Il nostro metodo è uno dei primi ad essere in grado di sezionare le basi genetiche delle differenze di tratto su scala genomica tra specie anziché all'interno delle specie. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è ad alta produttività, alta risoluzione e ampiamente applicabile. Per iniziare questa procedura, recuperare il ceppo di scorte di congelatori JR507 dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius e strizzarlo su singole colonie su una piastra di agar YPD.
Incubare a 26 gradi Celsius per due giorni o fino a quando non compaiono colonie. Quindi inoculare 100 millilitri di YPD liquido in un pallone di vetro da 250 millilitri con una singola colonia di JR507 e incubare a 28 gradi Celsius mentre si trema a 200 giri/min per 24 ore o fino a raggiungere la fase stazionaria. Il giorno dopo, misura l'od600 della cultura notturna.
Torna a diluire parte della coltura notturna con YPD liquido fresco in un nuovo pallone da un litro per creare una nuova cultura con un od600 di zero punti due e un volume di 500 millilitri. Ripetere questo processo altre tre volte per creare un totale di quattro culture con un od600 di zero punti due, utilizzando la stessa cultura notturna per tutte le nuove culture. Incubare tutte le colture a 28 gradi Celsius per sei ore mentre si trema a 200 giri/min.
Dopo questo, combina due delle colture da 500 millilitri per creare una cultura da un litro. Unire le restanti due colture da 500 millilitri per creare una seconda coltura da un litro. In primo luogo, dividere ciascuna delle colture da un litro in 20 aliquote da 50 millilitri ciascuna in un tubo conico di plastica per un totale di 40 tubi.
Mettere da parte 20 tubi. Centrifugare i restanti 20 tubi a 1000 volte G per tre minuti per pellettare le cellule di lievito. Scartare il supernatante e rimescolare ogni pellet con 25 millilitri di acqua sterile con vortice.
Centrifuga a 1000 volte G per tre minuti. Scartare il supernatante e rimescolare ogni pellet con cinque millilitri di 1X Tris-EDTA zero point un tampone di acetato di litio molare mediante vortice. Centrifuga a 1000 volte G per tre minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare nuovamente ogni pellet con cinque millilitri 1X Tris-EDTA zero point un tampone di acetato di litio molare mediante vortice. Centrifuga a 1000 volte G per tre minuti. Mentre le cellule sono centrifughe, preparare almeno 120 millilitri di una soluzione contenente polietilene glicole, acetato di litio e tampone Tris-EDTA.
Conservare questa soluzione sul ghiaccio. Per preparare il DNA plasmatico per la trasformazione, prima far bollire quattro millilitri di DNA dello sperma di salmone a 100 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo questo, raffreddarlo immediatamente sul ghiaccio per cinque minuti.
Mescolare 20 millilitri di pJR487 ad una concentrazione di 538 nanogrammi per millilitro con quattro millilitri del DNA freddo dello sperma del salmone. Mantenere questa miscela sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l'uso. Successivamente, aggiungere 600 microlitri della miscela plasmatica e DNA spermatico sopra ogni pellet cellulare.
Aggiungere tre millilitri della miscela PEG di ACETATO di litio TE ad ogni pellet. Sospendiamo tubazioni su e giù e poi vortice. Incubare i tubi a temperatura ambiente per 10 minuti.
Quindi scaldare ogni tubo in un bagno d'acqua a 39 gradi Celsius per 26 minuti, assicurandosi di invertire ogni tubo ogni pochi minuti. Centrifugare i tubi a 1000 volte G per tre minuti. Scartare il supernatante e rimescolare ogni pellet in 10 millilitri di YPD con vortice.
Dopo questo, combina tutti i 20 tubi in un nuovo pallone di vetro. Aggiungere 433 punti quattro millilitri di YPD liquido in un nuovo pallone di vetro da un litro. Quindi trasferire 66 punti sei millilitri di cellule nel pallone.
Ripetere questo processo di trasferimento altre due volte per utilizzare l'intero volume delle celle trasformate. Quindi misurare l'od600 di ogni nuova coltura da 500 millilitri. Incubare tutte e tre le colture a 28 gradi Celsius per due ore mentre si trema a 200 giri/min.
