essere immagini diverse larve, selezionare la posizione per impostare la posizione del primo stadio. Dopo aver identificato i corpi cellulari nella regione L3, L4, passare alla modalità di acquisizione e utilizzare un laser appropriato per attivare la traccia di imaging GFP. Per aggiungere un canale di luce trasmesso alla traccia laser attivata, fate clic sulla casella T-PMT nel menu a discesa configurazione di imaging.
Per immagini le larve ET20, selezionare il laser da 488 nanometri, impostare la potenza laser sul 6% della dimensione del foro stenopeica su un'unità di area equivalente e il guadagno digitale su 750. Regolare i guadagni in modo che i corpi cellulari siano saturi per catturare proiezioni altrimenti fioche e filopodi. E impostare la dimensione del fotogramma su 1.024 per 1.024 pixel, la media su due e lo zoom digitale su 0,7.
Selezionare la casella Z stack per visualizzarlo nel menu a discesa Posizione Z. Durante la scansione rapida, concentrati fino a quando le cellule interneuromast non sono appena fuori fuoco e imposta la prima fetta. Mettere a fuoco l'esempio fino a quando le celle interneuromast non sono di nuovo fuori fuoco e impostare l'ultima fetta.
Quindi fare clic su Interrompi e quindi su Avvia esperimento per acquisire uno stack Z di pre-ablazione. Se le posizioni dello stadio sono state aggiunte, disattivare l'opzione posizioni in modo che solo la posizione corrente sia immagine e salvare il file una volta acquisito. Per l'ablazione laser dei corpi cellulari di destinazione, fare clic su mostra tutti gli strumenti nell'interfaccia di acquisizione e nel menu di configurazione dell'imaging selezionare aggiungi una nuova traccia.
Fate clic su colorante (dye) e selezionate DAPI. In Canali selezionare 405 per l'impostazione laser e aumentare la potenza del laser al 75%Deselezionare il canale DAPI per spegnere il laser durante la scansione dei corpi cellulari candidati per l'ablazione. Fare clic in tempo reale e con il corpo di una cella internauromast centrata nel campo visivo, ingrandire il fotogramma di scansione a 20-22X.
Interrompere la scansione dal vivo non appena il corpo cellulare riempie il campo visivo. Controllare la scatola dell'otturatore laser da 405 nanometri per attivare la traccia e impostare un timer per 45 secondi. Quindi, attivare la scansione continua e avviare il timer.
Interrompere immediatamente la scansione a 45 secondi. Per l'imaging dei corpi cellulari dopo l'ablazione, nel menu canali deselezionare la traccia DAPI per disattivare il laser di ablazione e aprire il menu della modalità di acquisizione. Fare clic su zoom e ridurre lo zoom a 0,7.
Per valutare il successo dell'ablazione cellulare, scansionare rapidamente il campo visivo. Utilizzando le stesse impostazioni di quelle per l'imaging pre-ablazione, acquisire e salvare un'immagine post-ablazione. Ispezionare l'immagine del canale del tubo fotomoltiplicatore della luce trasmessa per confermare ulteriormente il danno cellulare.
Le cellule danneggiate dimostreranno un aspetto granulare e i nuclei si gonfieranno frequentemente o appariranno di forma irregolare. Per valutare il recupero del corpo della cella post-ablazione, attivare sia la posizione dello stadio che le opzioni di tempo per l'acquisizione dell'immagine time-lapse e impostare i parametri di tempo sul punto di tempo sperimentale appropriato e intervalli di 15 minuti. Quindi, avviare l'esperimento per acquisire immagini e salvare il file risultante al termine.
In questo esperimento rappresentativo, è stata identificata la regione della linea laterale situata tra la terza e la quarta neuromaste primordium migratoria e sono state catturate immagini pre-ablazione. La scansione post-ablazione ha confermato che nessun corpo cellulare è rimasto nella regione ablata. Lasciando uno spazio tra le proiezioni allungate delle cellule interneuromast adiacenti.
L'analisi del canale del tubo fotomoltiplicatore della luce trasmessa dopo l'ablazione rivela cellule danneggiate e morenti. Caratterizzato da nuclei gonfi e di forma irregolare e da un aspetto granulare. Si può anche osservare il reclutamento di grandi cellule ameboidi che sono probabili macrofagi.
In questo esperimento, l'ablazione di diverse cellule nelle doppie larve transgeniche creò spazi considerevoli nella stringa delle cellule interneuromast, ma ebbe poco o nessun effetto sul nervo della linea laterale. Dopo l'ablazione laser, è possibile misurare le dimensioni dello spazio. Che vanno da pochi micron fino a 100 micron, a seconda della larghezza che le singole cellule neuromast e quante cellule sono selezionate per l'ablazione.
Dopo l'ablazione, alcune cellule interneuromast si riprendono entro le prime ore dall'imaging. Con la probabilità che la chiusura del gap si correli negativamente con la dimensione dello spazio. Anche nelle cellule interneuromast che non sono in grado di riprendersi, tuttavia, si può osservare la formazione di lunghe proiezioni dalle cellule interneuromast vicine, che possono assomigliare all'estensione dei coni di crescita neuronale.
È importante ispezionare a fondo il canale T-PMT alla ricerca di cellule danneggiate che presentano nuclei e granularità di forma irregolare e concedere tempo sufficiente affinché questi indicatori di morte cellulare diventino visibili. Un'ulteriore analisi dei dati di microscopia time-lapse risultanti, può potenzialmente rivelare nuovi comportamenti cellulari indotti dall'ablazione laser e può guidare lo sviluppo di esperimenti per identificare i regolatori di rigenerazione. Questa tecnica ci ha permesso di studiare i regolatori molecolari della rigenerazione delle cellule interneuromatiche fornendo un metodo rapido ed economico per danneggiare selettivamente queste cellule.
