Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del ministero federale tedesco dell&#39;Istruzione e della Ricerca (BMBF) nell&#39;ambito del Fuoco Bernstein: Base neuronale di apprendimento (BFNL) per DE Ringraziamo Randolf Menzel per preziosi commenti su una versione precedente del manoscritto.

1. Le api cattura dal Hive <ol><li> Un giorno prima l&#39;esperimento comincia, tra 2 e 4 del pomeriggio, lasciando l&#39;alveare api sono catturati. Per fare questo, una luce UV-permeabile piramide in plexiglass (altezza = 30 cm, apice 3,5 x 3, 5 cm, base 18 x 18 cm), che è richiudibile al vertice e la base, è tenuto ad un 20 - distanza di 30 cm di fronte all&#39;ingresso dell&#39;alveare con la base aperta e l&#39;apice chiuso in modo che le api di lasciare l&#39;alveare entrare nella base della piramide. La base è quindi chiuso e le api catturate vengono portati in laboratorio per ulteriori manipolazioni. </li></ol> 2. Trasferimento di api dalla Piramide in flaconi di vetro <ol><li> Nel laboratorio, la piramide è posato sulla sua base. Le pareti della piramide sono oscurati (per esempio con un asciugamano), ma l&#39;apice è lasciato scoperto. A causa della loro fototassi positivo, api lascerà la piramide con l&#39;apice quando aperto. Uno dopo l&#39;altro, le api vengono trasferite dalla piramide in flaconi di vetro tenendo le fiale sopra l&#39;apice aperto. Un flaconcino viene utilizzato per ape. Pertanto, l&#39;apice è chiuso quando si un&#39;ape entra nel flaconcino. </li></ol> 3. Le api, ricevano Tubi <ol><li> Le api sono immobilizzati da un raffreddamento in fiale di vetro in ghiaccio per 2,5-3,5 min. Si consiglia di guardare l&#39;ape e rimuoverlo dal ghiaccio non appena si smette di muoversi. </li><li> Un&#39;ape singolo immobilizzato è imbrigliato in un piccolo tubo di plastica con del nastro adesivo, in modo che sia in grado di muoversi liberamente la sua proboscide, ma non la sua testa, torace e gambe. E &#39;importante che il collo non è compresso. </li><li> Ogni ape fissato in un tubo di plastica viene messo in un pozzo numerati su una rastrelliera per una migliore maneggevolezza e l&#39;identificazione. Dopo che è stata rimossa per il recupero di condizionamento o la memoria del tubo è sempre restituito al pozzo esattamente lo stesso. </li></ol> 4. Api di alimentazione <ol><li> La prima sera (4-6 pm), dopo la cattura, le api sono alimentati a sazietà con la soluzione di saccarosio (0,88 M, lo zucchero bianco raffinato casa sciolto in acqua di rubinetto). Per alimentare un ape, il suo PER è suscitato toccando le sue antenne con una soluzione di saccarosio e l&#39;animale è consentito di consumare una goccia (4 mL) di soluzione di saccarosio. Le api sono alimentati uno dopo l&#39;altro finché non hanno più mostrano una veloce e affidabile PER quando le loro antenne sono toccati con la soluzione di saccarosio. </li><li> Su ogni sera successiva (4-6 pm) delle api esperimento vengono alimentati uno dopo l&#39;altro quattro volte con 1 goccia di soluzione di saccarosio (4 microlitri, 0,88 M, lo zucchero bianco raffinato risolto in acqua di rubinetto). E &#39;importante che la soluzione di saccarosio non è spalmato sulle antenne delle api o la proboscide durante l&#39;allattamento e che i tubi non sono contaminati con soluzione di saccarosio. Le api non dovrebbero essere alimentati in corrispondenza o in prossimità del sito di condizionamento per escludere la possibilità di associare il contesto di formazione con lo stimolo di saccarosio. </li></ol> 5. Mantenere Api Sfruttati Pernottamento <ol><li> Le api sono tenuti durante la notte in una ciotola di plastica a temperatura ambiente. L&#39;acqua del rubinetto è piena nella ciotola (circa 0,5-1 cm di altezza). Rack con le api sfruttata vengono inseriti nella ciotola sopra la linea di galleggiamento con le piastre ELISA come piattaforma. Infine, la tazza è ricoperto di cartone. </li></ol> 6. Condizionamento olfattivo La prima mattina (ore 10) l&#39;esperimento di condizionamento olfattivo viene effettuata. Lo stimolo condizionato (CS) è un odore, lo stimolo incondizionato (US) è ​​la soluzione di saccarosio. <ol><li> 4 l di dell&#39;odore (es. olio di chiodi di garofano) vengono aggiunti su un tondo di carta filtro (1,3 cm di diametro) che viene poi inserito in una siringa da 20 ml. L&#39;odore è pipettato sotto una cappa filtrante e suggerimenti sono utilizzati per prevenire la contaminazione della pipetta. </li><li> Il rack con le api sfruttata è posizionato in prossimità del sito di condizionamento 30 minuti prima della procedura di condizionamento inizia, ma ad una distanza dal luogo di fronte a un tubo di scarico in cui le api sono condizionati singolo. </li><li> Condizionamento è composto da tre coppie di odore (lo stimolo condizionato, CS) e la soluzione di saccarosio (lo stimolo incondizionato, USA, 1,25 M) con un inter-trial intervallo (ITI) di 10 min. Un segnale acustico consegnato allo sperimentatore attraverso un lettore audio permette la tempistica precisa di insorgenza stimolo, stimolo offset, durata stimolo e di collocamento. Un processo di acquisizione inizia con un collocamento di 10 secondi l&#39;animale di fronte a uno scarico. Poco prima della fine dei 10 sec la siringa contenente l&#39;odore è posizionato 3 cm fronte delle api destinati a antenne dell&#39;ape. Successivamente, l&#39;odore è presentato per 5 secondi, premendo 20 ml d&#39;aria attraverso la siringa. Dopo i primi 3 secondi i flagelli distale di entrambe le antenne sono toccati con una soluzione di saccarosio-stuzzicadenti inumidito e gli animali sono autorizzati a leccare lo stuzzicadenti moistend per 4 sec. 13 secondi dopo la stimolazione è finita CS, le api vengono prese fuori del contesto formativo e rimesso nel rack. Complessivamente una prova di formazione dura 28 secondi. E &#39;importante che né antenne delle api né la proboscide, sono ricoperte di saccarosio dopo il condizionamento. Quindi deve essere garantito che lo stuzzicadenti è solo inumidito con soluzione di saccarosio e che nessuna forma gocce di soluzione di saccarosio sul stuzzicadenti. </li><li> Dopo il condizionamento i rack sono posti di nuovo nella ciotola. </li><li> Comportamento degli animali &#39;durante l&#39;esperimento, ovvero il verificarsi del PER durante il posizionamento e CS e presentazione degli Stati Uniti, è monitorato e annotato dallo sperimentatore. </li></ol> 7. Conservazione della memoria <ol><li> Test di ritenzione può essere eseguita in qualsiasi intervallo (min a giorni). Il rack con le api è posizionato in prossimità del sito di condizionamento 30 minuti prima del test di memoria inizia. </li><li> Un test della memoria è costituita da 5 sec presentazione CS senza presentazione degli Stati Uniti. La prova inizia con un collocamento di 10 secondi l&#39;animale di fronte al gas di scarico. Successivamente, l&#39;odore è presentato per 5 secondi come descritto sopra. Il comportamento dell&#39;animale, ovvero il verificarsi del PER durante il posizionamento e la presentazione CS è annotato durante l&#39;esperimento. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento la risposta estensione proboscide è di nuovo suscitato toccando le antenne con una soluzione di saccarosio per garantire che l&#39;animale è ancora in grado di estendere la sua proboscide. </li></ol> 8. Iniezione sistemica Il punto di tempo di iniezione sistemica dipende dal disegno sperimentale. <ol><li> Un piccolo foro è fatto nella cuticola della parte posteriore della scutum vicino alla fessura di sopra dei 17 scutal volo muscolare utilizzando un ago ipodermico monouso (21 G). </li><li> Utilizzando un tubo di vetro capillare, 1 ul di soluzione viene iniettata attraverso il foro nella cuticola nel muscolo volo. Sperimentatori addestrati sono in grado di iniettare un ape ogni 30 secondi, consentendo un momento preciso di iniezione e di condizionamento. </li></ol> 9. Le api di alimentazione durante l&#39;esperimento <ol><li> La sera (4-6 pm) dopo il condizionamento, le api sono alimentati uno dopo l&#39;altro quattro volte con 1 goccia di soluzione di saccarosio (4 microlitri, 0,88 M, lo zucchero bianco raffinato sciolto in acqua di rubinetto). E &#39;importante