Questo protocollo mira a imitare l'impostazione clinica della malattia residua dopo la chirurgia di debulking del tumore, e quindi ci consente di testare nuove terapie oncologiche nel contesto della guarigione postoperatoria delle ferite. Il vantaggio di questa tecnica è che consente la standardizzazione della quantità di ferita inflitta e della quantità di tumore per rimanere. Questa tecnica è particolarmente importante per gli studi preclinici in quanto identificando nuovi trattamenti per i tumori, che ricadute localmente un esempio del quale è il sarcoma dei tessuti molli.
Questa dimostrazione visiva è fondamentale per dimostrare la tecnica di inversione, che ci consente di esporre il tumore attaccato al lato della pelle. Inizia questa procedura con l'inoculazione sottocutanea delle cellule tumorali preparate nei topi, come descritto nel protocollo di testo. Il giorno 12, dopo l'inoculazione, quando i tumori hanno raggiunto una dimensione di circa 50 millimetri quadrati, dosare topi con 100 microlitri di buprenorfina per via sottocutanea nello scruff del collo, 30 minuti prima dell'intervento chirurgico.
Impostare l'area chirurgica con il dissipatore di calore coperto da panca e impostare un cono del naso per l'anestesia. Disporre apparecchiature chirurgiche pulite in modo che siano facilmente raggiungibili, tra cui clorexadina, tampone, garza, gel per gli occhi, due forcep curve, forbici, applicatore a clip, smascheratore e ricariche di clip. Riscaldare la camera di riscaldamento a 37 gradi Celsius e impostare un altro riscaldatore per il recupero.
Si noti che questa procedura richiede due persone. Un assistente deve monitorare attentamente la respirazione del mouse durante la procedura. Dopo aver anestetizzato il mouse come descritto nel protocollo di testo, eseguire un test di avvicinamento delle dita e un test riflesso corneale per assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato prima di iniziare l'intervento chirurgico.
Coprire gli occhi del topo con una piccola quantità di gel oftalmico per evitare secchezza degli occhi. Inizia questo intervento tamponando l'area chirurgica con clorexadina. L'uso di forcette e un paio di forbici fanno un'incisione dritta di un centimetro lungo il lato dorsale, a tre millimetri di distanza dal tumore.
Non tagliare la pelle coprendo direttamente il tumore in quanto non guarirà bene. Evitare di usare un bisturi per tagliare il tumore e utilizzare una pinzetta per raccogliere i pezzi. Usando le pinzette, allontanare la fascia e il tessuto adiposo sottocutaneo tra il tumore e il peritoneo.
Il tumore sottocutaneo è normalmente attaccato al lato della pelle. Aprire la ferita tenendo delicatamente la pelle sul lato del cuscinetto tumorale usando una pinzetta e invertire il tumore in modo che sia visibile all'esterno. Usando un paio di forbici, tagliare la capsula tumorale dalla metà per rimuovere, a partire dalla base del tumore più vicina all'apertura.
Per un intervento chirurgico al 50% di debulk, attraversare il centro del tumore. Usando le forcep curve raccogliere la sezione del tumore da rimuovere. Raccogli tutti i resti dall'area di debulk.
Per il 75% di debulk, iniziare eseguendo un debulk tumorale del 50%, quindi tagliare a metà il restante 50% del tumore. Raccogliere il 25% del tumore usando forcep curve. Per chiudere il sito chirurgico, posizionare il tumore rimanente sotto la pelle e usando le alette, tirare insieme i lembi della pelle e allineare la pelle lungo la ferita.
Tenere la pelle insieme a cinque millimetri dal bordo della ferita e utilizzare clip chirurgiche per chiudere la ferita a partire dal lato, più vicino alle forcep. Applicare tutte le clip necessarie per assicurarsi che non sia esposto alcun tessuto sottostante. Generalmente, vengono applicate da tre a quattro clip con spazi vuoti di due millimetri tra le clip.
Lasciare che i topi si riprendano mettendoli nella camera di riscaldamento calda. Posizionare la gabbia del mouse sul tappetino termico. Monitorare i topi nella camera di riscaldamento fino a quando non si sono ripresi dall'anestetico.
Quindi, rimettere i topi nella gabbia, lasciare la gabbia sul dissipatore di calore per altri 10 minuti fino a quando i topi non sono diventati più attivi. Dai ai topi cibo umido e morbido. Monitorare i topi un'ora dopo l'intervento chirurgico per il recupero.
Monitorare nuovamente i topi alla fine della giornata e la mattina seguente e assicurarsi che le clip rimangano in posizione. Trattare i topi perioperatoriamente con avvento o terapia neoadiuvante in qualsiasi momento, a seconda del trattamento di interesse. Ad esempio, trattare i topi con una dose di 100 microgrammi di anti-CTLA-4 per via intraperitoneale il giorno 15 dopo l'inoculazione.
In alternativa, trattare i topi con tre dosi di 200 microgrammi di anti-PD-1 intraperitonealmente nei giorni, 15, 17 e 19 dopo l'inoculazione. La resezione chirurgica incompleta di tumori di 50 millimetri quadrati, qui indicata dalla linea tratteggiata, provoca una ricrescita riproducibile al 100% dei tumori in assenza di immunoterapia adiuvante. Pertanto, la crescita del tumore a una dimensione di 50 millimetri quadrati è una dimensione ideale per il debulk parziale.
Il modello è stato quindi utilizzato per testare le immunoterapie adiuvanti utilizzando anticorpi contro moduli checkpoint, proteine associate ai linfociti T citotossici quattro e recettore della morte programmato uno. Il trattamento dei topi con anti-CTLA-4, ha comportato un tasso di cura dell'80%Mentre il trattamento dei topi con anti-PD-1 ha portato a un tasso di cura del 25%La risposta con anti-PD-1 offre l'opportunità di testarlo nuove combinazioni, per migliorare ulteriormente il tasso di risposta. È importante che il tumore rimanente rimanga attaccato alla pelle, altrimenti l'apporto di sangue verrà interrotto e il tumore diventerà necrotico.
Seguendo questa procedura, i tumori possono essere analizzati con una varietà di metodi, come la citometria del flusso al fine di valutare come la chirurgia influisce sulle cellule infiltrazioni tumorali. Questo modello di topo ci ha permesso di esplorare come la guarigione delle ferite influisce sulle immunoterapie tumorali.
