I siderofori sono biomolecole a basso peso molecolare, chelano metalliche coinvolte nel ciclismo del ferro nell'ambiente. Questo protocollo consente una rapida valutazione ad alta produttività dell'attività dei siderofori nei campioni di suolo e piante. I precedenti metodi per il rilevamento dei siderofori hanno eliminato l'ambiente cruciale della comunità microbica.
La nostra tecnica consente il rilevamento all'interno della comunità microbica relativamente intatta e dell'habitat in cui ha coinvolto. Poiché la disponibilità di ferro è fondamentale per la produttività dell'agricoltura, quindi in questo protocollo potrebbe essere utilizzato per indagare il ruolo dei microbi nel modulare la disponibilità di ferro per le piante. Inoltre, questo metodo potrebbe essere utilizzato per valutare l'impatto delle pratiche di gestione delle aziende agricole sulla salute del suolo e sulle comunità produttrici di siderofori, nonché lo sviluppo di tali comunità nel tempo.
Per iniziare, lavare con l'acido tutte le vetrerie in acido nitrico 100 millimolare 100 millimolare per un minimo di due ore prima dell'utilizzo nel saggio CAS. Preparare una teglia in alluminio riempita con sabbia di laboratorio e coprirla con un foglio di alluminio. Autoclave a 121 gradi Celsius per 30 minuti e messa da parte.
Preparare HDTMA aggiungendo 0365 grammi a 20 millilitri di acqua doppia deionizzata e mettere la soluzione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per promuovere la solubilizzazione. Aggiungere 0302 grammi di CAS a 25 millilitri di acqua doppia deionizzata mescolando delicatamente con una barra di agitazione magnetica sterile. Quindi aggiungere cinque millilitri di un esaidrato di cloruro di ferro molare ai 25 millilitri della soluzione CAS continuando a mescolare delicatamente.
Ora, aggiungere lentamente i 20 millilitri della soluzione HDTMA nella soluzione complessa CAS di ferro mescolando delicatamente. Preparare la soluzione tampone sciogliendo 15,12 grammi di TUBI in 375 millilitri di acqua doppia deionizzata con agitazione delicata. Regolare il pH a 6,8 con cinque idrossido di sodio molare.
Quindi aggiungere acqua per portare il volume a 450 millilitri. Ora aggiungi cinque grammi di agarosio alla soluzione. Autoclavare la soluzione tampone PIPES e la soluzione complessa CAS di ferro a 121 gradi Celsius per 30 minuti.
Aggiungere con cura l'intera soluzione complessa CAS di ferro all'intero tampone PIPES nell'armadio di biosicurezza dopo che ognuno di essi è stato autoclavato. Posizionare la soluzione mista in un bagno d'acqua a 50 gradi Celsius. Ora posiziona una barca di reagenti sterile nella sabbia sterile all'interno dell'armadietto della biosicurezza e riscalda a 50 gradi Celsius.
Trasferire l'agar complesso CAS di ferro sulla barca, quindi aliquotare rapidamente 100 microlitri in ogni pozzo di una micropiatta sterile a fondo piatto chiara a 96 poder. Preparare 800 micromolare standard di pilodina in mezzo M9 modificato precedentemente preparato. Diluire la soluzione in soluzioni micromolare 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25.
Aggiungere EDTA a 500 millilitri di mezzo M9 modificato precedentemente preparato per preparare lo standard EDTA da 3,2 millimolare. Diluire questa soluzione in soluzioni micromolare 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25. Per generare una curva standard, aggiungere 100 microlitri di ogni concentrazione di pyoverdine ed EDTA per separare i pozzi di una micropiatta da 96 po ' contenente 100 microlitri di ferro CAS complesso agar medium.
Effettuare repliche tecniche duplicate di ogni concentrazione. Aggiungere anche pozzi vuoti con solo M9. Utilizzando un lettore di micropiastra, misurare l'assorbanza dopo un'incubazione di una, sei e 24 ore a 22 gradi Celsius e utilizzare le misurazioni dell'assorbanza per generare curve standard. Lavare l'apparecchiatura di campionamento con 22 micron di filtro a doppia acqua deionizzata seguita dal 70% di etanolo e pulire con tovaglioli di carta.
Eseguire il lavaggio prima del campionamento e tra i campioni per mantenere la tecnica sterile e ridurre la contaminazione incrociata. Dopo aver eccitato i tessuti vegetali e scavato una piccola palla di radice dalle piante sul campo, posizionare la palla di radice in un sacchetto di plastica etichettato separato per la separazione del campione nell'ambiente di laboratorio. Posizionare tutti i campioni direttamente sul ghiaccio e conservare a quattro gradi Celsius fino a quando i campioni non vengono elaborati per il saggio di produzione del sideroforo.
Separare i campioni di suolo associati alle radici in terreno di rizosfera sfuso e vagamente legato e nel suolo della rizosfera strettamente legato. Per fare ciò, prendi le palle di radice dalle borse e scrollati delicatamente di gitare il terreno dalla palla di radice. Scosso dal terreno, insieme al terreno lasciato nella borsa, comprendono il terreno sfuso.
Questo è il suolo della rizosfera vagamente legato. Genera terreno rizopshere strettamente legato prendendo radici con il campione strettamente legato e mettendole in un tubo di centrifuga. Aggiungere 30 millilitri di acqua e vortice doppi deionizzati per due o tre minuti.
