عزل وثقافة الخلايا البطانية الأبهرية الأولية من الخنازير المصغرة

هذه الطريقة هي طريقة فعالة للغاية لعزل الخلايا البطانية من الخنزير المصغر. ويمكن توسيع الخلايا أيضا، والتحقيق في استجابة المناعة والتخثر في xenotransplantation. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه ليس من السهل فقط، فعالة للغاية لعزل خلايا بطانة endothelium تنقية للغاية من خنزير، ولكن أيضا أفضل للحفاظ على pAECs الأخرى عند مرور.

بعد التأكد من عدم الاستجابة لاعكاس الألم في الخنزير المُجَنَّد، اغسل جدار البطن المساميني ثلاث مرات مع 75٪ من الكحول الطبي، وصبغة واحدة من اليود. بعد الغسيل الأخير، استخدم مشرطًا لإجراء شق في البطن لفضح الوريد الأجوف السفلي، واستخدم حقنة خمسة ملليلتر لحقن 5000 وحدة من الصوديوم الهيبارين في الوريد السفلي. بعد خمس دقائق، أدخل قسطرة في الشريان الأورطي في البطن، واستخدم مشرطًا لتجزئة الحجاب الحاجز.

بمساعدة محقق ثان، قم بإزالة البطين الأيسر واستخدم ملقط العظام لإخراج الأضلاع لفضح القلب والرئتين. حدد موقع الشريان الأبهر الخلفي للقلب والرئتين، ومشبك نهايات. استخدام مقص لإخراج الشريان الأورطي، وغسلها مرة واحدة مع العازلة الغسيل قبل تبريد.

إزالة أي الأنسجة الزائدة حول الشريان الأورطي مع ملقط معقمة ومقص، ووضع السفينة في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر تحتوي على عازلة الغسيل قبل التبريد الطازجة لنقلها إلى المختبر. لعزل الخلايا البطانية الأبهري بورسين الأبهر، نقل الشريان الأورطي الخنزير في طبق بتري 150 ملليمتر في ظل ظروف معقمة، وإزالة بلطف طرفي السفينة. تقليم أي الأنسجة الزائدة الإضافية حيث تم تثبيت السفينة، مع ملقط معقمة ومقص، واستخدام 20 إلى 50 ملليلتر من عازلة الغسيل الطازجة لشطف خارج وداخل الشريان الأورطي.

المقبل، تمرير خياطة الجراحية من خلال الشريان الأورطي، وربطة عنق فضفاضة واحدة من نهاية السفينة، والحفاظ على خياطة داخل تجويف. إصلاح بلطف الشريان الأورطي بالقرب من نهاية تعادل مع ملقط ثم سحب خياطة الجراحية ببطء, لعكس الشريان الأورطي, حتى يتعرض السطح endothelial من الشريان الأورطي. اغسل السطح البطانية للوعاء ثلاث مرات مع 10 ملليلترات من الغسيل العازل الطازج لكل غسل، ووضع الشريان الأورطي في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر.

تغطية العينة مع 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية الدفء 0.005٪ الكولاجينازل الرابع، واحتضان الأنسجة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. في نهاية الحضانة، نقل محتويات الأنبوب بأكملها إلى طبق ثقافة 100 ملليمتر، ووقف الهضم مع 10 إلى 15 ملليلتر من العازل وقف ما قبل التبريد. باستخدام مكشطة الخلية، قم بإزالة الخلايا البطانية الأبهرية بلطف من السطح الداخلي للسفينة، وغسل الوعاء ثلاث مرات بخمسة ملليلترات من الغسيل العازلة لكل غسل.

بعد الغسيل الأخير، نقل المابير في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر، وغسل الجزء السفلي من طبق الثقافة مرتين مع خمسة ملليلتر من العازلة الغسيل الطازجة، في غسل، وسحب يغسل في أنبوب 50 ملليلتر. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وتجاهل جميع ما عدا آخر 10 ملليلتر من عظمى. إضافة 20 ملليلتر من العازلة الغسيل لإعادة تعليق بيليه، مع الحرص على تجنب فقاعات، وجمع الخلايا مع طرد مركز آخر.

resuspend بيليه في ملليلتر واحد من خلية ثقافة المتوسطة للعد، وطبق الخلايا في واحد مرات عشرة إلى الخلايا الست لكل 25 سنتيمترا مربعا تركيز قارورة. ثم ضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون، منعشة المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام. بعد العزل، يتم فحص الخلايا البطانية في اليوم صفر، واحد، واثنين، وبعد مرور واحد واثنين للتلوث وتقييمهم المورفولوجي.

تدفق تحليل cytometric باستخدام المضادة لC31-FITC الأجسام المضادة يشير عادة أكبر من 97٪ علامة الخلايا endothelial السكان إيجابية في اليوم الثالث من الثقافة, التي يتم الحفاظ عليها في أكثر من 90٪ نقاء حتى بعد مرورين. تم كشط السطح البطاخلي من الشريان الأورطي في اتجاه واحد فقط ، مع مكشطة الخلية ، لأقل من 10 مرات ، ولم يتم ضغطه أثناء عملية الكشط. أفضل إجابة، طريقة محسنة لعزلة pAECs، يمكننا استخدام pAECs المنقى لإجراء تجارب فردية والتحقيق في الرفض المناعي واستجابة التخثر في xenotransplantation.