Questo metodo fornisce un approccio ideale per studiare la guarigione delle ferite coloniche e i cambiamenti molecolari e istologici che si verificano a seguito di lesioni. Questo metodo può anche far luce sulla patogenesi IBD. Il principale vantaggio di questa tecnica è controllare con precisione la posizione della lesione e la tempistica del processo di guarigione delle ferite.
Gli individui che eseguono questo metodo per la prima volta possono avere difficoltà a inserire il colonscopio nel colon del mouse e creare ferite coerenti. Praticare ripetutamente queste tecniche dovrebbe superare questi problemi. Dati i molteplici passaggi coordinati e le sfumature coinvolte in questa procedura, la dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.
Prima di iniziare la procedura, inserire un endoscopio a foro rigido di 1,9 millimetri in una tona endoscopica. E collegare l'endoscopio assemblato alla sorgente luminosa e al dispositivo di imaging video secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare i tubi forniti per fissare la pompa dell'aria alla valvola del gas sul lato sinistro della toria accanto al canale di lavoro.
Assicurarsi che il canale di lavoro sia in posizione aperta e inserire tre forcep di biopsia francese attraverso il canale di lavoro. Avanza le forze fino alla fine della toraia senza sporgere dalla dentina. Quindi, posizionare il mouse anestetizzato su una piattaforma di staging endoscopica sul lato ventrale e confermare il livello appropriato di sedazione per mancanza di risposta al riflesso del pedale.
Dopo aver applicato l'unguento per gli occhi, riempire una siringa da tre millilitri con un ago di gavage per topo attaccato con PBS a temperatura ambiente. E inserire l'ago di circa un centimetro nell'ano del topo. Infondere delicatamente con PBS fino a quando il materiale fecale non è stato sgombrato.
Diversi pellet fecali dovrebbero uscire dal mouse insieme al PBS che è stato infuso. Inserire l'endoscopio assemblato di 0,5 centimetri nell'ano e far avanzare la biopsia nel lume cancellato del retto fino a quando le mascelle piene delle forcep non sono oltre la fine della fiena. Ruotare le forcep di 90 gradi in modo che le mascelle si aprano in un orientamento est-ovest e aprano le punte e avanzino le forceps di circa un centimetro, chiudendo e ritraendo le forcep in un movimento liscio e rapido per raccogliere la biopsia.
Per evitare di insufflare completamente il colon durante l'esecuzione della biopsia, lasciare aperto il lato destro della valvola del gas. Immediatamente dopo la biopsia, deprimere il pedale collegato al dispositivo di registrazione del colonscopio per avviare la registrazione video. E premere saldamente un dito indice contro il lato destro della valvola del gas per coprire completamente l'apertura, forzando l'aria nell'endoscopio e quindi nel colon.
Ritrarre le forcep fuori dalla tona e nel lume rettale mentre si è in posizione chiusa. E posizionare le forcep contro la parete rettale immediatamente sopra la ferita fino a quando la base delle ganasce non è allineata con il bordo superiore del campo di visualizzazione. Continuare a insufflare completamente il colon fino a quando non si può osservare una visione chiara della ferita.
Per ottenere le migliori misurazioni del letto della ferita, sii paziente, quindi posiziona il colonscopio con un angolo preciso in modo da ottenere la migliore immagine del letto della ferita. Apri il video in un programma software appropriato e avanza il video su un fotogramma che mostra un punto nel tempo in cui il letto della ferita può essere facilmente visualizzato. E in cui le forcep chiuse sono sopra il letto della ferita e contro la parete rettale, e il muro è teso.
In ogni momento, ottenere un'istantanea di questo telaio e codificare il nome del file per garantire che le misurazioni dei letti ferita siano eseguite in modo accecato. Per quantificare le dimensioni del letto della ferita, apri le immagini in ImageJ e usa lo strumento selezioni mano libera per disegnare un perimetro intorno alla ferita. In Analizza selezionare Misura.
