Questo protocollo è il primo a introdurre la tecnologia di scansione 3D nel campo della ricerca anatomica, in particolare neuroanatomica, e ha raggiunto prestazioni sovrapposte altamente accurate. La sovrapposizione di neuro incorporamento 3D, o protocollo neurologico 3D, incorpora prese sterili su micro-scala in immagini cerebrali su macro-scala e collega queste diverse scale spaziali senza soluzione di continuità. Dobbiamo anche applicare il protocollo 3D neuro alle risonanze e ai cervelli post mortem umani.
La sovrapposizione ci consente di identificare modelli noti di contrasto della risonanza prima del 2000 relativi alle malattie. I sistemi di scansione 3D sono sensibili all'acqua che circonda il bio organismo estratto, quindi è fondamentale pulire l'acqua con molta attenzione. Inoltre, la procedura deve essere eseguita il più rapidamente possibile.
Iniziare questa procedura con la preparazione di un mouse, nonché acquisizioni di mri e preparazioni di apparecchiature come descritto nel protocollo di testo. Il secondo giorno, tagliare il cuoio capelluto di un topo precedentemente eutanasiato lungo la sutura sagittale usando forbici chirurgiche. Usa le forbici chirurgiche per tagliare il cranio in direzioni diagonali dal punto lambda a un punto un po 'di fronte al bregma.
Quindi, staccare delicatamente il cranio dal cervello usando una pinzetta curva. Sollevare il cervello con una spatola e trasferirlo in una piastra di Petri con soluzione di taglio ghiacciato. Utilizzando una bomba a gas esterna con una velocità della pompa rotante controllata, flusso d'aria contenente il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica per generare piccole bolle nella soluzione di taglio a freddo ghiacciato.
Dopo uno o due minuti, metti il cervello su un panno in microfibra la cui superficie è leggermente coperta da un setaccio di farina. Pulire delicatamente il fluido dalla superficie cerebrale utilizzando il panno in microfibra. Metti il cervello, con il suo aspetto dorsale in alto, sul supporto del campione.
Quindi, posizionare il supporto del campione al centro del giradischi automatico. Scurisci la stanza durante la scansione 3D ed esegui una scansione 3D sul giradischi. Per verificare se la scansione 3D funziona bene, fare clic su Scansione 3D selezionando l'angolo tra due scatti come 22,5, l'angolo iniziale come zero e l'angolo finale come 360.
Spostare il cervello in una piastra di Petri e far bollire il cervello nella soluzione di taglio per circa 10 secondi. Tagliare il cervello in due blocchi al centro del piano coronale, usando un bisturi. Quindi, spostare delicatamente i due blocchi cerebrali sulla superficie piana usando una spatola chirurgica.
Attaccare i blocchi cerebrali della base del blocco cerebrale usando colla istantanea. Pulire delicatamente e accuratamente il fluido dalla superficie cerebrale entro uno o due minuti, utilizzando il panno in microfibra. Quindi, eseguire di nuovo una scansione 3D.
Attaccare una lama al porta lama del vibratomo. Attaccare il nastro nero che copre il centro della base del blocco cerebrale al centro della fase di taglio per un vibratomo. Versare la soluzione di taglio nella fase di taglio e impostare la fase di taglio sul vibratomo.
Regolare la velocità e l'ampiezza di taglio. Fai da due a cinque fette coronali di 300 micron di spessore dai due blocchi cerebrali. Mantenere la soluzione nella fase di taglio gorgogliando, se possibile.
Ottimizza la velocità di taglio, la frequenza e l'ampiezza delle vibrazioni del sistema impostandole come 12,7 millimetri al minuto per la velocità, da 87 a 88 hertz per la frequenza e da 0,8 a 1,0 millimetri per la larghezza di oscillazione. Durante il taglio delle fette cerebrali, registrare la coordinata affettata nel formato, inclusa la coordinata anteriore-posteriore, l'emisfero e altre condizioni. Trasferire delicatamente le fette cerebrali in un becher riempito con ACSF pre-riscaldato utilizzando una spessa pipetta di plastica.
Incubare le fette cerebrali nel becher a circa 34 gradi Celsius per un'ora. Durante questo periodo, eseguire una scansione 3D dei blocchi cerebrali rimanenti sullo stadio di taglio. Ora, impostare un array multielettrode, o chip MEA, su un'unità di registrazione.
Collegare il chip a una pompa peristaltica utilizzando due tubi. Utilizzare un tubo per guidare lo stesso ACSF nel chip MEA e nell'altro tubo per guidare l'ACSF fuori dal chip MEA. Attaccare due aghi, collegati sulla punta dei due tubi, alla parte superiore della parete del chip MEA.
