Implementiamo microCT con acido fosfotungstico per migliorare il contrasto dei tessuti molli nell'indagine non invasiva del legamento umano di mantenimento dell'orbicularis, una struttura delicata all'interno dell'area dell'orbita. Questo protocollo è stato ottimizzato per aiutare i ricercatori nello studio non invasivo dei tessuti molli umani ed è semplice da eseguire con una ragionevole quantità di spesa. Per ottenere i campioni, utilizzare prima una matita colorata per indicare l'area di taglio sulla pelle per la raccolta del campione.
Conferma che la linea marcata si estende medialmente fino a un campus mediale, lateralmente a un campus laterale, in modo superiore a un bordo superiore della palpebra inferiore e inferiore a un centimetro sotto la linea dal bordo orbitale. Successivamente, utilizzare una lama per tagliare i tessuti facciali lungo la linea contrassegnata, assicurandosi che il taglio sia abbastanza profondo da far toccare l'osso alla punta della lama. Il campione raccolto deve includere la pelle, il tessuto sottocutaneo, il muscolo, il grasso e il periosteo.
Al momento della raccolta, fissare immediatamente il campione in formalina al 10% per cinque-sette giorni a temperatura ambiente. Alla fine del periodo di fissazione, affettare il campione in tre pezzi spessi da cinque a sette millimetri. Utilizzare un ago e un filo nero per cucire il lato superolaterale di ogni campione in modo che la direzione del campione possa essere determinata in punti temporali successivi.
Disidratare il campione in una serie crescente di concentrazione di etanolo per un giorno per concentrazione, lasciando i campioni nella soluzione di etanolo al 70% fino a quando non vengono macchiati. Una settimana prima che sia programmata la scansione della tomografia del microcomputer, aggiungere 2,1 grammi di PTA a 210 millilitri di etanolo al 70% e posizionare la soluzione su uno shaker a 55-60 rotazioni al minuto. Preparare tre contenitori di plastica da 70 millilitri per ogni pezzo affettato.
Quando il colorante si è sciolto nella soluzione alcolica, riempire i contenitori con la soluzione. Posizionare un campione in ogni contenitore di 1%PTA e agitare i campioni a 55-60 rotazioni al minuto per cinque o sette giorni. Al termine della colorazione, conservare i campioni in etanolo fresco al 70% per una settimana per prepararsi alla scansione.
Per la scansione microCT, avvolgere i campioni in Parafilm per evitare l'asciugatura e posizionare un campione sul vassoio dello scanner. Impostare la tensione di sorgente dello scanner su 70 kilovolt, la corrente di sorgente a 114 microarti, il filtro in alluminio a 0,5 millimetri, la dimensione del pixel dell'immagine a 20 micrometri quadrati, i pixel a 2.240 per 2,240, l'esposizione a 500 millisecondi e il passaggio di rotazione a 0,3 gradi. Quindi, avviare la scansione.
Al termine dell'analisi, aprire il software di ricostruzione e selezionare Azioni e Apri Set di dati per avviare i file analizzati. Selezionate la scheda Impostazioni (Settings) e impostate la riduzione degli artefatti dell'anello su sette e la correzione di indurimento del fascio. Per iniziare la ricostruzione, selezionare Avvia.
I dati finali saranno memorizzati nella cartella designata. Al termine della ricostruzione, aprire il software di ridimensionamento dei file e selezionare Origine set di dati per avviare i file ricostruiti. Selezionare jpg nella scheda Set di dati di destinazione e selezionare l'opzione Ridimensionamento 1/2 con l'opzione Qualità senza interpolazione Quindi regolare la barra delle diapositive su 100 nella scheda Compressione immagine e avviare la conversione.
Per la ricostruzione 3D, aprire il software di rendering del volume 3D e selezionare Azioni e Carica dati volume. Per regolare la luminosità e il livello di contrasto, modificare la funzione di trasferimento della forma nell'istogramma della scheda Editor funzioni di trasferimento. Selezionate Opzioni (Options) e Illuminazione (Lighting) e selezionate le icone Ombre (Shadows) e Illuminazione superficie (Surface Lighting) per ottenere un tono di modellazione realistico.
Fare clic e trascinare, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e trascinare per spostare e ruotare l'immagine 3D per trovare la visualizzazione migliore, scorrendo per ingrandire o ridurre come desiderato. Fare clic su Maiusc e trascinare per scorrere la posizione per visualizzare le immagini sezionali. Attivare l'icona Luce e regolare la barra di indicazione dell'illuminazione per trovare l'illuminazione migliore per la visualizzazione, quindi disattivare l'icona Luce e chiudere la scheda Illuminazione.
Nella scheda Opzioni selezionare Mostra e ritaglia casella per nascondere la casella per l'immagine finale. Quindi, selezionare Azioni e Salva immagine per archiviare l'immagine. Questa ricostruzione dettagliata dell'ORL è stata ottenuta con microCT con preparazione PTA come dimostrato, consentendo la visualizzazione di una struttura fibromuscolare legamentosa che si estende obliquamente tra il derma e il periostio.
Nella vista coronale, la quantità e la complessità delle fibre aumenta lateralmente. In vista orizzontale, si osserva un'elaborata meshwork con una formazione arborizzata. Nella vista sagittale, gli spessori delle fibre ORL diminuiscono in modo inferiore.
Nel complesso, questa osservazione multidirezionale dimostra che l'ORL è costituito da una rete multistrato di piastre continue con variazioni nel numero e nello spessore delle fibre a seconda della loro posizione. Quando la durata della colorazione è insufficiente rispetto al volume di un campione, l'immagine finale può includere un foro vuoto nell'area centrale del campione. Altri agenti oltre alla PTA possono essere utilizzati e diversi agenti hanno diversi meriti o interessi di colorazione delle caratteristiche.
Pertanto, è utile ottimizzare la regione di colorazione in base all'esperimento.
