Questo protocollo può aiutare nella scoperta di potenziali piccole molecole antivirali attraverso un approccio basato su meccanismo. Il test del momento dell'addizione determina in quale fase dell'infezione la piccola molecola mostra la sua attività antivirale. L'attracco molecolare prevede l'interazione tra la piccola molecola e le proteine virali.
Per valutare l'influenza dei farmaci sulle cellule ospiti prima dell'infezione virale, seminare cellule RD in piastre di 12 po 'a due volte 10 alla quinta cellule per densità di placcatura del pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica del 5% durante la notte. La mattina seguente, trattare ogni pozzo del monostrato RD con un composto di prova di interesse, in triplice copia, a concentrazioni non tossiche in un millilitro di mezzo basale per una o quattro ore.
Al termine dell'incubazione del trattamento, lavare le cellule con un millilitro di PBS prima di aggiungere 50 unità di virus che formano la placca in 300 microlitri di mezzo basale per pozzo per un'ora, con dondolo ogni 15 minuti. Al termine dell'incubazione dell'infezione, lavare le cellule con PBS e sovrapporre le cellule con un millilitro di mezzo basale fresco contenente lo 0,8% di metilcellulosa. Dopo 72 ore nell'incubatrice di coltura cellulare, lavare ogni bene con due millilitri di PBS e fissare le cellule con 0,5 millilitri di formaldeide al 37% per pozzo per 15 minuti.
Al termine della fissazione, lavare i pozzi con PBS e macchiare le cellule con 0,5 millilitri di soluzione di viola cristallo allo 0,5% per pozzo. Dopo due minuti, lavare i pozzi con un leggero flusso d'acqua e lasciare asciugare all'aria la piastra. Quindi posizionare la piastra su una scatola di luce bianca per il conteggio e calcolare la percentuale di cellule infette da coxsackievirus in base alla formula.
Per l'analisi di docking molecolare, scaricare molecole 3D dei composti di prova da PubChem. Se una molecola non ha una struttura 3D caricata, scaricare la struttura 2D o utilizzare la sequenza di stringhe SMILE per trasformare la struttura in una molecola 3D tramite un programma molecolare appropriato. Quindi, scarica un'unità di assemblaggio biologico virale da RCSB Protein Data Bank.
Utilizzando un programma di bio-computing appropriato, eliminare i solventi dal file Protein Data Bank, sostituire le catene laterali incomplete utilizzando i dati della libreria di rotameri Dunbrack 2010 e aggiungere idrogeno e cariche alla struttura come riportato in precedenza. Per agganciare i composti di prova all'unità virus preparata, caricare il file del composto di prova nella Chimera dell'Università della California di San Francisco come ligando e selezionare l'intera proteina virale preparata come recettore per eseguire l'attracco cieco. Per un ulteriore attracco, limitare il sito di attracco alla proteina virale in regioni di interesse derivate dai risultati dell'attracco cieco riducendo ulteriormente il volume di ricerca.
Quindi caricare il file di ancoraggio in un sistema di grafica molecolare appropriato per analizzare le posizioni della modalità di associazione. Selezionare il ligando per trovare i contatti polari dal composto alla proteina virale, identificando i contatti polari con l'opzione a qualsiasi atomo. Entrambe le piccole molecole testate in questo esperimento rappresentativo, hanno prodotto solo un impatto marginale contro l'infettività del coxsackievirus A16, sia nel pretrattamento delle cellule ospiti prima dell'infezione virale che nel trattamento post-infezione.
Al contrario, le molecole hanno efficacemente abrogato l'infezione di oltre l'80% nel trattamento di co-addizione, suggerendo che i due composti sono i più efficaci quando sono presenti contemporaneamente con le particelle virali sulla superficie della cellula ospite durante l'infezione. L'analisi di legame basata sulla citometria del flusso conferma che i due tannini hanno impedito l'ingresso di infettività coxsackievirus A16 impedendo il legame delle particelle virali alle cellule ospiti. L'aggancio molecolare dei tannini indica che entrambi sono previsti per legarsi nella regione del canyon del pentamero coxsackievirus, appena sopra l'ingresso tascabile che tiene il fattore tascabile e svolge un ruolo importante per mediare il legame coxsackievirus e l'ingresso nella cellula ospite.
In queste proiezioni superficiali si possono osservare i residui unici previsti dai contatti polari delle piccole molecole attorno all'ingresso tascabile, con asparagina-85, lisina-257 e asparagina-417 in comune tra i due tannini. Per l'attracco molecolare, la topologia della proteina virale deve essere presa in considerazione quando si classificano i fotogrammi di legame. Ulteriori esperimenti potrebbero includere il test dell'attività antivirale del composto su virus ricombinanti, con mutazioni sugli amminoacidi scoperti per convalidarne l'importanza per l'efficacia del farmaco.
