حاليا، يتم استخدام الكيمياء المناعية مع زيادة وتيرة لتحديد وجود علامات جزيئية محددة والتغيرات في حالة الأمراض، مما يعطي الجذر لإمكانية إجراء تحليل كمي. وتستخدم الكيمياء المناعية، وأساسا تقنية المناعةfluorescence، في اليرقات ونموذج الحمار الوحشي الكبار، ولكن لا يعرف سوى القليل عن بروتوكول المناعة الجيدة للحمار الوحشي. هنا، نحن وصف وتوضيح بروتوكول التي يمكن استخدامها لدراسة الحفظ التطوري للبروتينات الهامة في حمار وحشي بالغ.
بروتوكول جيد للكيمياء المناعية في حمار وحشي بالغ يمكن أن تساعد على أساس فائدة هذا النموذج الحيواني لدراسة التعبير المورفولوجي وتوزيع الجزيئات الحيوية المحافظة للغاية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة أيضًا في تحليل التعديلات المحتملة لهذه الجزيئات الحيوية بسبب الحالات المرضية المرتبطة بطب فيزيولوجيا المرضي البشري. ومن خلال هذا الإجراء، ستكون الدكتورة ليا تونسي، طالبة دكتوراه من مختبري.
لبدء هذا الإجراء، نقل كتل الأنسجة المجمدة المعدة إلى التبريد في ناقص 20 درجة مئوية. قطع كتلة في أقسام الإكلالي أو القوس من 10 ميكرومتر. ثم، وجمع الأنسجة في أقسام المسلسل البديل على الشرائح الزجاج لاصقة مناسبة للكيمياء المناعية، وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية حتى جاهزة للمضي قدما.
أولاً، استخدم قلماً مقاوماً للمذيبات لترسيم منطقة الأنسجة على الشريحة. شطف الأقسام ثلاث مرات لمدة خمس دقائق كل باستخدام 0.1-مولار عازلة الفوسفات. بعد ذلك، حل 0.3 ملليلتر من تريتون X-100 في 100 ملليلتر من 0.1-مولار الفوسفات العازلة لإعداد تريتون X-100 0.3٪ حل 0.1٪ مصل حمار طبيعي في عازلة الفوسفات التي تحتوي على 0.3٪ تريتون X-100 لإعداد الحل حظر.
احتضان المقاطع مع حل مصل حمار العادي المذاب في permeabilization العازلة PB-Triton X-100 0.3٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ل Permeabilize غشاء الخلية ومنع مواقع الربط غير محددة. أولاً، شطف الأقسام ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها مع 0.1-مولار الفوسفات العازلة. أضف مزيجًا من الأجسام المضادة الأولية المخففة في PB-T، وحضن الأقسام بين عشية وضحاها في صندوق رطب في درجة حرارة الغرفة.
في اليوم التالي ، شطف الأقسام ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها مع 0.1 -مضروس الفوسفات العازلة. احتضان الأقسام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في مزيج مناسب من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في PB-T. للبدء ، شطف المقاطع ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع كل 0.1 - عازلة فوسفات المولر.
حل 1.5 ميكرولترات من DAPI في ثلاثة ملليلتر من الفوسفات العازلة لإعداد DAPI صبغة نووية. مضادّة اقطع في الصبغة. ثم، استخدام متوسطة التركيب لتغطي الشرائح لتحقيق الاستقرار في الأنسجة وصمة عار للاستخدام على المدى الطويل.
يمكن تخزين عينات الفلورسنت في الظلام عند أربع درجات مئوية. كرر بروتوكول المناعةfluorescence، وإما حذف الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية، أو استبدال antiserum الأساسية أو الثانوية مع عازلة الفوسفات لإعداد السيطرة السلبية. بعد ذلك، كرر بروتوكول الفلوروسنس المناعي، وامتصاص كل جسم مضاد أساسي مسبقًا مع وجود فائض من الببتيد النسبي.
كرر بروتوكول الفلوروسين المناعي على شرائح من دماغ الماوس لإعداد السيطرة الإيجابية. باستخدام مجهر confocal مجهزة مرحلة X-Y-Z الآلية, كاميرا رقمية, واكتساب وتحليل البرمجيات, مراقبة وتحليل المقاطع المثبطة للمناعة. الحصول على الصور الرقمية مع أهداف 5x و 20x و 40x.
