Questo protocollo consente la visualizzazione dell'infezione da virus e fornisce approfondimenti approfonditi sulla risoluzione spaziotemporale dell'ambiente di infezione e sul contesto cellulare circostante. L'applicabilità dell'immunosocienza relativa all'imaging dei tessuti profondi non solo consente il rilevamento di virus, ma di fatto consente anche la differenziazione di varie sottopopolazioni cellulari utilizzando i rispettivi marcatori cellulari. Per fissare il tessuto per l'immunostaining posizionare i campioni cerebrali in un rapporto uno-10 del 4% di paraformaldeide in PBS per campionare il volume del tessuto per almeno 48 ore a quattro gradi Celsius.
Al termine del periodo di fissazione lavare i campioni di tessuto tre volte in PBS per almeno 30 minuti per lavaggio prima di trasferire i campioni in azide di sodio al 02% in PBS a quattro gradi Celsius. Quindi utilizzare un vibratomo impostato su una velocità di avanzamento della lama da 0,3 a 0,5 millimetri al secondo per sessare i tessuti in sezioni spesse da un millimetro. Conservare le sezioni in azide fresco allo 02% di sodio in PBS a quattro gradi Celsius.
Per il pretrattamento del metanolo immergere i campioni in una serie crescente di metanolo come indicato per un'ora per incubazione a temperatura ambiente con oscillazione delicata. Dopo l'ultima incubazione raffreddare i campioni a quattro gradi Celsius. Sostituire il metanolo al 100% con quattro millilitri di soluzione di sbiancamento pre-refrigerato per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius.
La mattina successiva sostituire la soluzione di sbiancamento con quattro millilitri di metanolo fresco all'80% per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Quindi immergere i campioni in una serie decrescente di metanolo al contrario di quanto appena dimostrato, lavando i campioni una volta per un'ora in quattro millilitri di PBS dopo l'immersione del 20% di metanolo. Per l'immunostaining delle sezioni del tessuto cerebrale lavare i campioni due volte per un'ora in quattro millilitri dello 0,2%Triton X-100 in PBS, seguito da permeabilizzazione per due giorni a 37 gradi Celsius in quattro millilitri dello 0,2%Tritone X-100, 20% di solfossido di dimetile e 0,3 glicina molare in PBS.
Bloccare qualsiasi legame non specifico con quattro millilitri dello 0,2%Triton X-100, del 10% di solfossido di dimetile e del 6% di siero normale in PBS per due giorni a 37 gradi Celsius. Al termine dell'etichetta di incubazione di blocco i campioni con due millilitri di soluzione anticorpale primaria per cinque giorni a 37 gradi Celsius, rinfrescando la soluzione anticorpale dopo due e 1/2 giorni. Successivamente, lavare i campioni per un giorno in quattro millilitri dello 0,2% Tra 20 e 10 microgrammi per millilitro eparina in PBS scambiando il tampone di lavaggio almeno quattro o cinque volte nel corso della giornata e lasciando il lavaggio finale durante la notte.
Il giorno dopo, incubare i campioni in due millilitri di soluzione anticorpale secondaria per cinque giorni a 37 gradi Celsius. Lavare quindi i campioni in quattro millilitri di fresco 0,2% Tra 20 e 10 microgrammi per millilitro eparina in PBS, come dimostrato. Per la colorazione nucleare dei campioni incubare i campioni in quattro millilitri della macchia di acido nucleico TO-PRO-3 per cinque ore protetti dalla luce.
Al termine dell'incubazione lavare i campioni allo 0,2% tra 20 e 10 microgrammi per millilitro di eparina in PBS, come dimostrato, seguito dalla disidratazione in una serie ascendente di tert-butanolo per due ore per immersione. Dopo l'immersione del 90% trasferire i campioni in una soluzione 96%tert-butanol durante la notte. La mattina seguente, disidratare ulteriormente i campioni nel 100%tert-butanolo per due ore prima di pulire le sezioni di tessuto in BABB-D15 appena preparato per due o sei ore fino a quando non sono otticamente trasparenti.