E il valore di quella misurazione verrà popolato automaticamente nella finestra Risultati. Una volta acquisite tutte le misurazioni, calcolare la dimensione della ferita nei giorni successivi rispetto alla dimensione del giorno zero in un foglio di calcolo. All'endpoint sperimentale appropriato, aprire gli strati cutanei e muscolari addominali per esporre la cavità corporea dell'animale sperimentale e posizionare forcep chiuse sotto il colon.
Sollevare delicatamente il colon per rilasciarlo dal mesenterio sottostante e tagliare il tessuto nel punto centrale e nell'ano per raccoglierlo dal topo. Utilizzare una siringa da 20 millilitri riempita con PBS ghiacciata e dotata di un ago di gavage per topi per sciacquare il contenuto fecale. E posizionare i due punti cancellati su un pezzo di carta da filtro.
Aprire il colon longitudinalmente, facendo attenzione che il lato mesenterico sia a faccia in giù contro la carta filtrante. E utilizzare una pipetta Pasteur per coprire la mucosa con lo 0,2% di blu di metilene. Dopo alcuni secondi, scolare la macchia in eccesso e vedere il colon sotto un microscopio sezionato per localizzare il letto della ferita.
Usa le forbici Micro Iris da quattro pollici per tagliare intorno al bordo del letto, facendo attenzione a non tagliare lo strato muscolare. E utilizzare una pinzetta a punto fine per trasferire il tessuto sezionato in un tubo per il congelamento a scatto e o lo stoccaggio. All'endpoint sperimentale appropriato, aprire il colon raccolto longitudinalmente su un pezzo di carta filtrante, lato mesenterico verso il basso.
Coprire delicatamente il tessuto con il fissatore di scelta. Coprire il tessuto con parafilm in un contenitore sigillato per 4-6 ore prima della conservazione in 70%etanolo. Il giorno della lavorazione, rimuovere il parafilm e aggiungere lo 0,2% di blu di metilene al tessuto, come dimostrato.
Dopo aver drenare la macchia in eccesso, posizionare il tessuto sotto un microscopio sezionante per localizzare il letto della ferita. Usando un bisturi con una lama numero 10, tagliare direttamente attraverso il centro del letto della ferita e continuare a tagliare attraverso il resto del colon in linea retta, in modo che il colon sia tagliato a metà longitudinalmente. Per la criosezione, incorporare i pezzi del colon in modo che il lato tagliato dal bisturi sia a faccia in giù in uno stampo di base mezzo riempito con mezzo di congelamento dei tessuti.
Fissare il tessuto in posizione con una pinzetta fine e posizionare lo stampo di base su una piastra metallica o un foglio di alluminio spesso sopra il ghiaccio secco per indurire il mezzo di congelamento. Una volta congelata la parte inferiore del mezzo, riempire il volume rimanente dello stampo di base con mezzo di congelamento a temperatura ambiente. E riportare lo stampo sul ghiaccio secco fino a quando l'intero blocco tissutale non viene congelato.
Quindi, trasferire lo stampo in un congelatore di 80 gradi Celsius fino alla sessatura. Qui vengono mostrate immagini rappresentative di viste accettabili del letto della ferita per una quantificazione accurata delle dimensioni del letto della ferita e del tasso di chiusura della ferita. In questa vista ex-vivo di un letto di ferita, è possibile osservare indicatori del perimetro del letto della ferita e dove tagliare il tessuto per consentire la visualizzazione del letto della ferita al momento del sessatura.
In questa immagine rappresentativa, si può chiaramente osservare una sezione di macchia H ed E di un letto avvolto. È importante acquisire immagini istantanee del letto della ferita in ogni momento per garantire una valutazione accurata del tasso di guarigione della ferita. Dopo la biopsia delle pizzicazione, diversi agenti di interesse possono essere iniettati nel letto della ferita per testare i loro effetti sul tasso di guarigione della ferita.
