השינוי התווך בגרובקטריום הוא שיטה קלה לייצור צמחי תפוחי אדמה מהונדסים גנטית. על מנת להבין תפקודי גנים ספציפיים ותרומתם לפיזיולוגיה של האיברים. טרנספורמציה על ידי רזוגנים אגרובקטריום הוא כלי חזק להערכת במהירות שורשים תפקוד גנים, כמו תוצאות דומות ניתן להשיג על ידי טרנספורמציה tumefaciens אגרובקטריום.
הדגימו את ההליך הזה יהיו סנדרה פרננדז-פינן, פוסט-דוק, וג'ניפר לופז, סטודנטית של maste5r מהמעבדה שלנו. התחל בגידול מושבת אגרובקטריום אחת בן לילה בחמישה מיליליטר של מרק תמצית שמרים, או בינוני YEB, בתוספת אנטיביוטיקה בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר ב 28 מעלות צלזיוס, ב 200 סיבובים לדקה. לטרנספורמציה א-tumefaciens, למדוד את הצפיפות האופטית למחרת בבוקר.
כאשר הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר, או OD 600 מגיע 0.6 לאחד, צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבות האגרובקטריום resuspend את גלולה במיליליטר אחד של מדיום YEB טרי ללא אנטיביוטיקה. לאחר הכביסה השנייה, יש להשתמש מחדש את גלולה במדיום YEB טרי ללא אנטיביוטיקה, לריכוז המתאים כדי לקבל OD סופי 600 של 0.8, ולמקם את התאים החיידקיים על קרח. עבור טרנספורמציה צמחית באמצעות A.rhizogenes, בזהירות להעביר צמח תורם מתרבות בינונית 2MS ל 120 על ידי 120 מילימטרים צלחת מרובעת, ולהשתמש מחט כירורגית להזריק שלושה microliters מתרבות A.rhyzogenes ל internodes גזע שונים ככל האפשר.
לאחר מכן מיד להעביר את הצמח כולו לצלחת מרובעת חדשה המכילה מדיום MS מוצק, בתוספת 0.1 מילימולר אצטוסירינגון. לאחר הנחת צמח שני על אותה צלחת, הפך באותו אופן, לאטום את הצלחת עם סרט כירורגי, ומניחים את הצלחת אנכית בתוך ארון צמיחה במשך ארבעה ימים. מעבירים את הצמח לצלחת מרובעת עם מדיום MS בתוספת נתרן cefotaxime להרוג את A.rhizogenes ולהמקם את הצלחת אטומה אנכית בתוך ארון צמיחה במשך ארבעה ימים.
לאחר 10 עד 12 ימים, שורשים שעיר חדש יופיע. השינוי שלהם יכול להיות מאושר על ידי מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. בשלב זה, excise השורשים המקומיים של כל צמח, ולהעביר את הצמחים לצלחת מרובעת חדשה עם מדיום MS, בתוספת נתרן cefotaxime להרוג את A.rhizogenes.
כדי להשיג צמח מרוכב, תן שורשים שעיר מהונדס לגדול עוד שלושה עד ארבעה שבועות במדיום MS, בתוספת נתרן cefotaxime. לשינוי צמחים באמצעות A.tumefaciens. חותכים ומ מניחים עלה מצמח בן שלושה עד ארבעה שבועות בצלחת פטרי, ולהשתמש באזמל לעשות אחד עד שלושה חתכים רוחביים ממרכז העלה לקצוות מבלי לחתוך את חתיכות העלה.
ולהוציא את הפטיול. מיד מניחים את העלה לתוך צלחת פטרי המכיל 10 מיליליטר של טרי 2MS נוזלי בינוני, צד abaxial למעלה, ולכסות את הצלחת. מוסיפים במהירות 80 מיקרוליטרים של תרבות ה-A.tumefaciens למדיום הנוזלי ומערבבים בעדינות את המדיום במשך דקה אחת כדי להפיץ הומוגנית את הפתרון החיידקי.