التقاط صور لكل قسم في التكبير منخفضة في كل من القنوات المتاحة لتكوين المونتاج منخفضة التكبير. تطبيع الصور الفلورية إلى أقصى درجات التباين والتراكب. في جميع أنحاء منطقة الاهتمام ، وجمع المسلسل Z - أكوام من الصور من خلال ست طائرات التنسيق مع الخطوات المحورية من واحد إلى 1.8 ميكرومتر.
تنفيذ هذه المجموعة لكل قناة على حدة. بعد ذلك ، استخدم برنامج فك الفولتية لـ فك الوضوح للصور من خلال تطبيق 10 تكرارات ، وطي صور المستوى Z التسلسلية في صورة إسقاط قصوى واحدة. استخدم برنامج تحرير الصور المناسب لضبط الصور الدقيقة للضوء والتباين.
يُظهر التحليل المناعي الكيميائي لتوزيع OX-A وOX-2R في القناة الهضمية للسممر الوحشي البالغ مواقع توطين مختلفة لـ OX-A و OX-2R وزيادة التعبير في الخلايا المعوية لسمك الحمار الوحشي ديو. لوحظ تلطيخ بني مكثف لـ OX-A في خلايا الأمعاء المتوسطة والأمعاء الأمامية. يعطي التعبير المناعي لـ OX-A إشارات واضحة في مقصورات الأمعاء المختلفة ، ويتناقص من الأمامي نحو الأمعاء الوسيطة.
ويلاحظ نتائج مماثلة لOX-2R immunoexpression في الأمعاء من ديو والسيطرة على الحمية حمار وحشي. ويرافق زيادة إشارة OX-A في ديو حمار وحشي بالغ من قبل فرط التعبير من OX-2R في مقصورات الأمعاء الأخرى. تحليل دقيق لصور مناعية يظهر زيادة OX-2R/CB1R الكولوكية في الأمعاء من ديو حمار وحشي بالغ مقارنة مع الحمار الوحشي التحكم في النظام الغذائي.
ويلاحظ حالة مماثلة في مناطق الدماغ المختلفة، مثل التيلسيفال الظهري، تحت المهاد، tectum البصرية، التاركاليس التروس، ونواة منتشر من الفص السفلي. عن طريق مضاعفة التحسس بالمناعة مع أوريكسين-A وCB1R التكلس, ويلاحظ أن هناك زيادة في الكوليكساليثان في الخلايا العصبية orexinergic من تحت المهاد, يرافقه زيادة أوريكسين-A إشارة الفلورسنت. تظهر هذه النتائج كيف يمكن أن تساعد الفلوروسينة المناعية المزدوجة في تحديد التعبير البروتيني المحفوظ فسيولوجيًا ، وتكلس البروتينات المستهدفة ، وتغييرات توزيعها و / أو التعبير عنها في الظروف المرضية المختلفة.
باستخدام الفلورا المناعية ، يمكننا فهم أفضل لتشارك في توزيع الجزيئات الحيوية وتفاعلاتها المحتملة ، ويمكننا أيضًا الحصول على صورة مرئية لتغيراتها في حالة الأمراض المختلفة. وعلاوة على ذلك، قد التوزيع العصبية الاستئصالية للتعبير انزيم الأيضي أو مستقبلات تكشف عن دور بروتين إشارة داخل الأنسجة. وقد أدخل العمل التقني الحالي نهج الفلوروسنس المناعي لدراسة نظامين محافظين للغاية، وهما الأوريكسين والأندوكانتابيويدات، في استخدام نموذج حمار وحشي بالغ.
باستخدام هذا البروتوكول الموصوف هنا لأول مرة في الدماغ من الحمار الوحشي الكبار، لم يتم تحديد التوزيع التشريحي وcoexpression من مستقبلات orexin-2 ومستقبلات إندوكانابينويد-CB1. نوصي البروتوكولات المذكورة هنا لإجراء تجارب الكيمياء المناعية والكشف عن التوزيع المكاني وتنظيم المستقبلات في الببتيدات في حمار وحشي بالغ لفهم أفضل لوظائفها.
