Questo protocollo può essere utilizzato per indurre ipertensione polmonare ed eseguire misurazioni funzionali del ventricolo destro. Il modello di ipossia sugen è facile da implementare e può ricapitolare alcuni dei tratti distintivi dell'ipertensione polmonare entro due o tre settimane dall'induzione. Utilizzando questo modello, possiamo identificare nuovi percorsi coinvolti nello sviluppo della malattia.
Siamo in grado di identificare nuovi obiettivi e testarne il potenziale terapeutico. Prima di iniziare la procedura di induzione, fissare i serbatoi di azoto vicino alla camera ipossia e impostare il regolatore di ossigeno in un punto del 10% di ossigeno. Successivamente, caricare la soluzione SU5416 preparata al momento in una siringa millilitro dotata di un ago calibro 25 e trattenere manualmente il primo animale da iniettare.
Afferrare la pelle per formare una tenda parallela alla colonna vertebrale assicurandosi di afferrare saldamente la parte posteriore della testa per evitare una potenziale lesione da morso da parte del topo. Inserire l'ago per via sottocutanea sul fianco alla piega della pelle sciolta parallela alla pelle e fornire 100 microlitri del contenuto della siringa. Dopo 10 secondi, ritirare l'ago e riportare l'animale nella sua gabbia.
Quando tutti gli animali sono stati iniettati, posizionare i topi in una camera ventilata di ipossia. Per l'esposizione all'ipossia, verificare che le camere siano dotate di un sensore di ossigeno per misurare il livello di ossigeno e aprire le camere per non più di 20 minuti ogni tre giorni per la pulizia e l'aggiunta di cibo e acqua. Ispezionare gli animali ogni giorno alla ricerca di segni di stress e ripetere l'iniezione DI5416 settimanalmente per tre settimane consecutive.
Prima di avviare la procedura di misurazione della pressione, preparare il connettore del tubo Y e utilizzare la modalità manuale per controllare la funzione del ventilatore. Impostare la pressione inspiratoria su meno di un centimetro d'acqua per evitare il barotrauma e impostare la frequenza respiratoria su 110 respiri al minuto. Tagliare un catetere intravascolare calibro 20 per creare un tubo endotracheale e accendere l'unità di controllo del volume di pressione.
Avviare il software di acquisizione dati e posizionare il catetere del volume di pressione in un tubo di centrifuga da 15 millilitri di PBS in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Quindi calibrare il catetere in base al protocollo del produttore. Posizionare il mouse su una pastiglia riscaldante e posizionare una sonda rettale per il monitoraggio della temperatura corporea.
Successivamente, confermare la mancanza di risposta al dito del piedi in un topo anestetizzato e radere le aree del collo e del torace. Fissare gli arti del topo con nastro chirurgico e fare un'incisione di un centimetro nella pelle cervicale mediale. Usando un applicatore con punta di cotone, separare senza mezzi termini le ghiandole salivari parotidi e submandibolari per esporre i muscoli sottostanti la trachea.
Tagliare con cura i muscoli per esporre completamente la trachea e utilizzare le forbici per fare una piccola incisione tra le cartilagine tracheali. Inserire il tubo endotracheale preparato e rimuovere la guida metallica del catetere intravascolare. Quindi collegare il catetere al ventilatore e verificare la posizione del tubo tracheale gonfiando manualmente i polmoni.
Fissare la posizione con il nastro adesivo. Per la giusta misurazione della pressione ventricolare, fare un'incisione cutanea di un centimetro sul processo xifoide e sull'addome superiore e iniziare dalla linea mediana distale allo xifoide e muovendosi con cura lateralmente su entrambi i lati, separare la pelle sul torace e sulla parete addominale. Aprendo la cavità addominale, tagliare attentamente il diaframma, facendo attenzione a non ferire il cuore pulsante o i polmoni.
E utilizzare un applicatore con punta di cotone per rimuovere delicatamente il pericardio. Portare il catetere a pressione vicino al mouse e utilizzare un applicatore con punta di cotone dotato di ago per fare una coltellata nella parte atipica distale del ventricolo destro. Sostituire con cura l'ago con un catetere a pressione, inserendo il catetere di pressione parallelo alla direzione del ventricolo destro con la punta rivolta verso l'arteria polmonare.
Guarda il tracciamento dell'onda di pressione per garantire il corretto posizionamento del catetere. Una volta stabilizzato il segnale di pressione, sospendere le respirazioni e ottenere almeno tre misurazioni. Una volta registrate tutte le misurazioni, riportare accuratamente il catetere al tubo di centrifuga riempito di PBS nel bagno d'acqua.
Qui vengono mostrate curve di pressione rappresentative e un'analisi quantitativa della pressione ventricolare destra alla fine del periodo di osservazione. L'analisi istologica delle arterie polmonari rimodellate dopo l'ipossia più il trattamento SU5416 rivela un aumento dello spessore mediale della parete rispetto agli animali normossici. La colorazione dell'agglutinina germinale di grano per valutare l'ipertrofia cardiomiocita indica che l'ipossia più l'esposizione a SU5416 si traduce in un marcato aumento delle dimensioni dei cardiomiociti e dell'ipertrofia ventricolare destra.
Inoltre, la valutazione morfometrica dell'ipertrofia ventricolare destra mediante misurazione dell'indice di Fulton conferma un aumento dell'ipertrofia ventricolare destra negli animali ipossici. Eseguire le misurazioni funzionali è importante per evitare il sanguinamento perché ciò può influire negativamente sui risultati dello studio. Questo protocollo può anche essere utilizzato per indurre ipertensione polmonare nei ratti con solo lievi modifiche.
In particolare, solo un'iniezione di Sugen nei ratti è sufficiente per indurre l'ipertensione polmonare.
