Attualmente, l'immunoistochimica viene utilizzata con frequenza crescente per identificare la presenza di specifici marcatori molecolari e i loro cambiamenti in caso di patologie, dando alla radice la possibilità di eseguire analisi quantitative. L'immunoistochimica, principalmente la tecnica dell'immunofluorescenza, viene utilizzata nel modello animale larvale e zebrafish adulto, ma poco si sa di un buon protocollo immunoistochimica standard per il pesce zebra. Qui descriviamo e illustriamo un protocollo che può essere utilizzato per studiare la conservazione evolutiva di importanti proteine nel pesce zebra adulto.
Un buon protocollo per l'immunoistochimica nel pesce zebra adulto può aiutare a essere alla base dell'utilità di questo modello animale per studiare l'espressione morfologica e la distribuzione di biomolecole altamente conservate. Questo metodo può anche aiutare ad analizzare possibili alterazioni di queste biomolecole a causa di condizioni patologiche correlate alla fisiopatologia umana. A dimostrare la procedura sarà la Dott.ssa Lea Tunisi, dottoranda del mio laboratorio.
Per iniziare questa procedura, trasferire i blocchi di tessuto congelato preparati a un criostato a meno 20 gradi Celsius. Tagliare il blocco in sezioni coronali o sagittali di 10 micrometri. Quindi, raccogliere i tessuti in sezioni seriali alternative su vetri adesivi adatti all'immunoistochimica e conservarli a meno 20 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per procedere.
In primo luogo, utilizzare una penna resistente ai solventi per delimitare l'area tissutale sullo scivolo. Risciacquare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna utilizzando tampone fosfato 0,1 molare. Successivamente, sciogliere 0,3 millilitri di Tritone X-100 in 100 millilitri di tampone fosfato 0,1 molare per preparare Triton X-100 0,3%Sciogliere lo 0,1% di siero d'asino normale in tampone fosfato contenente 0,3%Tritone X-100 per preparare la soluzione di blocco.
Incubare le sezioni con la soluzione di siero d'asino normale sciolto nel tampone di permeabilizzazione PB-Triton X-100 0,3% per 30 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare la membrana cellulare e bloccare i siti di legame non specifici. In primo luogo, sciacquare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna con tampone di fosfato molare 0,1. Aggiungere il mix di anticorpi primari diluiti in PB-T e incubare le sezioni durante la notte in una scatola umida a temperatura ambiente.
Il giorno dopo, sciacquare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna con tampone fosfato molare 0,1. Incubare sezioni a temperatura ambiente per due ore in un'apposita miscela di anticorpi secondari diluiti in PB-T. Per iniziare, sciacquare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna con tampone fosfato molare 0,1.
Sciogliere 1,5 microlitri di DAPI in tre millilitri di tampone fosfato per preparare il colorante nucleare DAPI. Controsostenere le sezioni nel colorante. Quindi, utilizzare il supporto di montaggio per ricollare le diapositive per stabilizzare il tessuto e la macchia per un uso a lungo termine.
I campioni fluorescenti possono essere conservati al buio a quattro gradi Celsius. Ripetere il protocollo di immunofluorescenza e omettere l'anticorpo primario o secondario, oppure sostituire l'antisiero primario o secondario con tampone fosfato per preparare il controllo negativo. Successivamente, ripetere il protocollo di immunofluorescenza e pre-assorbire ogni anticorpo primario con un eccesso del peptide relativo.
Ripeti il protocollo di immunofluorescenza su fette di cervello di topo per preparare il controllo positivo. Utilizzando un microscopio confocale dotato di uno stadio motorizzato X-Y-Z, una fotocamera digitale e un software di acquisizione e analisi, osservare e analizzare le sezioni immunostained. Acquisisci immagini digitali con gli obiettivi 5x, 20x e 40x.
Scatta immagini di ogni sezione a basso ingrandimento in ciascuno dei canali disponibili per comporre un montaggio a basso ingrandimento. Normalizza le immagini a fluorescenza al massimo contrasto e sovrapposizione. In tutta l'area di interesse, raccogli pile seriali di immagini attraverso sei piani focali con gradini focali da uno a 1,8 micrometri.
Eseguire questa raccolta per ogni canale separatamente. Successivamente, utilizzare il software di deconvoluzione dell'imaging per deconvolvere le immagini mediante l'applicazione di 10 iterazioni e comprimere le immagini seriali del piano Z in un'unica immagine di proiezione massima. Utilizzare un software di modifica delle immagini appropriato per regolare le micrografie in base alla luce e al contrasto.
L'analisi immunoistochimica della distribuzione OX-A e OX-2R nell'intestino del pesce zebra adulto mostra diversi siti di localizzazione di OX-A e OX-2R e il loro aumento di espressione nelle cellule intestinali del pesce zebra DIO. Un'intensa colorazione marrone per OX-A si osserva nelle cellule dell'intestino mediale e anteriore. L'immunoespressione di OX-A dà segnali chiari nei diversi compartimenti intestinali, diminuendo dall'anteriore verso l'intestino mediale.
Risultati simili sono osservati per l'immunoespressione OX-2R nell'intestino del DIO e controllare la dieta zebrafish. Un maggiore segnale OX-A nel pesce zebra adulto DIO è accompagnato dalla sovraespressione di OX-2R in altri compartimenti intestinali. Un'analisi accurata delle immagini immunofluorescenti mostra l'aumento della colocalizzazione OX-2R/CB1R nell'intestino del pesce zebra adulto DIO rispetto alla dieta di controllo zebrafish.
Una situazione simile si osserva in diverse regioni cerebrali, come il telencefalo dorsale, l'ipotalamo, lo tectum ottico, il toro lateralis e il nucleo diffuso del lobo inferiore. Con la doppia immunosottenzione con colocalizzazione orexina-A e CB1R, si osserva che c'è stato un aumento della colocalizzazione nei neuroni origanoergici dell'ipotalamo, accompagnato da un aumento del segnale fluorescente orexin-A. Questi risultati mostrano come la doppia immunofluorescenza possa aiutare a identificare l'espressione proteica fisiologicamente conservata, la colocalizzazione delle proteine bersaglio e i cambiamenti di distribuzione e/o espressione in diverse condizioni patologiche.
Usando l'immunofluorescenza, possiamo comprendere meglio la codistribuzione e la coespressione delle biomolecole, le loro possibili interazioni, e possiamo anche avere un'immagine visibile dei loro cambiamenti in caso di diverse patologie. Inoltre, la distribuzione neuroanatomica dell'espressione enzimatica metabolica o dei recettori può rivelare ulteriormente il ruolo della segnalazione proteica all'interno dei tessuti. L'attuale lavoro tecnico ha introdotto l'approccio dell'immunofluorescenza per studiare due sistemi altamente conservati, l'orexin e gli endocannabinoidi, utilizzando un modello di zebrafish adulto.
Usando questo protocollo descritto qui per la prima volta nel cervello del pesce zebra adulto, la distribuzione anatomica e la coespressione dei recettori dell'orexin-2 e dei recettori endocannabinoide-CB1 non è stata determinata. Raccomandiamo i protocolli qui descritti per gli esperimenti di immunoistochimica e per rilevare la distribuzione spaziale e l'organizzazione dei recettori nei peptidi nei pesci zebra adulti per comprenderne meglio le funzioni.