che la soluzione di saccarosio non è spalmato sulle antenne delle api o la proboscide durante l&#39;allattamento e che i tubi non sono contaminati con soluzione di saccarosio. Le api non dovrebbero essere alimentati in corrispondenza o in prossimità del sito di condizionamento per escludere la possibilità di associare il contesto di formazione con lo stimolo di saccarosio. </li></ol> 10. Raccolta dati e analisi dei dati <ol><li> Comparsa di risposta estensione proboscide durante l&#39;esperimento è monitorato. Un&#39;ape risulti positivo se si estende la sua proboscide tra l&#39;inizio del CS e la presentazione degli Stati Uniti (durante l&#39;allenamento) o durante la presentazione CS (in fase di test), che attraversano una linea virtuale tra le mandibole aperte. </li><li> Per essere inclusi negli animali l&#39;analisi deve soddisfare due criteri: devono sopravvivere l&#39;intero esperimento e devono dimostrare l&#39;incondizionato risposta estensione proboscide (PER) di soluzione di saccarosio al termine dell&#39;esperimento. La percentuale di api che mostra il PER durante l&#39;acquisizione e test di ritenzione è tracciata per ogni presentazione CS. </li></ol> 11. Rappresentante dei risultati: Due esperimenti sono presentati qui. Nel primo esperimento guardiamo l&#39;impatto di iniezione sistemica di PBS (PBS; in mM: 137 NaCl, KCl 2,7, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) sull&#39;apprendimento e lungo termine formazione della memoria. Tre gruppi di api sono stati addestrati con tre CS-US abbinamenti con un inter-trial intervallo di 10 minuti: un non-gruppo trattato, un gruppo che è stato iniettato con 1 ml di PBS 30 minuti prima dell&#39;allenamento, e una farsa-iniettato il gruppo trattato allo stesso modo del PBS a iniezione di gruppo, ma senza l&#39;iniezione di PBS. 24 ore dopo la formazione della memoria è stata testata con una presentazione CS in tutti e tre i gruppi. La percentuale di animali che presentano la risposta condizionata durante il condizionamento aumenta significativamente nelle tre prove di formazione (Fig.1, ANOVA per misure ripetute per il fattore tempo F 2378 = 340.456, p &lt;0,05). Nessuna differenza nella PER poteva essere osservata tra i tre gruppi durante il condizionamento (ANOVA per misure ripetute per il fattore F2 gruppi, 189 = 1.299, p&gt; 0,05). Questo vale per un test di 24 ore di ritenzione (F2, 187 = 0.752, p&gt; 0,05) nel confronto tra gli animali non trattati con PBS-iniettato animali e sham-iniettato. Nel secondo esperimento abbiamo dimostrato l&#39;inibizione di ritenzione della memoria tre o quattro giorni dopo l&#39;allenamento quando l&#39;inibitore della sintesi proteica anisomycin (10 mM) è stata iniettata per via sistemica 30 min dopo tre CS-US abbinamenti. Confronto di un anisomycin iniezione gruppo con un PBS a iniezione gruppo rivela una differenza significativa tra i gruppi durante la ritenzione test (Fig.2, ANOVA per misure ripetute per il fattore di F1 del gruppo, 94 = 8,86, p &lt;0,05). Una delle principali differenze possono essere osservate al test della memoria il giorno 3 e giorno 4. Questo assomiglia i risultati di Wüstenberg et al. 18, che ha anche condizionato le api con tre CS-US abbinamenti, anche se con un protocollo diverso. <img src="/files/ftp_upload/2282/2282fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Lesione cuticola o iniezione di PBS non altera acquisizione e il mantenimento della memoria. Gli animali sono stati addestrati con tre CS-US abbinamenti (acquisizione). Dopo 24 ore, la memoria è stata testata (ritenzione della memoria). Trenta minuti prima di formazione, un buco è stato fatto nella cuticola di due gruppi (lesione, PBS) e uno di questi gruppi è stato iniettato con 1 ml di PBS (PBS). Un terzo gruppo è stato lasciato intatto (nessun trattamento). Presentato è la percentuale di animali per ogni gruppo rispondendo alla presentazione con un odore PER. Un&#39;ANOVA non rivela differenze significative tra i gruppi nella fase di acquisizione (F2, 189 = 1,299, p&gt; 0,05) o nella conservazione memoria (F2, 187 = 0,752, p&gt; 