Il nostro protocollo è significativo perché consente sia la dereplicazione economica che tempestiva di antibiotici noti senza l'uso di attrezzature specializzate. Il principale vantaggio di questa tecnica è la personalizzazione dei modelli. Ciò significa che un individuo può personalizzare quali geni di resistenza desiderano includere nel modello di libreria in base al livello desiderato di specificità del substrato ampia o stretta.
Ad esempio, un beta-lattamo esprime che il modello E.coli può essere preparato per consentire la dereplicazione altamente specifica dei beta-lattami e delle loro varie sottoclassi. Utilizzando una tecnica settica, pipettare 500 microlitri di catione regolati MHB da un serbatoio sterile in ogni pozzo di una piastra sterile a 96 profondi pozzi. Con le piastre di deformazione ARP o MARP preparate, utilizzare un bastoncino applicatore per inoculare la piastra del pozzo profondo 96 in conformità con la mappa ARP o MARP.
Posizionare una membrana sigillante traspirante sulla superficie della piastra del pozzo profondo e incubarla durante la notte a 37 gradi Celsius, 250 giri/min. Assicurarsi che non vi siano pozzi contaminati. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri da ogni pozzo della piastra del pozzo profondo a una piastra inferiore sterile a 96 po 'tondo.
Aggiungere 100 microlitri di glicerolo sterile al 50% in ogni pozza e mescolare tubazione delicatamente su e giù. Preparare almeno cinque piatti della biblioteca. Coprire le piastre con guarnizioni sterili in alluminio e assicurarsi che ogni pozzo sia sigillato individualmente.
Posizionare il coperchio della piastra sopra la guarnizione in alluminio e conservare a meno 80 gradi Celsius. Utilizzando un bastoncino applicatore di legno, raschiare delicatamente le spore dalla superficie di una colonia di streptomizi e trasferirla in una provetta contenente una perla di vetro sterile e tre millilitri di mezzo antibiotico streptomices. Chiudere la provetta liberamente con un tappo per consentire l'aerazione.
Usando lo stesso bastoncino applicatore di legno, striature un controllo di sterilità su una piastra di Petri contenente l'agar di Bennett. Incubare il tubo contenente coltura di semi a 30 gradi Celsius con aerazione per sei giorni a 250 RPM e la piastra di controllo della sterilità a 30 gradi Celsius per sei giorni. Quindi, su una superficie piana, preparare le piastre di deeplicazione.
Aspira 23 millilitri di agar caldo di Bennett in una pipetta sierologica e dispensa 20 millilitri uniformemente sulla superficie di una piastra di Petri rettangolare, lasciando il resto del mezzo nella pipetta per prevenire la formazione di bolle d'aria. Coprire il piatto con un coperchio. Ruotare delicatamente la piastra fino a quando il mezzo copre tutte le aree della piastra e non disturbarla fino a quando l'agar non si è impostato completamente.
Successivamente, preparare i fogli di membrana di nitrocellulosa utilizzando un coperchio rettangolare della piastra di Petri come modello di tracciamento in modo che i fogli si adattino alla superficie della piastra di deeplicazione. Tagliare i fogli e autoclavarli in una busta sterile. Ora, controllare la piastra di controllo della sterilità per assicurarsi che non siano presenti contaminanti dopo sei giorni di incubazione.
Se privo di contaminazione, rimuovere il coperchio della piastra rettangolare di Petri e pipettare 200 microlitri della coltura del seme sulla superficie dell'agar del Bennett nella piastra rettangolare. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per diffondere uniformemente la coltura sulla superficie dell'intero piatto. Per posizionare la membrana di nitrocellulosa preparata sopra la coltura sulla superficie della piastra di Petri, allineare il bordo inferiore della membrana al bordo inferiore della piastra di Petri e applicare lentamente la membrana dal bordo inferiore al bordo superiore della piastra.
Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per appianare eventuali bolle d'aria che potrebbero aver formato tra l'interfaccia dell'agar a membrana, assicurando che la membrana sia a filo dell'agar. La membrana consente agli organismi di sporulare sulla sua superficie mentre i metaboliti secondari possono essere escreti nel mezzo sottostante. Riposizionare il coperchio sulla piastra rettangolare di Petri e posizionarlo capovolto in un sacchetto di plastica sigillato.
Incubare a 30 gradi Celsius per sei giorni. Dopo sei giorni, rimuovere la piastra di dereplicazione dall'incubatore. Utilizzando pinzette sterili, rimuovere con cura la membrana di nitrocellulosa dalla superficie dell'agar del Bennett.
Assicurarsi che vi sia solo una crescita minore delle spore intorno ai bordi della piastra per ridurre le possibilità di contaminare la sovrapposizione da aggiungere. Assicurarsi che la superficie di lavoro sia livellata e utilizzare una pipetta sierologica per aspirare 23 millilitri di agar MHB regolato per il catione caldo. Creare una sovrapposizione erogando 20 millilitri uniformemente sulla superficie della piastra di deeplicazione, lasciando il resto dell'agar nella pipetta per evitare la formazione di bolle d'aria.
