Isolamento e cultura delle cellule endoteliali aortiche primarie dai suini in miniatura

Il metodo è un metodo altamente efficace per isolare le cellule endoteliali dal maiale in miniatura. E anche le cellule possono essere espanse, indagare la risposta immunitaria e coagulazione nello xenotrapianto. Il principale vantaggio della tecnica è che non è solo facile, altamente efficace isolare le cellule di endotelio altamente purificate dal maiale, ma anche meglio per mantenere altri pAEC quando vengono passaggi.

Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del dolore nel maiale anestetizzato, lavare la parete addominale suina tre volte con il 75% di alcol medico e una tintura di iodio. Dopo l'ultimo lavaggio, usa un bisturi per fare un'incisione addominale per esporre la vena cava inferiore e usa una siringa da cinque millilitri per iniettare 5000 unità di sodio eparina nella vena cava inferiore. Dopo cinque minuti, inserire un catetere nell'aorta addominale e utilizzare un bisturi per incidere il diaframma.

Con l'aiuto di un secondo investigatore, rimuovere il ventricolo sinistro e usare le forze ossee per asportare le costole per esporre il cuore e i polmoni. Individuare l'aorta posteriore al cuore e ai polmoni e bloccare le estremità. Usa le forbici per asportare l'aorta e lavala una volta con un tampone di lavaggio pre-raffreddato.

Rimuovere il tessuto in eccesso intorno all'aorta con forcelle e forbici sterili e posizionare il recipiente in un tubo di centrifuga da 50 millilitri contenente tampone di lavaggio fresco pre-raffreddato per il trasferimento in laboratorio. Per l'isolamento delle cellule endoteliali aortiche suine, trasferire l'aorta suina in una piastra di Petri di 150 millimetri in condizioni asettiche e rimuovere delicatamente entrambe le estremità del vaso. Tagliare qualsiasi tessuto in eccesso aggiuntivo in cui il recipiente era stato bloccato, con pinze e forbici sterili, e utilizzare da 20 a 50 millilitri di tampone di lavaggio fresco per risciacquare l'esterno e l'interno dell'aorta.

Successivamente, passare una sutura chirurgica attraverso l'aorta e legare liberamente un'estremità del vaso, mantenendo la sutura all'interno del lume. Fissare delicatamente l'aorta vicino all'estremità legata con le forcep e quindi tirare lentamente la sutura chirurgica, per invertire l'aorta, fino a quando la superficie endoteliale dell'aorta è esposta. Lavare la superficie endoteliale dell'aorta tre volte con 10 millilitri di tampone di lavaggio fresco per lavaggio e posizionare l'aorta in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.

Coprire il campione con 10 millilitri di 37 gradi Celsius riscaldati 0,005%collagenasi IV soluzione digestiva e incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Alla fine dell'incubazione, trasferire l'intero contenuto del tubo in un piatto di coltura da 100 millimetri e arrestare la digestione con da 10 a 15 millilitri di tampone di arresto pre-raffreddato. Utilizzando un raschietto cellulare, rimuovere delicatamente le cellule endoteliali aortiche dalla superficie interna del vaso e lavare il vaso tre volte con cinque millilitri di tampone di lavaggio per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il supernatante in un tubo di centrifuga da 50 millilitri e lavare il fondo del piatto di coltura due volte con cinque millilitri di tampone di lavaggio fresco, per lavaggio, tirando i lavaggi nel tubo da 50 millilitri. Raccogliere le cellule per centrifugazione e scartare tutti tranne gli ultimi 10 millilitri di supernatante. Aggiungere 20 millilitri di tampone di lavaggio per rimospendare il pellet, facendo attenzione a evitare bolle e raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione.

Rimostrare il pellet in un millilitro di mezzo di coltura cellulare per il conteggio e placcare le cellule a una volta per dieci alle sei cellule per 25 centimetri di concentrazione quadrata di pallone. Quindi posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%, rinfrescando il mezzo ogni due o tre giorni. Dopo l'isolamento, le cellule endoteliali vengono ispezionate il giorno zero, uno e due, e dopo i passaggi uno e due per la contaminazione e la loro valutazione morfologica.

L'analisi citometrica del flusso utilizzando un anticorpo anti-CD31-FITC indica una popolazione positiva tipicamente superiore al 97% del marcatore cellulare endoteliale il terzo giorno di coltura, che viene mantenuta a una purezza superiore al 90% anche dopo due passaggi. La superficie endoteliale dell'aorta è stata raschiata in una sola direzione, con un raschietto cellulare, per meno di 10 volte, e non è stata compressa durante il processo di raschiatura. La migliore risposta, metodo ottimizzato di isolamento dei PAEC, possiamo utilizzare pAEC purificati per eseguire singoli esperimenti e indagare il rifiuto immunitario e la risposta alla coagulazione nello xenotrapianto.