Abbiamo dimostrato che i genomi virali del gruppo IV codificano brevi tratti di sequenze proteiche ospiti. Queste sequenze possono essere trovate all'interno dei siti di scissione proteasi virale. Vengono utilizzati per la distruzione mirata delle proteine ospiti, tipicamente proteine coinvolte nella generazione delle risposte immunitarie.
Un grande vantaggio dell'uso di saggi proteasi è che rimuove la complessità di una cellula e mostra se una proteasi virale può o meno scindere una particolare sequenza. Così, quando abbiamo analizzato le sequenze di Zika SSHHPS, abbiamo scoperto che la proteasi poteva tagliare sequenze di proteine coinvolte nella generazione di risposte immunitarie e che alcune di queste proteine avevano anche ruoli nello sviluppo cerebrale e oculare. Quando si esegue questa tecnica per la prima volta, si dovrebbe ricordare che se la scissione non viene osservata, che può essere dovuta a una varietà di fattori come l'attività della proteasi.
A dimostrare la procedura sarà Jaimee Compton, un tecnico del mio laboratorio. Inizia aprendo Protein BLAST e metti i 20 amminoacidi che circondano il legame scissile e la poliproteina virale e seleziona sequenze proteiche non ridondanti, quindi digita il genoma ospite da cercare. Se necessario, selezionate PHI-BLAST e digitate una sequenza di serie in cui le parentesi quadre indicano che entrambi gli amminoacidi all'interno delle staffe possono essere nella posizione sostitutiva, quindi premere BLAST.
Ordine di classificazione dei colpi BLAST in base al numero di residui consecutivi identici o tollerati che corrispondono a una sequenza di sito di scissione. Dall'elenco, selezionare le proteine contenenti sei o più residui identici o simili per l'analisi nei saggi di proteasi. Costruisci un plasmide che codifica per la proteina fluorescente ciano, fino a 25 aminoacidi della sequenza di scissione e la proteina fluorescente gialla.
Successivamente, preparare i substrati CFP e YFP inoculando quattro matracci da quattro litri con 25 millilitri di una coltura notturna. Agitare le colture a 37 gradi Celsius e monitorare la crescita ogni ora mediante spettroscopia UV-Vis a 600 nanometri. Quando i batteri raggiungono un'assorbanza di circa uno, indurre l'espressione proteica aggiungendo 0,5 millilitri di un IPTG molare a ciascun pallone, quindi abbassare la temperatura dell'incubatore di scuotimento a 17 gradi Celsius e consentire all'espressione di continuare durante la notte per 17-20 ore.
Il giorno successivo, pellet i batteri per centrifugazione a 7000 volte g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere e scartare il supporto liquido, quindi conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius o procedere con la lisi cellulare. Per lenire le cellule, preparare 100 millilitri di tampone di lysis secondo le indicazioni manoscritte, rimescolare il pellet nel tampone e trasferire da 25 a 25 millilitri della sospensione a tubi conici monouso da 50 millilitri.
Posizionare i tubi in un becher di plastica con acqua ghiacciata, quindi inserire la punta del sonicatore nel tubo in modo che la punta sia a circa un centimetro dal fondo del tubo e sonicare il lisato da 10 a 20 volte fino a quando non diventa fluido e liqueficato. Dopo la sonicazione, trasferire il lysate in tubi di centrifuga ad alta velocità e centrifugarlo a 20, 500 x g per 30 minuti a 4 gradi Celsius. Trasferire il supernatante in una bottiglia pulita e scartare il pellet.
Caricare il lisato sulla colonna di nichel, quindi lavare la colonna con due volumi di colonna di tampone A seguiti da cinque volumi di colonna del 20% tampone B.L'assorbanza a 280 nanometri aumenterà durante il lavaggio poiché i contaminanti eluiranno dalla colonna. Continuare il lavaggio fino a quando A280 non torna ai valori di base. Quindi elutare la proteina con due o tre volumi di colonna del 100% tampone B e raccogliere 10 frazioni di millilitro, assicurandosi di misurare l'A280 di ogni frazione.
Preparare otto miscele di reazioni in base alle direzioni del manoscritto e pipetta 45 microlitri di ogni miscela nei primi tre pozzi di ogni fila di una piastra nera a mezza area da 96 pozzetti. Impostare il lettore di lastre per il rilevamento simultaneo della florescence a due lunghezze d'onda con un'impostazione fissa del tubo fotomoltiplicatore. Programma il tempo di lettura a 20-30 minuti con una lettura al minuto e seleziona i pozzi da leggere.
Inserire la piastra nella macchina e avviare la lettura, monitorando i rapporti di emissione nel tempo. Eseguire una lettura endpoint della piastra contenente il substrato non tagliato. Rimuovere la piastra e pipettare cinque microlitri di enzima in ogni pozzo.
È possibile salvare la prima colonna come controllo non tagliato. Quindi leggere di nuovo la piastra per 20-30 minuti, assicurandosi di impostare il lettore di piastre sui valori assoluti di uscita. Una volta completata la lettura, sigillare la piastra con pellicola per evitare l'evaporazione e lasciarla durante la notte a temperatura ambiente per consentire all'enzima di tagliare completamente il substrato.