Dopo questo aggiungere zero punti cinque millilitri da 300 milligrammi per microlitro G418 a ciascuno dei contenitori a una concentrazione finale di 300 microgrammi per millilitro. Riportare i contenitori all'incubatore di scuotimento a 28 gradi Celsius e 200 RPM. Ripetere l'intero processo con i restanti 20 tubi conici.
A questo punto, ci dovrebbero essere sei mastri da un litro, ognuno contenente 500 millilitri di cellule con G418 aggiunto. Incubare tutti e sei i contenitori a 28 gradi Celsius con tremori a 200 giri/min per circa due giorni o fino a raggiungere un od600 di circa due punti tre in ogni pallone. Quindi, combina tutti e sei i contenitori insieme per creare un'unica cultura.
Utilizzare questa coltura combinata per inoculare due nuovi contenitori da un litro con 500 millilitri di YPD e G418 a un od600 di zero punti due. Incubare queste nuove colture durante la notte a 28 gradi Celsius con tremori a 200 giri/min fino a raggiungere un od600 di circa due punti due. Successivamente, combina entrambe le culture in un'unica cultura e misura l'od600 della cultura combinata.
Centrifuga 25 millilitri di questa coltura a 1000 volte G per tre minuti. Calcolare il numero totale di unità od600 totali di celle che si trovano nei 25 millilitri come delineato nel protocollo di testo. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in acqua sufficiente a creare una sospensione cellulare con un od600 di un punto otto cinque per millilitro.
Utilizzando perline di vetro, placcare un millilitro di celle rimostrate su ciascuna delle 12 grandi piastre di agar sintetiche complete quadrate con 5-FOA. Incubare ogni piatto a 28 gradi Celsius per uno o due giorni o fino a quando non si forma un prato sul piatto. Successivamente, utilizzare piccoli cigoli sterili per raschiare le cellule da metà della piastra e in un tubo, contenente 35 millilitri di acqua sterile.
Ripetere questo processo per le restanti sei piastre, con il risultato di due tubi di celle in acqua. Unire le sospensioni cellulari in un unico pallone e misurare l'od600 della sospensione, utilizzando l'acqua come vuoto. Utilizzare acqua per regolare la concentrazione cellulare fino a quando l'od600 raggiunge 44 punti quattro per millilitro.
Preparare quindi le scorte di celle congelatrici e conservarle a meno 80 gradi Celsius, come indicato nel protocollo di testo. In questo studio, S.Cerevisiae e S.Paradoxus sono accoppiati per formare un ibrido sterile, che viene sottoposto a trasposizione sulla mutagenesi. Ogni clone mutagenizzato è un emizigote, un ibrido diploide in cui un allele di un gene viene interrotto.
Gli emizigoti sono gareggiati ad alta temperatura, e il DNA è isolato da ogni coltura. Il DNA è shirred e legato agli adattatori, e la giunzione tra il transposone e il genoma è amplificata con un primer specifico per il transposone e un primer specifico dell'adattatore. Contando i conteggi delle lezioni di sequenziamento in blocco dall'amplicon, segnala l'idoneità di un clone nella popolazione.
Con i risultati alla mano di questo sequenziamento, l'abbondanza di emizigoti per un dato gene, può essere confrontata alle due temperature tra due classi di emizigoti. Cloni in cui solo l'allele di S.Cerevisiae era di tipo selvaggio e funzionale, e cloni che si basano solo sull'allele di S.Paradoxus. In questa implementazione rappresentativa, vengono rilevati segnali forti in otto geni delle pulizie.
In ogni caso, inserimenti transposon nell'allele S.Cerevisiae nell'ibrido, crescita compromessa ad alta temperatura. Questi bassi si rappresentavano determinanti candidati del tratto di termotoleranza che distingue S.Cerevisiae da S.Paradoxus. Ora che abbiamo completato questo esperimento, possiamo sezionare altri tratti che differiscono tra queste specie, come la tolleranza al freddo o al sale.