Posizionare il coperchio sul piatto. Ruotare delicatamente la piastra fino a quando il mezzo copre tutte le aree e non disturbarla fino a quando l'agar non si è impostato completamente. Una volta raffreddato e solidificato, riportare la piastra di deeplicazione nel sacchetto di plastica sigillato e conservarla capovolta a quattro gradi Celsius durante la notte, consentendo la diffusione di metaboliti secondari nella sovrapposizione dell'agar MHB.
Lo stesso giorno, inoculare un modello ARP o MARP fresco con la prima pipettazione di 100 microlitri di MHB regolati per il catione in ogni pozzo di una piastra da 96 porri. Estraete la piastra di libreria ARP o MARP congelata dal congelatore meno 80 gradi Celsius. Rimuovere la guarnizione in alluminio prima che la condensa inizi a formarsi sul lato inferiore.
Utilizzando strumenti sterili di pinning da 96 po', appuntare con cura dalla piastra di libreria ARP o MARP congelata e inoculare l'MHB fresco contenente piastre da 96 pozza. Per ridurre al minimo la contaminazione durante la dereplicazione, preparare tutte le lastre di libreria ARP o MARP necessarie per deeplicare solo due o tre piastre di deepliazione per piastra di libreria. Una volta completato, mettere una nuova guarnizione sterile in alluminio sul modello congelato e restituirla al congelatore meno 80 gradi Celsius.
Posizionare le piastre inoculate da 96 po 'all'interno di un sacchetto di plastica vagamente sigillato e incubare a 37 gradi Celsius con tremare a 250 giri/min per 18 ore. Rimuovere il modello ARP o MARP dall'incubatore e assicurarsi che non siano presenti contaminanti confrontando la piastra con la mappa del modello ARP o MARP. Rimuovere le piastre di deeliazione da quattro gradi Celsius e lasciare equilibrare a temperatura ambiente.
Se c'è condensa, aprire i coperchi e lasciare asciugare in un ambiente sterile. Utilizzando strumenti di pinning sterili, pin dalla piastra della libreria ARP o MARP sulla superficie della sovrapposizione di agar MHB delle piastre di deeplication. Fai attenzione a non perforare l'agar.
Lasciare asciugare l'inoculo del modello per tre o cinque minuti. Posizionare le piastre di deepliazione inoculate capovolte in un sacchetto di plastica sigillato e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, analizzare i risultati della dereplicazione confrontando la crescita sulla piastra di deeplicazione con i pozzi che corrispondono alla mappa ARP o MARP.
In questo flusso di lavoro di dereplicazione ARP o MARP è stato raggiunto un risultato positivo di dereplicazione. In cui l'estratto preparato per il ceppo WAC 8921 è stato identificato come produttore di cloramfenicolo. La mancanza di crescita ARP indica la presenza di un antibiotico sconosciuto o di un antibiotico meno comunemente trovato che non è stato contabiliato nella piastra della libreria ARP o MARP.
Un modello di crescita unico per il MARP è stato formato a causa del suo utilizzo sia di tipo selvaggio E.coli BW25113 che di un mutante iper-permeabile ed e-flux carente di E.coli BW25113 bamB tolC. Questo risultato suggerisce la presenza di un composto con attività antimicrobica che non era in grado di superare una membrana esterna intatta. Questo modelli di crescita E.coli suggerisce la sterilizzazione impropria degli strumenti di pinning, con conseguente trasferimento di ceppi E.coli sconosciuti attraverso la sovrapposizione.
E un esempio di contaminazione delle lastre di libreria di scorte congelate ARP o MARP è mostrato qui con tre distinte colonie di E.coli coltivate sulla superficie rettangolare della piastra di Petri. Questo risultato indica che la sovrapposizione dell'agar è stata perforata durante la dereplicazione. La contaminazione correlata alla sovrapposizione MHB può verificarsi anche durante il processo di deeplicazione, mostrando un modello di crescita irregolare sulla superficie della sovrapposizione.
La cosa più importante da ricordare quando si segue questo protocollo è utilizzare tecniche di sterilizzazione e asettiche adeguate per assicurarsi di non essere trattenuti in alcun passaggio a causa della contaminazione. Ciò include la preparazione della membrana di nitrocellulosa in modo che si adatti alla superficie della piastra di agar del Bennett il più vicino possibile al fine di ridurre al minimo la diffusione delle spore quando si versa la sovrapposizione MHB. Inoltre, è anche estremamente importante utilizzare apparecchiature di pinning correttamente sterilizzate quando si inoculano le piastre della libreria e si dereplicano al fine di produrre il risultato più pulito.
Oltre a dereplicare gli antibiotici noti, questo metodo può essere applicato all'identificazione di coadiuvanti che possono essere utilizzati in combinazione con antibiotici esistenti per salvare la loro attività. Sebbene la dereplicazione antibiotica non sia una nuova tecnica, è nota per essere ad alta intensità di risorse e dispendiosa in termini di tempo. La piattaforma ARP e MARP aiuta a far luce su come la dereplicazione antibiotica non deve essere una produzione di grandi dimensioni, ma piuttosto può essere completata per un periodo di due settimane utilizzando attrezzature minime.