Dopo 24 ore, rimuovere il film ed eseguire una lettura finale della piastra. Mediare i rapporti di emissione e registrarli come tagliati. Confermare la scollatura del substrato utilizzando SDS-PAGE.
Caricare un marcatore di peso molecolare nella prima o nell'ultima corsia e caricare cinque microlitri di ogni miscela di reazione in una corsia del gel, a partire dalla reazione non tagliata. Collegare gli elettrodi del serbatoio del gel all'alimentatore ed eseguire i prodotti a 110 volt per 60 minuti. Rimuovere il gel dalla cassetta utilizzando uno strumento di cracking e immergerlo in cinque-10 millilitri di soluzione di colorazione.
Dopo una o 24 ore, rimuovere la macchia in eccesso e immergere il gel in acqua. Quindi scatta una foto del gel usando un gel imager. Per preparare la struttura proteica, caricare il file PDB proteico in MOE.
Fare clic su Seleziona e solvente, quindi eliminare il solvente. Aprite il pannello Struttura pPreparazione (Structure pPreparation) dalla barra dei menu Superiore calcolo (Compute top menu bar) e correggete automaticamente tutte le voci strutturali facendo clic su Correggi (Correct). Protonare la struttura facendo clic su Protonate 3D.
Aggiungere cariche parziali alla proteina aprendo il pannello Cariche parziali e selezionando AMBER 99 e Regola idrogeno e coppie solitarie come richiesto. Quindi salvare il file di struttura. Per costruire la struttura per i peptidi del substrato e TRIM14, aprite il pannello Generatore proteine, immettete la sequenza del substrato e selezionate Riconfeziona automaticamente.
Quindi, impostate Geometria come estesa (Geometry as Extended) e fate clic su Genera (Build). Infine ridurre a icona la struttura e salvarla come file PDB. Agganciare i peptidi del substrato a VEEV-nsP2 utilizzando il software PyRx AudoDock 4.2.
Caricare la proteina, fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome e scegliere Crea macromolecola per preparare il file di ancoraggio PDBQT. Quindi caricare la molecola del substrato e selezionare Crea Ligando per preparare il file di aggancio del ligando. Avviare la procedura guidata AutoDock sul pannello ancoraggio nella parte inferiore e selezionare i file di ligando e proteine preparati.
Definire la tasca di legame proteico regolando manualmente la dimensione della griglia, quindi eseguire AuotGrid. Eseguire quindi AutoDock e selezionare il metodo dell'algoritmo genetico Lamarckian. Fare clic su Parametri ancoraggio e impostare il numero di esecuzioni GA su 50, quindi fare clic su Avanti per avviare l'ancoraggio.
Al termine dell'autodock, aprite il pannello Analizza risultati e ispezionate tutte le pose di associazione previste. Selezionare il modello migliore con la più bassa energia di legame prevista e interazioni di legame ragionevoli tra il cis-477 e il substrato sul sito di scissione, quindi salvarlo come file PDB per ulteriori simulazioni MD. Dopo aver letto le pose di associazione con AutoDock, è importante eseguire analisi post-docking per identificare il modello di binding plausibile per il perfezionamento con simulazioni MD.
Questo protocollo è stato utilizzato per trovare brevi tratti di sequenze omologhe di proteine patogene ospiti o SSHHPS nel virus Zika ns2B/3 proteasi. Sono stati identificati quattro obiettivi proteici ospiti. FOXGS, SFRP1, una subunità di Gsalpha da una libreria cDNA retinica, e la mitocondriale NT5M 5'3'nucleotidasi.
Gli allineamenti di sequenza dello SSHHPS hanno permesso differenze specifiche delle specie nelle sequenze del sito di scissione. La sequenza SFRP1 era identica negli esseri umani e nei polli, il che è degno di nota perché il virus Zika può indurre mortalità e microcefalia negli embrioni di pollo. Il saggio continuo è stato utilizzato per misurare parametri cinetici a stato stazionario e costanti di inibizione per le sequenze di poliproteina virale e il saggio discontinuo è stato utilizzato per ottenere informazioni qualitative sulla scissione, come la scissione di una particolare sequenza o l'inibizione della proteasi da parte di vari composti.
Un modello dell'encefalite equina venezuelana nsP1-nsP2 è stato realizzato utilizzando metodi silico. Per la proteasi nsP2, allungare la sequenza del substrato e ridurre la forza ionica del tampone ha portato ad una significativa riduzione della costante di Michaelis di scissione di una sequenza di virus della foresta di Semliki. Quando si tenta questa procedura, è importante eseguire i controlli.
I substrati contenenti le sequenze del sito di scissione proteasi virale devono essere testati prima di procedere con l'analisi della sequenza SSHHPS. Se si osserva la scissione di una proteina ospite, devono essere effettuati esperimenti di follow-up per confermare che tale proteina ospite influisce sulla replicazione virale. Questo può essere fatto sovraesprimendo o silenziando la proteina, e quindi esaminando gli effetti sulla replicazione virale.
Il gruppo IV contiene un gran numero di agenti patogeni nuovi ed emergenti. Le sequenze SSHHPS collegano proteine e percorsi ospiti specifici con le proteasi virali in modo molto prevedibile.
