Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunità polmonare su come valutare l'espressione dei microRNA che si prevede regolino i geni infiammatori all'interno del polmone. Questa tecnica offre il modo semplice per identificare i contributi degli ormoni circolanti all'espressione del microRNA polmonare. Per valutare la fase del ciclo estrosa, trattenere manualmente un topo femmina di otto-nove settimane e introdurre la punta di una pipetta di plastica da 10 microliter riempita con acqua ultra pura nella vagina.
Sciacquare delicatamente da quattro a cinque volte per raccogliere un campione e depositare lo scarico finale di liquido vaginale su uno scivolo di vetro. Quindi osservare il lavaggio vaginale non macchiato sotto un microscopio leggero con ingrandimento 20X. Per le esposizioni all'ozono e all'aria filtrata, posizionare un massimo di quattro topi in uno dei due singoli contenitori di vetro da 1,2 litri con coperchi in rete metallica.
Mettere un contenitore di vetro in una camera di ozono e uno in una camera di esposizione all'aria filtrata. Quindi regolare la concentrazione di ozono a due parti per milione, rimuovendo il contenitore dopo tre ore. Quattro ore dopo l'esposizione, disinfettare la superficie cutanea esposta del primo topo sperimentale con il 70% di etanolo e tagliare la gabbia toracica per esporre il cuore e i polmoni.
Utilizzare le forcep per immergere un tubo di micro centrifuga privo di RNasi da 1,5 millilitri nell'azoto liquido e congelare il polmone raccolto nell'azoto liquido. Quindi utilizzare un polverizzatore di tessuto in acciaio inossidabile per mascerare l'intero polmone e dividere il tessuto polverizzato tra due tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Dopo aver raccolto e polverizzato i polmoni da tutti gli animali allo stesso modo, aggiungere 500 microlitri di tiocianato di guanidinio a ciascun campione e omogeneizzare sequenzialmente ogni tessuto con aghi calibro 18, 21 e 23.
Dopo l'ultima omogeneizzazione, aggiungere 500 microlitri di etanolo a ciascun campione prima del vortice per 15 secondi. Caricare le miscele in singole colonne di spin in singoli tubi di raccolta per la centrifugazione e scartare i flowthrough. Per il trattamento con DNasi 1, aggiungere 400 microlitri di tampone di lavaggio dell'RNA a ciascuna colonna per un'altra centrifugazione e mescolare cinque microlitri di DNasi 1 e 75 microlitri di tampone di digestione del DNA per campione in tubi senza RNasi.
Aggiungere la miscela direttamente alle matrici di colonna per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, seguita da due lavaggi di soluzione di prelavaggio dell'RNA da 400 microliter mediante centrifugazione. Per elutare l'RNA, aggiungere 35 microlitri di acqua priva di DNA direttamente a ciascuna matrice di colonna per una centrifugazione finale e misurare la concentrazione totale di RNA e la purezza di ogni campione su uno spettrofotometro. Quindi conservare l'RNA a meno 80 gradi Celsius.
Per la retrotrascrizione della piccola RNasi, aggiungere 200 nanogrammi di RNA totale in 10 microlitri di soluzione di prelavaggio a un tubo di miscela di reazione di trascrizione inversa per campione. Dopo la miscelazione, centrifugare brevemente i campioni e metterli sul ghiaccio fino alla loro incubazione. Successivamente, incubare i tubi per 60 minuti a 37 gradi Celsius, seguiti da un'incubazione di cinque minuti a 95 gradi Celsius.
Alla fine della seconda incubazione, diluire il CDNA con 200 microlitri di acqua priva di RNasi per reazione di trascrizione inversa di 20 microlitri e aggiungere 10 microlitri di ogni campione di miscela di reazione ad ogni pozzo di una risposta infiammatoria del mouse precaricata e di un array PCR di microRNA autoimmuni. Lo stadio del proestro può essere identificato dalla presenza di cellule epiteliali nucleate a forma rotonda e ben formate. Quando il topo si trova nella fase dell'estro, nello striscio si osservano grappoli densamente impacchettati di cellule epiteliali anucleate, cornificate e squamose.
Durante il metestro, si vedono cellule epiteliali cornificate e leucociti polimorfonucleari. Nel diestro, i leucociti sono generalmente più diffusi. L'RNA estratto da quattro polmoni a topo, come dimostrato, mostra concentrazioni di acido nucleico che vanno da 1198 a 2178 nanogrammi per microlitro e un rapporto medio da A260 a A280 tra 2,01 e 2,02 e un rapporto medio da A260 a A230 tra 2,139 e 2,223.
In questa tabella, vengono mostrati cambiamenti due volte nell'espressione del microRNA tra ozono e topi esposti all'aria filtrata. Dopo il filtro di destinazione del microRNA e l'analisi del nucleo per 14 microRNA, per ottenere il significativo rapporto di registro delle espressioni e i valori P, questi dati possono essere mappati dal filtro di destinazione del microRNA. L'analisi di base fornisce anche informazioni su percorsi canonici, malattie e funzioni, regolatori e reti.
Inoltre, il software di analisi funzionale può essere utilizzato per produrre un'analisi di rete che mostra la relazione tra i microRNA di interesse e altre molecole. Durante il tentativo di questa procedura, è importante controllare il ciclo dell'estro ogni giorno per almeno tre cicli consecutivi prima di condurre un esperimento. Seguendo questa procedura, altri metodi possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sull'espressione genica infiammatoria polmonare durante il ciclo dell'estro.
Dopo lo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ad altri ricercatori nel campo dell'immunità polmonare per esplorare meccanismi di regolazione dell'ormone sessuale utilizzando altri modelli.