Rimuovere le radici per ottenere la diluizione del suolo della rizosfera strettamente legata. Omogeneizzare ogni campione di terreno all'interno del sacchetto campione mescolando e ruotando il terreno il più possibile senza aprire la borsa. Dopo che ogni campione è stato accuratamente miscelato, aliquota e sospendere due grammi di ciascun campione di terreno in 20 millilitri di mezzo M9 modificato all'interno di un tubo di centrifuga sterile da 50 millilitri.
Diluire il campione e quindi sigillare il tubo con un tappo di schiuma sterile per consentire l'aerazione. Per campioni di rizosfera strettamente legati, aggiungere due millilitri del liquame del suolo della rizosfera a 20 millilitri di mezzo M9 modificato all'interno di un tubo di centrifuga sterile da 50 millilitri. Diluire il campione e quindi sigillare il tubo con un tappo di schiuma sterile per consentire l'aerazione.
Per preparare il campione di tessuto, sterilizzare in superficie la radice, sparare e il grano con il 70% di etanolo. Macerare due grammi di tessuto fresco in 20 millilitri di mezzo M9 modificato utilizzando un frullatore in alto per 30 secondi. Quindi, trasferire il campione in un tubo di centrifuga sterile da 50 millilitri, diluire e sigillare il tubo con un tappo di schiuma sterile.
Per arricchire la produzione di sideroforo attraverso la limitazione del ferro incubare i tubi di centrifuga da 50 millilitri a temperatura ambiente e agitare a 160 giri/min. A 24, 48 e 72 ore dall'inizio della coltura di arricchimento, rimuovere un sottocampione millilitro dai tubi di arricchimento con tecnica sterile. Centrifugare i sottocampioni a 10.000 volte G per un minuto in due tubi di centrifuga millilitro per pellettizzare le cellule.
Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere 100 microlitri del supernatante a una soluzione da 100 microlitri di agar complesso CAS di ferro in duplicato o triplicato all'interno della micropiatta. Aggiungere anche 100 microlitri di mezzo M9 sterile come spazi vuoti. Quindi incubare il piatto a 28 gradi Celsius.
Ogni piastra deve essere sigillata e coperta con un foglio prima del posizionamento nell'incubatore. Sospendere il supernatante rimanente e il pellet per ogni campione nel proprio tubo di centrifuga sterile a due millilitri. Aggiungere 400 microlitri di glicerolo sterile in ogni tubo supernatante del campione e sospendere di nuovo il pellet per creare scorte di glicerolo.
Congelare il titolo a meno 80 gradi Celsius per un'analisi successiva. Misurare l'assorbanza a sei, 24, 48 e 72 ore ad una lunghezza d'onda di 420 nanometri. Una miscela di pioverdina biosintesizzata da Pseudomonas fluorescens è stata utilizzata come standard per interpretare e quantificare l'assorbanza dei campioni in campioni di equivalenza della pilorsidina in micromolare.
La relazione tra l'assorbanza a 420 nanometri e la concentrazione iniziale di pioverdina è mostrata qui. L'attività sideroforica dell'arricchimento di 72 ore è stata valutata a 48 ore di incubazione per determinare l'influenza del genotipo e del tipo di campione sull'isolamento del sideroforo. L'attività del sideroforo nei campioni di terreno sfuso era relativamente bassa e non presentava differenze tra il genotipo di grano da cui è stato campionato il terreno sfuso.
Tuttavia, gli arricchimenti di terreno liberamente legato isolato dal genotipo 725 presentavano una maggiore produzione di sideroforo rispetto al terreno liberamente legato di Madsen e 727 ma non di Lewjain. Al contrario, la produzione di siderofori negli arricchimenti da terreni strettamente legati non è stata fortemente influenzata dal genotipo. Le colture di arricchimento del tessuto cerealico hanno prodotto una produzione di sideroforo relativamente bassa indipendentemente dal genotipo.
Gli arricchimenti del tessuto di germoglio di Lewjain avevano una produzione di sideroforo significativamente inferiore rispetto agli altri genotipi, e 725 colture di tessuti di germoglio hanno portato a una produzione di sideroforo più variabile. La maggiore differenza nell'attività del sideroforo è stata osservata nelle colture di arricchimento dei tessuti delle radici in cui 725 avevano più del 200% di attività sideroforica maggiore rispetto a tutti gli altri genotipi. Uno degli aspetti più fiscali dell'esecuzione del protocollo è il mantenimento delle condizioni asettiche, completando al contempo i numerosi passaggi per generare la micropiatta di agar di ferro CAS e testando campioni per l'attività del sideroforo.
Una vasta gamma di tecniche cromatografiche basate sulla coltura o sul DNA possono essere applicate sia al pozzo del microtitere reale che alla coltura preservata dal glicerolo per ulteriori test biochimici o caratterizzazione genetica e modellazione metabolica. Utilizzando questo protocollo, l'attività del sideroforo può essere successivamente collegata a organismi specifici responsabili di tale attività o successivamente presa di mira come meccanismo per impatti ecologici più grandi. Questo protocollo potrebbe essere facilmente modificato per valutare la produzione di siderofori nelle colture di arricchimento generate da campioni raccolti da altri compartimenti ambientali tra cui aria, acqua e sedimenti.