0,05). <img src="/files/ftp_upload/2282/2282fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Iniezione di anisomycin 40 minuti dopo l&#39;ultimo CS-USA accoppiamento riduce la ritenzione della memoria tre giorni e quattro giorni dopo l&#39;allenamento. Gli animali sono stati addestrati con tre CS-US abbinamenti (acquisizione) e iniettato con 1 mM anisomycin microlitri 10 (formato ISO) o 1 ml di PBS 1 h dopo il processo di formazione prima. Memoria è stata testata (ritenzione della memoria) 24 ore, 48 ore, 72 ore e 96 ore più tardi. Presentato è la percentuale di animali per gruppo rispondendo alla presentazione con un odore PER. L&#39;iniezione di anisomycin porta ad una riduzione significativa di memoria ritenzione 72 ore e 96 ore dopo l&#39;allenamento (F1, 94 = 8.86, p &lt;0,05), come rivelato da un ANOVA.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<ol><li> Facendo api: Per raccogliere esperienza api bottinatrici, le api vengono catturati o al mattino o al pomeriggio, evitando il momento in cui le api giovani sui voli orientamento 19. Raccoglitori raccolga polline o nettare. Le differenze tra polline e nettare raccoglitori sono stati osservati in base alla loro reattività zucchero e la loro capacità di apprendimento 20. Per raggiungere raccoglitori nettare unico, una fonte di cibo artificiale riempito con una soluzione di saccarosio può essere installata vicino l&#39;alveare e gli animali possono essere raccolti lì. Raccoglitori polline ritorno all&#39;alveare possono essere identificati dai cesti polline sulle zampe posteriori 20. </li><li> Fissaggio e movimentazione: raffreddamento estesa delle api sul ghiaccio dovrebbe essere evitata in quanto potrebbe incidere sulla loro capacità di apprendere e di sopravvivere fino alla fine dell&#39;esperimento. Tarsi devono essere fissati con cura all&#39;interno del tubo per evitare la stimolazione accidentale con una soluzione di saccarosio. Questo è importante, perché le api hanno dimostrato di imparare attraverso la stimolazione del tarso con una soluzione succrose 3,21. </li><li> Condizionamento olfattivo: Il numero di prove condizionata, l&#39;inter-trial intervallo, e il punto di tempo di prova può essere variata a seconda del focus dello studio 3,22. </li><li> Alimentazione: il livello di sazietà delle api è conosciuto per influenzare le prestazioni di apprendimento e la memorizzazione 3,23. Questo deve essere preso in considerazione durante la pianificazione degli esperimenti. </li><li> Iniezione: sacche d&#39;aria si trovano nei 17 torace api. Queste parti vitali del sistema respiratorio sono necessari per la sopravvivenza. Quindi si deve prestare attenzione a non danneggiare le sacche d&#39;aria durante l&#39;iniezione. Il rilascio di bolle d&#39;aria indica un danno per le sacche d&#39;aria. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Syringe Omnifix 20 ml</td><td>B. Braun Medical</td><td>4616200 V</td><td></td></tr><tr><td>White refined household sugar</td><td>Kaisers Supermarket, Berlin, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clove oil</td><td>Bombastus, Freital, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multipette plus</td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td></td></tr><tr><td>Rack for 30 bee tubes</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic tubes</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV light-permeable plexiglass pyramid</td><td>Home made</td><td></td><td>height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm</td></tr><tr><td>Sticky tape</td><td>Tesa, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillator sticks 1-5&amp;mu;l</td><td>Selzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillator tips 1-5&amp;mu;l</td><td>Selzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter paper 0.16-0.2 mm thick</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 616 or MN615</td><td>Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter</td></tr><tr><td>Disposable hypodermic needle</td><td>B. Braun Medical</td><td>4657683</td><td>0.45 mm diameter</td></tr></tbody></table>

behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (apis mellifera)

Le api (Apis mellifera) sono ben noti per la loro abilità di comunicazione e orientamento e per i loro 1,2 impressionante capacità di apprendimento. Perché la sopravvivenza di una colonia di api dipende sullo sfruttamento delle fonti di cibo, le api raccoglitore apprendere e memorizzare siti fiori variabile nonché la loro redditività. Forager api possono essere facilmente addestrati in ambienti naturali dove foraggio in un sito di alimentazione e imparare i segnali correlati, come l&#39;odore o colore. Appetitivo apprendimento associativo può anche essere studiato in condizioni controllate in laboratorio dal condizionamento della risposta estensione proboscide (PER) del individualmente imbrigliato api 3,4. Questo paradigma di apprendimento consente lo studio dei meccanismi neuronali e molecolari che sono alla base dell&#39;apprendimento e la formazione della memoria in modo semplice ed estremamente affidabile 5-12. Un approccio farmacologia comportamentale è usato per studiare i meccanismi molecolari. I farmaci vengono iniettati per via sistemica di interferire con la funzione di molecole specifiche, durante o dopo l&#39;apprendimento e la formazione della memoria 13-16. Qui mostriamo come addestrare le api sfruttate condizionata PER e come applicare i farmaci per via sistemica per iniezione nel muscolo di volo delle api.

