I recettori P2X7 sono estremamente versatili e funzionano in modo diverso a seconda della quantità di agonista presente. In questo modo, P2X7 ha diverse funzioni e può regolare la fisiologia di molti sistemi diversi. Questo protocollo consente di investigazione delle tre principali funzioni del recettore P2X7.
È un metodo rapido, riproducibile e quantificabile per comprenderne la funzione. Ci concentriamo su come i recettori P2X7 possono modulare nelle cellule progenitrici neurali. Tuttavia, questo metodo può essere facilmente adattato a qualsiasi tipo di cella.
Gli studenti che hanno letto abbastanza letteratura prima di provare questa procedura possono imparare che in un solo giorno ed essere in grado di eseguire tutto da soli dopo due o tre tentativi. Inizia questa procedura ottenendo cellule progenitrici neurali dalla zona subventricolare e dall'ippocampo dei topi adulti come descritto nel protocollo di testo. Mantenere le colture a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.
Le neurosfere dovrebbero formarsi dopo sette o dieci giorni è il passaggio zero cultura della zona subventricolare e dopo 15-20 giorni nella cultura ippocampale. Dopo la fase iniziale di coltura zero passaggio, passare ogni sette-10 giorni se necessario utilizzando un armadietto di sicurezza biologico e pratiche standard di coltura tissutale. Passare le sfere quando raggiungono i 150-200 micron di diametro.
Raccogliere le sfere e il mezzo in un tubo da 15 millilitri e girare a bassa velocità per due minuti. Rimuovere il mezzo e incubare le cellule con reagente di dissociazione per sette-10 minuti a 37 gradi Celsius a seconda delle dimensioni delle sfere. Infine, contare le cellule usando un emocitometro o un contatore automatico delle celle.
Sospendiamo le singole cellule in un millilitro di mezzo di sodio privo di calcio. Quindi caricare le cellule con due ninigrammi per millilitro di colorante per indicatori di calcio e 10 microlitri di acido pluronico al 5%. Incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Lavare le cellule aggiungendo da tre a cinque millilitri di mezzo di sodio privo di calcio e centrifugando delicatamente. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in mezzo di sodio privo di calcio, lavandosi una seconda volta. Sospendere di nuovo le cellule in un millilitro di mezzo di sodio privo di calcio.
Quindi posizionare le cellule sul ghiaccio e consentire loro di de-esterificarsi per 30 minuti. Lavare ancora una volta le cellule aggiungendo da tre a cinque millilitri di mezzo di potassio e centrifugando come prima. Dopo aver sospeso di nuovo le cellule in mezzo al potassio, eliquatle in tubi di cernita cellulare attivati a fluorescenza o in tubi FACS ad una concentrazione di un milione di cellule per 500 microlitri per tubo FACS.
Posizionare i tubi FACS sul ghiaccio fino a quando le cellule non sono pronte per essere analizzate. Non lasciare le cellule sul ghiaccio per un lungo periodo, ma iniziare il saggio il prima possibile. Per alcuni campioni, pre-incubare le cellule con inibitore specifico del recettore P2X7 come descritto nel protocollo di testo.
Pochi minuti prima di eseguire il primo campione, aggiungere cloruro di calcio a una concentrazione finale di un millimolare e posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per recuperare. Far cadere un piccolo agitatore magnetico pulito nel tubo FACS e posizionare il tubo nel modulo di tempo collegato a un bagno d'acqua circolante di 37 gradi Celsius per controllare la temperatura del campione. Selezionare una bassa velocità di agitazione per garantire il movimento del campione senza introdurre un effetto vortice.
Posizionare la brocca d'acqua e l'adattatore per tubi sulla piattaforma del campione e chiudere il braccio leva della macchina FACS. Avviare l'acquisizione del campione ed eseguire l'esempio per tre minuti a circa 1.000 eventi al secondo. Al segno di 40 secondi, rimuovere rapidamente il tubo e aggiungere l'agonista P2X7.
Un ATP millimolare o un BzATP micromolare da 300 micromolari. Quindi sostituire il tubo per continuare l'acquisizione. Durante la registrazione del primo campione, preparare il secondo campione con cloruro di calcio.
Posizionarlo in 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di riscaldarsi prima dell'analisi. Una volta terminato il primo campione, pulire l'assunzione facendo funzionare un campione d'acqua. Quindi l'acquisizione del secondo campione può iniziare come prima.
Pulire sempre l'assunzione tra i campioni. Creare una sospensione a cella singola come prima e salvare alcuni millilitri del mezzo condizionato. Utilizzare il mezzo per sospendere di nuovo le cellule a una concentrazione di un milione di cellule per 100 microlitri per tubo FACS e posizionare le cellule sul ghiaccio fino a quando non sono pronte.
Prima di eseguire il saggio, aggiungere 900 microlitri di mezzo di potassio per un volume finale di un millilitro. Posizionare i tubi in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 10 minuti per recuperare. Se applicabile, pre-incubare le cellule con trattamenti tra cui gli inibitori specifici del P2X7.
