La trasformazione mediata dall'agrobatterio è un metodo semplice per produrre piante di patate geneticamente modificate. Al fine di comprendere specifiche funzioni geniche e il loro contributo alla fisiologia degli organi. La trasformazione da parte dell'agrobatterio rhizogenes è uno strumento robusto per valutare rapidamente le radici che funzionano con i geni, poiché risultati simili possono essere ottenuti mediante la trasformazione dell'agrobatterio tumefaciens.
A dimostrare questa procedura saranno Sandra Fernandez-Pinan, un post-doc, e Jennifer Lopez, studentessa di un maste5r del nostro laboratorio. Inizia coltivando una singola colonia di agrobatteri durante la notte in cinque millilitri di brodo estratto di lievito, o mezzo YEB, integrato con antibiotici in un tubo di centrifuga da 50 millilitri a 28 gradi Celsius, a 200 rotazioni al minuto. Per la trasformazione a-tumefaciens, misurare la densità ottica la mattina successiva.
Quando la densità ottica a 600 nanometri, o OD 600 raggiunge 0,6 a uno, centrifugare un millilitro della coltura di agrobatterio e rimorsi il pellet in un millilitro di mezzo YEB fresco senza antibiotici. Dopo il secondo lavaggio, resospendare il pellet in mezzo YEB fresco senza antibiotici, alla concentrazione appropriata per ottenere un OD 600 finale di 0,8, e posizionare le cellule batteriche sul ghiaccio. Per la trasformazione delle piante utilizzando A.rhizogenes, trasferire con cura una pianta donatrice da una coltura media 2MS a una piastra quadrata di 120 per 120 millimetri e utilizzare un ago chirurgico per iniettare tre microlitri da una coltura di A.rhyzogenes a diversi internodi dello stelo il più possibile.
Quindi trasferire immediatamente l'intero impianto su una nuova piastra quadrata contenente mezzo MS solido, integrato con acetosiringone millimolare da 0,1 millimolare. Dopo aver posizionato una seconda pianta sulla stessa piastra, trasformata nello stesso modo, sigillare la piastra con nastro chirurgico e posizionare la piastra verticalmente all'interno di un armadio di crescita per quattro giorni. Trasferire la pianta su una piastra quadrata con mezzo MS integrato con cefotaxime sodio per uccidere gli A.rhizogenes e posizionare la piastra sigillata verticalmente all'interno di un armadio di crescita per quattro giorni.
Dopo 10-12 giorni, appariranno nuove radici pelose. La loro trasformazione può essere confermata dal microscopio stereo fluorescente. In questo momento, asportare le radici native di ogni pianta e trasferire le piante su una nuova piastra quadrata con mezzo MS, integrata con cefotaxime sodio per uccidere gli A.rhizogenes.
Per ottenere una pianta composita, lasciare crescere le radici pelose transgeniche per altre tre o quattro settimane nel mezzo MS, integrato con cefotaxime sodio. Per la trasformazione dell'impianto utilizzando A.tumefaciens. Tagliare e posizionare una foglia da una pianta di tre o quattro settimane in una piastra di Petri e utilizzare un bisturi per fare uno o tre tagli trasversali dal centro della foglia ai bordi senza tagliare i pezzi dalla foglia.
e per escludere il piciolo. Posizionare immediatamente la foglia in una piastra di Petri contenente 10 millilitri di mezzo liquido fresco 2MS, lato abaxiale verso l'alto e coprire il piatto. Aggiungere rapidamente 80 microlitri della coltura di A.tumefaciens al mezzo liquido e mescolare delicatamente il mezzo per un minuto per distribuire in modo omogeneo la soluzione batterica.
Quindi sigillare e coprire con cura la piastra con un foglio di alluminio per un'incubazione di due giorni in una camera Celsius di 24 gradi. Alla fine del periodo di trasformazione, trasferire le foglie lato abassiale verso l'alto, al mezzo induttivo indissolubile, raschiato con pinzette per un'incubazione di una settimana nel gabinetto di crescita. Alla fine dell'incubazione, trasferire le foglie, lato abassiale verso l'alto, su un mezzo di induttore di germogli raschiato con pinze e incubare le foglie in un armadio di crescita.
Quando gli scivoli emersi sono alti circa due centimetri, tagliare tre scivoli emergenti da ogni ingenuo. Posizionare fino a cinque diversi eventi di trasformazione dello scivolo in singole fiasche di coltura contenenti mezzo MG integrato con cefotaxime sodio per consentire il rooting ed etichettare il sottoinsieme come appropriato per un'incubazione di tre o quattro settimane nell'armadio di crescita fino a quando gli scivoli non sono vigorosi. Al termine dell'incubazione, selezionare la pianta più vigorosa di ogni evento e tagliare i segmenti apicici dello scivolo con tre o quattro internodi da ogni pianta.
Posizionare i segmenti in un pallone da coltura contenente mezzo 2MS integrato con cefotaxime sodio e far crescere le piante fino a sviluppare scivoli e radici vigorosi. Per eseguire un saggio gene del reporter istochimico beta-glucuronidasi o GUS, fissare le radici da una coltura vegetale in vitro di due o tre settimane con acetone refrigerato al 90% per 20 minuti sul ghiaccio. Al termine della fissazione, lavare le radici due volte in acqua distillata e trattare le radici con soluzione di colorazione GUS fresca sotto vuoto per 20 minuti.
Alla fine del trattamento sottovuoto, posizionare le radici a 37 gradi Celsius al buio per circa quattro ore. Quando è visibile un colore blu, lavare le radici due volte con il 70% di etanolo e visualizzare la colorazione al microscopio a campo luminoso. Le radici pelose trasformate mostrano una florescenza rossa quando illuminate con luce verde, mentre il controllo negativo dell'agrobatterio non trasformato non dimostra tale florescence, indicando l'idoneità del marcatore di trasformazione rossa DS per identificare le radici pelose transgeniche.
Qui sono mostrate la colorazione GUS nelle radici di piante transgeniche ottenute da A.tumefaciens e radici pelose transgeniche ottenute da A.rhizogenes. Come osservato, le radici trasformate con A, tumefaciens e coltivate in vitro, dimostrano la colorazione blu nell'endodermide, uno strato cellulare tra la corteccia e la stele. Nelle radici più sviluppate, l'etichettatura blu è irregolare nello strato esterno, corrispondente all'esodermide.
Nelle radici pelose trasformate ottenute da A.rhizogenes, e coltivate in idroponica, il marcatore GUS si trova specificamente all'interno dell'endodermide nell'emergere di radici laterale nelle aree ferite e nell'esodermide. Oltre ad essere un metodo veloce, le radici transgeniche ottenute con l'agrobatterio rizogene trasportavano anche il DNA dal plasmide che induce radici, che può deregolamentare alcuni processi direttamente controllati. Le radici pelose transgeniche ottenute con agrobacterium rhizogenes possono essere mantenute mentre sparano, ma in alternativa possono essere in loco fino a propagarsi in vitro per una produzione di transito massiccio.
La trasformazione della patata fornisce un buon strumento per controllare la funzione genica e l'attivazione del promotore, e anche per produrre regole metodologiche in una specie di alto interesse agronomico. L'organismo geneticamente modificato deve essere scartato in modo sicuro dopo l'uso per evitare la contaminazione ambientale. Inoltre, la soluzione di gas contiene derivati tossici del cianuro, quindi protezione dall'usura e scartare la soluzione in modo sicuro.
