I protocolli qui presentati sono stati ottimizzati per la cultura 3D e consentono un'indagine efficiente e conveniente dei processi associati alla crescita, alla proliferazione e alla morte delle cellule tumorali in un ambiente 3D. I principali vantaggi dell'utilizzo della coltura 3D sono che sono una possibilità unica per ricapitolare aspetti chiave del microambiente tumorale in vitro. Lo sferoide 3D è uno strumento importante per lo screening dei farmaci antitumorali, che viene sempre più utilizzato per migliorare la traduzione tra condizioni in vitro e in vivo nella ricerca sulla terapia del cancro.
Alcuni protocolli richiedono una certa quantità di pratica e abilità. Ciò vale in particolare per la produzione di sferoidi con il metodo della goccia a mano e per l'incorporamento di sferoidi per l'immunoistochimica. Poiché gli elementi chiave di queste procedure sono difficili da descrivere per iscritto, come come inserire gli sferoidi in una goccia di agarosio, la dimostrazione visiva aiuterà i ricercatori a eseguire queste procedure.
Diluire la sospensione cellulare preparata in un tubo da 15 millilitri per ottenere la densità cellulare ottimale. Trasferire la sospensione cellulare diluita in un serbatoio sterile e utilizzare una pipetta multicanale per erogare 200 microlitri nella piastra preparata in precedenza. Incubare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica e 95% di umidità.
Ogni due o tre giorni, acquisire immagini microscopiche leggere degli sferoidi. Dopo aver acquisito le immagini, rimuovere 100 microlitri del mezzo speso da ogni pozzo e sostituirlo con 100 microlitri di mezzo fresco. In primo luogo, scongelare la membrana basale ricostituita sul ghiaccio.
Tenere tutte le piastre e i serbatoi avvolti singolarmente sul ghiaccio prima dell'uso. Successivamente, diluire la sospensione cellulare preparata in un tubo da 15 millilitri per ottenere la densità cellulare ottimale. Posizionare il tubo contenente la sospensione cellulare diluita sul ghiaccio.
Riempire i contenitori di plastica con ghiaccio e trasferirli nel cappuccio. Trasferire le piastre e i serbatoi refrigerati in una cappa di coltura cellulare. Riposizionare le piastre e i serbatoi sul ghiaccio.
Riutilizzare delicatamente il rBM per garantire un gel omogeneo. Aggiungere la concentrazione ottimale del rBM alle sospensioni a celle refrigerate. Invertire il tubo per assicurarsi che il rBM e la sospensione cellulare siano miscelati correttamente.
Quindi, trasferire questa miscela in un serbatoio sterile e utilizzare una pipetta multicanale per erogare 200 microlitri in ogni pozzo di una piastra refrigerata, ultra-a basso attacco e 96 pota. Centrifugare la piastra a 750 volte g per 15 minuti per assicurarsi che le cellule siano raggruppate insieme quando il rBM si indurisce. Utilizzare la discesa morbida della centrifuga o la funzione di frenata minima.
In primo luogo, aggiungere sei millilitri di PBS a un piatto di coltura cellulare. Diluire la sospensione cellulare preparata per ottenere un'adeguata diluizione. Una diluizione pratica è di 50.000 cellule per millilitro.
Versare la sospensione cellulare in un serbatoio sterile e utilizzare una pipetta multicanale per posizionare con cura fino a 30 gocce di sospensione nel coperchio del piatto di coltura cellulare, con conseguente concentrazione di 2000 cellule per goccia. In un movimento rapido ma controllato, invertire il coperchio e posizionarlo sopra il piatto di coltura cellulare contenente PBS. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% e umidità del 95% per quattro o sei giorni.
Se gli sferoidi devono essere utilizzati per lisati proteici o incorporamento, tirarli rimuovendo il coperchio, inclinandolo e quindi lavando le gocce con un millilitro di mezzi riscaldati. Trasferire il mezzo contenente sferoide risultante in un tubo da 1,5 millilitri. Lasciare che lo sferoide si sistemi sul fondo del tubo prima di procedere con i lire proteiche o incorporarsi.
Tagliare l'estremità di una punta della pipetta P200 per catturare più facilmente gli sferoidi senza disturbarne la struttura. Per ogni condizione, tirare un minimo di 12 ma idealmente tra 18 e 24 sferoidi in un tubo da 1,5 millilitri. Posizionare i tubi sul ghiaccio e lasciare che gli sferoidi si sistemino sul fondo.
Quindi, passare dal laboratorio di cellule sterili al laboratorio regolare. Lavare gli sferoidi due volte in un millilitro di freddo ghiaccio X PBS, assicurandosi di lasciare che gli sferoidi si sistemino prima di rimuovere il PBS tra ogni fase di lavaggio. Quindi, aspirare il più PBS possibile senza disturbare o rimuovere gli sferoidi.
Aggiungere cinque microlitri di tampone dilisi riscaldata con fosfatasi e inibitori della proteasi per sferoide. Vortice gli sferoidi per 30 secondi e quindi eseguire una rapida centrifugazione per 10 secondi. Ripetere questi intervalli di vortice e centrifugazione per cinque-10 minuti, o fino a quando gli sferoidi non vengono sciolti.