לאחר מכן לאטום בזהירות ולכסות את הצלחת עם רדיד אלומיניום עבור דגירה של יומיים בתא 24 מעלות צלזיוס. בתום תקופת הטרנספורמציה, מעבירים את העלים לצד העבקסיאלי למעלה, למדיום הנודע, מגרדים פינצטה עבור דגירה של שבוע בקבינט הצמיחה. בסוף הדגירה, להעביר את העלים, בצד abaxial למעלה, על פינצטה גירד לירות גרימת בינוני, ודגירה העלים בקבינט צמיחה.
כאשר המצנחים הגיחים הם בגובה של כשני ס"מ, חותכים שלושה מצנחים מגיחים מכל אחד מהם. מניחים עד חמישה אירועי טרנספורמציה שונים מצנח לתוך flasks תרבות בודדים המכילים מדיום MG בתוספת נתרן cefotaxime כדי לאפשר השתרשות, ולתייג את תת הקבוצה בהתאם מתאים דגירה שלושה עד ארבעה שבועות בארון הצמיחה עד המצנחים הם נמרצים. בסוף הדגירה, לבחור את הצמח הנמרץ ביותר של כל אירוע, לחתוך את מקטעי apical של המצנח עם שלושה עד ארבעה internodes מכל צמח.
מניחים את הקטעים לתוך בקבוקון תרבות המכיל 2MS בינוני בתוספת נתרן cefotaxime ולגדל את הצמחים עד שהם מפתחים מצנחים נמרצים ושורשים. כדי לבצע בדיקה גנטית של בטא-גלוקוקונידס או GUS, תקן את השורשים מתרבות צמחית של שבועיים עד שלושה שבועות במבחנה עם אצטון מקורר של 90% במשך 20 דקות על קרח. בסוף ההתקבעות, לשטוף את השורשים פעמיים במים מזוקקים ולטפל השורשים עם פתרון טרי GUS מכתים תחת ואקום במשך 20 דקות.
בסוף הטיפול בוואקום, מניחים את השורשים על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך כארבע שעות. כאשר צבע כחול גלוי, לשטוף את השורשים פעמיים עם 70%אתנול, ולהמחיש את הכתמים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. שורשים שערים שהשתנו מפגינים פלורציה אדומה כאשר הם מוארים באור ירוק, בעוד ששליטה שלילית על אגרובקטריום לא מעוצב אינה מדגימה פלורציה כזו, מה שמצביע על התאמת סמן הטרנספורמציה האדומה של DS לזיהוי שורשים שערים מהומנים.
כאן, כתמי GUS בשורשים של צמחים מהומשים המתקבלים על ידי A.tumefaciens ושורשים שערים מהו מהודרים המתקבלים על ידי A.rhizogenes מוצגים. כפי שנצפה, שורשים שהשתנו עם A, tumefaciens וגדל במבחנה, להפגין כתמים כחולים endodermis, שכבת תא בין קליפת המוח ואת stele. בשורשים מפותחים יותר, התיוג הכחול הוא מטושטש בשכבה החיצונית, המתאים exodermis.
בשורשים שערים שעברו טרנספורמציה שהושגו על ידי A.rhizogenes, וגדל הידרופוניקה, סמן GUS ממוקם במיוחד בתוך אנדודרמה בהופעתם של שורשים לצדד באזורים הפצועים וב exodermis. בנוסף להיותה שיטה מהירה, השורשים הטרנסגניים המתקבלים עם קנה שורשים אגרובקטריום נשאו גם את ה- DNA מהפלסמיד מעורר השורש, אשר עשוי לרוקן כמה תהליכים הנשלטים ישירות. השורשים השעירות הטרנסגניים המתקבלים עם קנה שורשים אגרובקטריום ניתן לשמור בזמן שהם יורים, אבל לחילופין יכול להיות באתר עד מופץ במבחנה לייצור תחבורה מסיבית.
טרנספורמציית תפוחי האדמה מספקת כלי טוב לבדיקה של תפקוד הגנים והפעלת האמרגן, וגם כדי לייצר כללים מתודולוגיים במין בעל עניין אגרונומי גבוה. האורגניזם מהונדס גנטית צריך להיות מושלך בבטחה לאחר השימוש כדי למנוע זיהום סביבתי. כמו כן, פתרון גז מכיל נגזרת ציאניד רעיל, כך ללבוש הגנה להשליך את הפתרון בבטחה.