Fissare le loro posizioni con le loro punte seguendo la parete interna del chip MEA. Impostare la portata dell'ACSF su 4,1 rpm. Eseguire l'elaborazione dei dati MRI per estrarre volumi corticali come descritto nel protocollo di testo.
Per eseguire l'elaborazione delle immagini MRI, scarica il software gratuito 3D Slicer. Apri le immagini MR dei cervelli estratti che sono stati prodotti utilizzando il rendering del volume e i moduli di editor nel filtro dei dati 3D. Cambia la modalità da editor a rendering del volume e fai clic su un pulsante di destinazione per far arrivare l'immagine del cervello al centro dello schermo.
Selezionare la modalità cervello MRT-2 e ottimizzare le soglie spostando la barra di spostamento. Quindi, torna dal rendering del volume all'editor e fai clic sul pulsante dell'effetto soglia. Applicare l'etichetta 41, corteccia cerebrale.
Quindi, salvare i dati della superficie cerebrale come file STL modificando il formato del file da VTK a STL nell'elenco di controllo del modulo. Eseguire una coregistrazione automatica tra otto o 16 immagini prese da otto o 16 angolazioni diverse all'interno di una sequenza di scansione per correggere piccole discrepanze. A tale fine, fare clic su Registrazione globale inclusa nell'opzione di allineamento e integrare le immagini.
Ripetere le scansioni da diverse angolazioni per ottenere l'intera superficie cerebrale. Se l'integrazione tra immagini digitalizzate da diverse angolazioni non ha avuto esito positivo, fare clic su Allineamento manuale e selezionare una coppia di immagini fisse e un'immagine in movimento. Avviare l'allineamento manuale delle immagini selezionando tre o quattro punti comuni in immagini diverse.
Quindi, fare clic su OK. L'algoritmo di ottimizzazione è l'algoritmo iterativo del punto più vicino e non include una deformazione non lineare. Crea una mesh di tutte le immagini allineate selezionando tutte le immagini e facendo clic sul pulsante di generazione mesh. Quindi, selezionare l'opzione, piccolo oggetto artistico, per ottenere la mesh alla massima risoluzione.
Salvare l'immagine come binario STL o in formato ASCII. Ora, apri la superficie della risonanza magnetica e uniscila alla superficie di scansione 3D utilizzando il software di elaborazione della superficie. Eseguire un processo di allineamento manuale come in precedenza.
Quindi, salva di nuovo queste immagini di superficie coregistrate. Se necessario, pulire i dati di superficie individuali cancellando piccoli rumori che circondano la regione cerebrale, specialmente nel caso dei dati mri, e riempiendo eventuali fori, specialmente nel caso dei dati di scansione 3D. Infine, aprire i dati di superficie con software di analisi dei dati come MATLAB.
Generare e valutare gli istogrammi delle distanze minime tra le due superfici. Le distanze sono state valutate tra le superfici corticali prodotte dallo stripping del volume della risonanza magnetica e le superfici ottenute da scansioni 3D di cervelli estratti. I valori di modalità dell'istogramma delle distanze sono di soli 55 micron.
Inoltre, quando si accumula l'istogramma dal punto in cui la distanza è uguale a zero, il valore accumulato raggiunge il 90% dei numeri totali del campione a circa 300 micron. L'istogramma finale delle distanze tra due superfici ha mostrato un picco tipico di circa 50 micron. Da un punto di vista macroscopico, questo valore di modalità corrisponde alla limitazione geometrica, che era di 100 micron dalla dimensione voxel delle RISONANZA MAGNETICA.
Questo punto suggerisce indirettamente che l'algoritmo sovrapposto tra la risonanza magnetica e la scansione 3D ha funzionato benissimo e che i livelli di rumore sia della risonanza magnetica che della scansione 3D sono stati soppressi come un valore basso. Questo protocollo è il primo a salire attraverso la tecnologia di scansione al bio-organismo. La tecnologia è stata originariamente utilizzata per esigenze puramente ingegneristiche.
L'applicazione di questa tecnologia alla medicina può rispondere a nuove domande. Dopo la scansione 3D, possiamo utilizzare le registrazioni del patch grammo di patch per l'imaging del calcio per ottenere conoscenze complementari in termini di risoluzione temporale e spaziale e numero record di cellule. Le prestazioni sovrapposte altamente accurate che questo protocollo fornisce renderanno più realistica di prima un'associazione senza soluzione di continuità tra la scala spaziale anatomica e la scala spaziale zero.