I campioni possono quindi essere conservati in BABB-D15 protetti dalla luce fino al loro montaggio e imaging. Per il montaggio del campione utilizzare una stampante 3D per stampare una camera di imaging e un coperchio. Montare un coverslip di 30 millimetri di diametro sulla camera di imaging con gomma siliconica vulcanizzante a temperatura ambiente un componente.
Allo stesso modo, montare un coverslip di 22 millimetri sul coperchio. Utilizzare un batuffolo di cotone bagnato dall'acqua per rimuovere l'eccesso di gomma siliconica su entrambi gli anelli prima di lasciare che la gomma si polimerizza durante la notte. Il giorno successivo, posizionare un campione nella camera di imaging e aggiungere un piccolo volume di BABB-D15 alla camera prima di inserire il coperchio.
Utilizzando un ago ipodermico riempire la camera con BABB-D15 attraverso l'ingresso e collegare l'ingresso prima di sigillare la camera di imaging con gomma siliconica. Per impostare l'acquisizione dell'immagine, selezionare le linee laser appropriate per i fluorofori utilizzati e regolare gli intervalli di rilevamento di ciascun rilevatore per evitare la sovrapposizione del segnale tra i canali. Quindi impostare i parametri di acquisizione per trovare il bordo superiore e inferiore dello stack Z e acquisire lo stack di immagini.
Per generare proiezioni 3D dello stack di immagini, aprite i file di immagine nelle Fiji e selezionate Image Color Channels Tool More e Split Channels per dividere le immagini unite in singoli canali. Per la correzione della candeggina delle immagini, per ogni canale selezionare Regola immagine correzione candeggina e selezionare Rapporto semplice. Usare i dispositivi di scorrimento per regolare la luminosità e il contrasto per ogni canale e selezionare Colore immagine e Unisci canali.
Selezionare l'opzione Crea composito. Converti l'immagine in formato RGB e seleziona Stack di immagini e Progetto 3D per generare una proiezione 3D. Selezionate Punto più luminoso (Brightest Point) come metodo di proiezione e impostate la spaziatura delle sezioni in modo che corrisponda alle dimensioni del passo Z dello stack di immagini acquisito.
Per una qualità massima, impostate l'incremento dell'angolo di rotazione su uno e attivate l'interpolazione. Modificate la rotazione totale, le soglie di trasparenza e l'opacità in base alle esigenze. Quindi salva la proiezione 3D sia come formati di file tiff che AVI.
Utilizzando l'immunostaining del virus della rabbia, strati complessi di fosfoproteina di cellule neuronali infette possono essere visualizzati in sezioni spesse di campioni di tessuto cerebrale del topo. Successivamente, è possibile ricostruire proiezioni 3D senza soluzione di continuità degli stack di immagini acquisiti. A causa dell'alta risoluzione con cui vengono acquisiti gli stack di immagini, l'infezione può essere valutata fino a un singolo livello cellulare, consentendo asserzioni sull'abbondanza e la distribuzione dell'antigene all'interno di una cellula di interesse.
Oltre al tessuto cerebrale del topo, il protocollo può essere applicato a campioni di tessuto cerebrale di altre specie animali. Ad esempio, sezioni ottenute da diversi compartimenti di un cervello di furetto infetto rivelano un diverso grado di infezione da virus della rabbia. Gli astrociti possono essere differenziati attraverso l'espressione della proteina dell'acido fibrillare gliale mentre le neuriti possono essere specificamente macchiate per la proteina associata ai microtubuli II.Contemporaneamente, le proteine virali possono essere co-macchiate per valutare la relazione tra le cellule infette e la sottopopolazione cellulare evidenziata.
Per l'immunosottenzione è fondamentale la scelta degli anticorpi per rilevare le proteine di interesse. Mentre le concentrazioni standard di immunoistochimica sono spesso un buon punto di partenza, alcuni anticorpi potrebbero aver bisogno di ulteriori regolazioni. Molte delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo hanno proprietà dannose.
Condurre il rispettivo esperimento in una cappa aspirante con adeguati dispositivi di protezione individuale, tra cui un camice da laboratorio e guanti.