Dopo aver preparato la soluzione PI, rimuovere 100 microlitri di mezzo da ogni pozzo nella piastra da 96 po ', assicurandosi di non rimuovere gli sferoidi. Aggiungere 100 microlitri di un X PBS riscaldato ad ogni pozzo, seguito dalla rimozione di 100 microlitri di liquido dai pozzi. Ripetere questo passaggio di lavaggio tre volte per lavare via qualsiasi mezzo rimanente.
Aggiungere quindi 100 microlitri della soluzione PI a ciascun pozzo. Coprire la piastra in foglio di alluminio e incubare per 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica e 95% di umidità per 10-15 minuti. Successivamente, ripetere il processo di lavaggio con un X PBS riscaldato tre volte, come descritto in precedenza, per lavare la soluzione PI e diminuire il segnale di fondo durante l'imaging.
Usando un microscopio a epifluorescenza, immagini gli sferoidi. All'interno del software di imaging, aprire il menu multicanale. Impostare il tempo di esposizione per i canali pertinenti e premere Impostazioni di lettura dopo aver regolato ogni canale.
Aprite il menu Z-stack e definite l'inizio e la fine regolando lo stato attivo dell'immagine. Inizialmente avere lo sferoide fuori fuoco, quindi spostare il punto focale attraverso l'intero sferoide fino a quando l'immagine diventa ancora una volta sfocata. Quindi regolare la dimensione del passo in modo che sia compresa tra 18 e 35 micrometri e premere Start.
Per iniziare, fissare gli sferoidi in una cappa aspirante il primo giorno come delineato nel protocollo di testo. Il secondo giorno, metti il gel di agarosio in un becher pieno d'acqua in un forno a microonde per riscaldarlo e mantenere il gel caldo su una piastra riscaldante da banco impostata a 60 gradi Celsius, fino a quando necessario. Lavare gli sferoidi due volte nella cappa dei fumi utilizzando un millilitro di freddo ghiaccio di un X PBS per lavaggio.
Quindi, aspirare la maggior parte del PBS. Preparare una punta di pipetta da 20 microliter tagliarla in pendenza per ottenere una punta più appuntita con un foro più grande. Dopo questo, fai una goccia di gel di agarosio su uno scivolo al microscopio.
Posizionare lo scivolo su un blocco riscaldante caldo per evitare che l'agarosio si solidifica. Utilizzando la punta della pipetta modificata, catturare il maggior numero possibile di sferoidi in un volume da 15 a 20 microlitri. Iniettare con cura gli sferoidi al centro della goccia di gel di agarosio, assicurandosi di non toccare lo scivolo del microscopio.
Incubare a temperatura ambiente o a quattro gradi per cinque-10 minuti per lasciare che il gel di agarosio si indurisca. Quando la goccia di gel si è in qualche modo solidificata, ma è ancora piuttosto morbida, usa un bisturi per spingerlo con cura dallo scivolo del microscopio in una cassetta di tessuto plastico. Trasferire la cassetta di tessuto in un becher riempito con etanolo e conservare a temperatura ambiente.
In questo studio, vengono presentati una serie di metodi per l'analisi dei cambiamenti indotti dal trattamento anti-cancro nella vitalità delle cellule tumorali e nella morte nella coltura 3D. La concentrazione di rBM aggiunta può influenzare profondamente la morfologia degli sferoidi. L'aggiunta fino al 2,5% di rBM consente la formazione di sferoidi nelle cellule tumorali del seno SKBr-3, senza ulteriori effetti a concentrazioni più elevate.
Al contrario, le cellule tumorali pancreatiche BxPC-3 formano spontaneamente piccoli sferoidi compatti. In questo tipo di cellule, l'aumento del rBM all'1,5% o superiore provoca un netto cambiamento morfologico da sferoide a strutture più contorte con sporgenze e invaginazioni. Un esempio dell'uso di colture sferoidi per lo screening dell'efficacia della chemioterapia è mostrato qui.
Le immagini del microscopio luminoso vengono acquisite ogni due o tre giorni durante un esperimento di risposta alla dose eseguito per determinare la dose necessaria per una vitalità ridotta del 50% nelle cellule tumorali del seno MDA-MB-231. La disposizione spaziale delle cellule morte su una crescente concentrazione di un inibitore può essere vista usando la colorazione PI. Come visto, gli sferoidi di controllo mostrano un nucleo necrotico e tardo apoptotico limitato, mentre le cellule morte sono distribuite in tutto lo sferoide man mano che la concentrazione di inibitore aumenta.
La tecnica dello sferoide mostrata qui può essere applicata a molti altri saggi, come l'invasione 3D, la migrazione o l'analisi microforetica. È applicabile anche alle co-colture con fibroblasti, adipociti o cellule immunitarie, che possono fornire informazioni importanti sulle interazioni cellulari nel microambiente tumorale. Lo sviluppo di questa tecnica è stato molto importante per chiarire il ruolo del microambiente tumorale in numerosi aspetti dello sviluppo del cancro, tra cui l'espressione genica, l'invasione e l'assistenza al trattamento.