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Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

Dimostriamo come implementare un metodo di farmacologia comportamentale in un paradigma di condizionamento appetitivo olfattivo nelle api (Apis mellifera) mediante l&#39;applicazione sistemica di farmaci. Questo metodo permette di indagine del processo di apprendimento dei meccanismi di base e formazione della memoria in modo semplice e affidabile.

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

behavioural-pharmacology-classical-conditioning-proboscis-extension

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

19.3K Views.  Freie Universität Berlin. Dimostriamo come implementare un metodo di farmacologia comportamentale in un paradigma di condizionamento appetitivo olfattivo nelle api (Apis mellifera) mediante l'applicazione sistemica di farmaci. Questo metodo permette di indagine del processo di apprendimento dei meccanismi di base e formazione della memoria in modo semplice e affidabile.

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Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom body (MB) is a higher brain center proposed to be the neural substrate of complex honeybee behaviors. Although previous studies identified genes and proteins that are differentially expressed in the MBs and other brain regions, the activities of the proteins in each region are not yet fully understood. To reveal the functions of these proteins in the brain, pharmacologic analysis is a feasible approach, but it is first necessary to confirm that pharmacologic manipulations indeed alter the protein activity in these brain regions.
We previously identified a higher expression of genes encoding phospholipase C (PLC) in the MBs than in other brain regions, and pharmacologically assessed the involvement of PLC in honeybee behavior. In that study, we biochemically tested two pharmacologic agents and confirmed that they decreased PLC activity in the MBs and other brain regions. Here, we present a detailed description of how to detect PLC activity in honeybee brain homogenate. In this assay system, homogenates derived from different brain regions are reacted with a synthetic fluorogenic substrate, and fluorescence resulting from PLC activity is quantified and compared between brain regions. We also describe our evaluation of the inhibitory effects of certain drugs on PLC activity using the same system. Although this system is likely affected by other endogenous fluorescence compounds and/or the absorbance of the assay components and tissues, the measurement of PLC activity using this system is safer and easier than that using the traditional assay, which requires radiolabeled substrates. The simple procedure and manipulations allow us to examine PLC activity in the brains and other tissues of honeybees involved in different social tasks.

To test the inhibitory effects of pharmacologic agents on phospholipase C (PLC) in different regions of the honeybee brain, we present a biochemical assay to measure PLC activity in those regions. This assay could be useful for comparing PLC activity among tissues, as well as among bees exhibiting different behaviors.

Rilevamento di attività della fosfolipasi C in omogeneato del cervello dall'ape

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Ricerca

Biochimica

Visual Classical Conditioning in Wood Ants

Several species of insects have become model systems for studying learning and memory formation. Although many studies focus on freely moving animals, studies implementing classical conditioning paradigms with harnessed insects have been important for investigating the exact cues that individuals learn and the neural mechanisms underlying learning and memory formation. Here we present a protocol for evoking visual associative learning in wood ants through classical conditioning. In this paradigm, ants are harnessed and presented with a visual cue (a blue cardboard), the conditional stimulus (CS), paired with an appetitive sugar reward, the unconditional stimulus (US). Ants perform a Maxilla-Labium Extension Reflex (MaLER), the unconditional response (UR), which can be used as a readout for learning. Training consists of 10 trials, separated by a 5-minute intertrial interval (ITI). Ants are also tested for memory retention 10 minutes or 1 hour after training. This protocol has the potential to allow researchers to analyze, in a precise and controlled manner, the details of visual memory formation and the neural basis of learning and memory formation in wood ants.

We present a protocol for the classical conditioning of harnessed ants that permits researchers to study visual learning and memory formation at a level of analysis not possible with freely moving individuals.

Visual condizionamento classico in legna formiche

Several species of insects have become model systems for studying learning and memory formation. Although many studies focus on freely moving animals, ...

Comportamento

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

In vivo Ca 2 + - Imaging di neuroni Corpo funghi durante l&#39;apprendimento olfattivo nel Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Biologia

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

Neuroscienze

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Una proboscide risposta estensione Protocollo per Indagare plasticità comportamentale in Insetti: Applicazione di base, biomedica e ricerca agricola

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

Registrazioni simultanee a lungo termine in due fasi neuronale Processing in Comportarsi api

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

Manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: Monitoraggio in tempo reale dei movimenti di Antenna dell'insetto e proboscide estensione Reflex utilizzando una preparazione comune e Hardware convenzionali

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Rilevamento di attività della fosfolipasi C in omogeneato del cervello dall'ape

Visual condizionamento classico in legna formiche

In vivo Ca ^{2 +} - Imaging di neuroni Corpo funghi durante l'apprendimento olfattivo nel Honey Bee

Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (

Una proboscide risposta estensione Protocollo per Indagare plasticità comportamentale in Insetti: Applicazione di base, biomedica e ricerca agricola

Registrazioni simultanee a lungo termine in due fasi neuronale Processing in Comportarsi api

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (

Manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere,

SwarmSight: Monitoraggio in tempo reale dei movimenti di Antenna dell'insetto e proboscide estensione Reflex utilizzando una preparazione comune e Hardware convenzionali