Immediatamente prima di eseguire il saggio, aggiungere 25 bromuro di etidio micromolare al tubo FACS. Quindi aggiungere l'agitatore magnetico, posizionare il tubo sulla macchina FACS e iniziare l'acquisizione come prima. Per indurre la formazione di pori nella membrana cellulare, aggiungere un ATP millimolare o 100 micromolare BzATP 40 secondi dopo l'inizio dell'acquisizione.
Esegui gli esempi a circa 1.000 eventi al secondo per sei minuti. Mentre il primo campione è in funzione, prendi il secondo campione dal ghiaccio e posizionalo nel bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di recuperare tempo sufficiente prima dell'analisi. Una volta terminata l'acquisizione del primo campione e pulita l'aspirazione, il secondo campione può essere posizionato sulla macchina per iniziare la registrazione.
Sospendiamo le singole celle in mezzo condizionato e le eliquatiamo in tubi FACS ad una concentrazione di almeno un milione di celle per 100 microlitri per tubo FACS. Diluire le cellule a una concentrazione finale di un milione di cellule per millilitro con mezzo di sodio e posizionare le cellule sul ghiaccio fino a quando non viene eseguita l'analisi. Utilizzare perline G larghe un micron come bersagli fagocitici per saggi di fagocitosi in tempo reale.
Prima di eseguire il primo campione, trasferire le cellule a un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius e incubarle per circa sette-10 minuti per consentire alle cellule di riprendersi. Aggiungere tutti i trattamenti che richiedono la pre-incubazione ai rispettivi tubi, tra cui ATP, ATP ossidato, citoscheletrina D e paraformaldeide al 4%. Non è richiesta alcuna pre-incubazione per il siero umano al 5%.
Se i trattamenti vengono aggiunti all'incirca nello stesso momento, i campioni possono essere eseguiti consecutivamente mentre altri continuano a incubare perché i loro tempi di incubazione variano. Posizionare il campione sul citometro con l'agitatore magnetico e avviare l'acquisizione del campione come prima. Rimuovere il tubo campione dalla macchina da 15 a 20 secondi dopo l'inizio dell'acquisizione e aggiungere cinque microlitri di perline YG non diluite.
Riportare il tubo FACS campione allo strumento e continuare l'acquisizione. Esegui gli esempi per sette-otto minuti a circa 1.000 eventi al secondo. Mentre il primo campione è in funzione, prendere il secondo campione dal ghiaccio e posizionarlo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di recuperare tempo sufficiente prima dell'analisi.
Una volta terminato il primo campione e pulita l'assunzione, iniziare l'acquisizione sul secondo campione. Quando viene tracciato nel tempo, l'afflusso di calcio era generalmente simile nelle cellule progenitrici neurali della zona ippocampale e subventricolare. Gli agonisti sono stati aggiunti al 42 ° segno.
BzATP attiva rapidamente i recettori P2X7, aprendo il canale ionico e permettendo l'afflusso di calcio che si lega a fluo-8 e fluoresci. L'applicazione ATP generalmente si traduce in un afflusso di calcio più graduale. Ha una minore affinità con P2X7 rispetto al BzATP e comporterà anche l'attivazione del recettore accoppiato alla proteina G.
In seguito all'applicazione dell'ATP e del BzATP dell'agonista, la citometria del flusso di risoluzione del tempo cattura il bromuro di etidio che entra nelle cellule attraverso i pori transmembrana in tempo reale. Questo effetto è stato attenuato dall'inibitore specifico del P2X7. I test di risposta alla concentrazione di ATP illustrano gli effetti della concentrazione agonista sulla formazione dei pori P2X7 usando il cambiamento della fluorescenza del bromuro di etidio nel tempo.
Qui la fagocitosi coinvolta nel recettore P2X7 da cellule progenitrici neurali della zona ippocampale e subventricolare è mostrata in tempo reale. I livelli di fagocitosi disinibiti delle perline di lattice YG sono stati stabiliti come controllo positivo. L'ATP inibì la fagocitosi delle perline YG nella stessa misura degli inibitori non specifici, vale a dire la fissazione della paraformaldeide e l'inibitore della polimerizzazione dell'actina citoscheletrina D.5% siero abolito tutta la fagocitosi innata.
Mantenere una popolazione cellulare sana e ridurre il tempo sul ghiaccio è vitale per ottenere risultati riproducibili. La variabilità può essere ridotta a icona utilizzando lo stesso batch di ATP per l'intero test delle celle. Il nostro risultato a tempo della citometria del flusso qui dimostrata è l'unico messaggio che può continuare a selezionare quantità per flussi e cambiamenti in una sotto-popolazione mirata.
Il metodo alternativo è un microscopio fluorescente e un lettore di piatti fluorescenti. Tuttavia, questo metodo non è in grado di misurare continuamente le modifiche fluorescenti a causa del programma di affinità fluorescente. P2X7 è unica nel suo complesso multimo modale.
Scoprire la sua espressione su una cella di interesse apre una serie di domande uniche da esplorare per gli investigatori.
