Gli autori ringraziano il Midwestern University ufficio di ricerca e programmi sponsorizzati per il loro sostegno.

1. preparare supporti per coltura anaerobica di varie linee cellulari di mammifero
<ol><li>
Rendere il completo supporto di PS-74656 per un cellulare anossica cultura25.
	<ol>
<li>Rendere la soluzione madre di nitrito sterile (5m; 100 x) sciogliendo 17,25 g di nitrito in 50 mL di acqua distillata o deionizzata, quindi filtrare per sterilizzarlo.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL della soluzione madre nitrito per 50 mL di glucosio basso DMEM (1 g/L di glucosio) con 110 mg/L di L-Glutammina, 584 mg/L di sodio piruvato e 10% siero bovino fetale (FBS; inattivati al calore). Nota: L'uso di FBS concentrazioni superiore a 10% sono tossici. Della nota, una linea cellulare di cancro testata aveva una bassa tolleranza per i media con il nitrito (MDA-MB-231, linea di cellule di cancro al seno) e, quindi, è stata coltivata in assenza di nitrito. Inoltre, anche se PS-74656 medio sostenuto la crescita di tutte le linee cellulari che sono stati testati (n = 9), alcune linee cellulari (ad es., cellule Vero) hanno esibito le più alte concentrazioni di cellule e una redditività superiore in PS-74656 con alto glucosio (4,5 g/L) DMEM 25.</li>
		<li>Posto 20 mL di terreno in una provetta conica sterile 50 mL. Non serrare il tappo; esso dovrebbe essere sciolto.</li>
		<li>De-gas medio inserendo il tubo in una campana di vetro vuoto a un angolo di circa 45 °, per massimizzare l'area di superficie media.</li>
		<li>Applicare un vuoto utilizzando una pompa a vuoto, o il suo equivalente, a temperatura ambiente. Mantenere il vuoto fino a quando le bolle non sono non più osservate (24-48 h).</li>
		<li>Rimuovere il tubo dalla vaschetta e chiudere immediatamente il tappo, il tubo per ridurre al minimo l'introduzione di aria nel mezzo di tenuta.</li>
		<li>Inserire il tubo nella camera anaerobica commerciale.</li>
		<li>Svitare il tappo del tubo e consentire l'atmosfera nel tubo da equilibrare con quello della miscela gas anaerobico nella camera per almeno 24 h. Nota: Il mezzo dovrebbe rimanere nella camera fino ad esaurimento. Per accelerare il processo, a filo il tubo almeno 3 volte con la miscela di gas anossico utilizzando una pipetta sterile riempita di gas anossico, che consiste di N, CO2e H22.
</li>
		<li>Degassare tutte le provette (10 – 15 min) collocate nella camera anaerobica come descritto in precedenza prima di sigillare il tubo e immissione nella camera. Prima dell'uso, lavare con la miscela di gas anaerobica utilizzando pipette di trasferimento di 1,5 – 2 mL o puntali che sono state svuotate con anossico gas almeno 3 volte.</li>
		<li>Mentre nella camera anaerobica, rimuovere 100 µ l del mezzo in una provetta sterile da micro-centrifuga degassato e testarlo per l'ossigeno disciolto utilizzando una sonda di ossigeno all'interno della camera. Nota: L'elettrodo di ossigeno è calibrato per prima del protocollo del produttore utilizzare. Letture dei media miscela gas anaerobico correttamente degassato ed equilibrato sono 0. Attenzione: Se le letture sono superiori a 0,3 ppm di ossigeno, continua a incubare i media nella camera anaerobica poiché è necessario più tempo per equilibrare il medium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. anossico coltivazione di varie linee cellulari di mammifero
<ol><li>
Area giorno -1
	<ol>
<li>Crescere le cellule (37 ° C, 5% CO2) in un matraccio da T150 alla confluenza del 90% per il controllo di cultura anossico e normoxic fornire un numero sufficiente di cellule per tre piastre da 24 pozzetti (80% confluenza). Nota: Per questo studio, le cellule HeLa 229 e Vero sono state usate. Questo protocollo è stato anche testato e ha dimostrato riuscito per la crescita e la manutenzione di sette altre linee cellulari25.</li>
		<li>Rimuovere il supporto dal pallone di aspirazione e lavarlo con 10 mL di HBSS.</li>
		<li>Sostituire il mezzo con 5 mL di tripsina. Agitare il pallone fino a quando le cellule visivamente staccano dalla plastica. Aspirare la maggior parte della tripsina, quindi tocca il pallone per sloggiare le celle aderenti. Aggiungere 10 – 15 mL di alto glucosio DMEM (4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di L-Glutammina, 10% FBS, 50 µ g/mL di gentamicina) per inattivare la tripsina.</li>
		<li>Triturare le celle utilizzando una pipetta da 25 mL, fino a quando tutti i grumi di cellule sono interrotti.</li>
		<li>Contare le celle e determinare la fattibilità utilizzando l'emocitometro standard e il metodo di esclusione del colorante blu di trypan o l'equivalente automatizzato.</li>
		<li>Sospendere le cellule nell'alto glucosio DMEM come accennato in precedenza ad una densità di cella di 2,24 x 105 cellule/mL.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare dei pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti (2,24 x 105 cellule/pozzetto; 80% confluenza). 1 piastra per la cultura anossica e un altro per una cultura di normoxic controllo del seme.</li>
		<li>Incubare le cellule a 37 ° C in condizioni di normossia (5% CO2) per 24 h. Nota: Le celle possono essere placcate in varie piastre ben dimensionati. Tuttavia, semina le cellule per una crescita anossica in boccette corre il rischio dell'introduzione di ossigeno nel sistema, a meno che la cura è esercitata per scovare completamente gas atmosferici.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Giorno designato 0
	<ol>
<li>Dopo 24 h di incubazione normoxic, posizionare le piastre per la crescita anossica nella camera anaerobica (un alloggiamento anaerobico commerciale; Figura 1).</li>
		<li>Cambiare immediatamente il mezzo privo di antibiotico de-gasati PS-74656 medio che ha stati acclimatati per 24 h alla camera anaerobica. Posizionare la piastra in un contenitore con un panno umido e chiuderlo senza bloccare per mantenere l'umidità. Nota: Le piastre per la crescita in condizioni di normossia sono gestite in modo identico con l'eccezione che tutti i trattamenti avvengono in condizioni atmosferiche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 ° giorno designato
	<ol>
<li>1 ° giorno di incubazione anaerobica inizia dopo 24 h di incubazione nella camera anaerobica commerciale che contiene la miscela di gas anaerobico standard di 10% H2, 10% CO2e 80% N2.</li>
		<li>Incubare le cellule per vari periodi di tempo.</li>
		<li>Monitorare il mezzo anaerobico per il cambiamento di colore nel tempo. Nota: Un cambiamento di colore da rosso-arancio al magenta segnala il momento di cambiare il mezzo. Questo può richiedere fino a 2 settimane per verificarsi. Un cambiamento di colore nel mezzo da rosso-arancio al giallo indica la presenza di una contaminazione batterica.</li>
		<li>Quando il mezzo cambia da rosso a magenta, rimuovere le cellule di runagate dall'aspirazione.</li>
		<li>Posizionare il supporto di speso aspirato con le cellule di runagate a gas degassato e anaerobica equilibrato microfuge tubi, chiudere i tubi mentre assicurandosi che la guarnizione è sicura e poi centrifugare li (326 x g; a temperatura ambiente per 10 min). Sostituire immediatamente i media aspirati nel pozzo con 1 mL di nuovo mezzo di PS-74656 degassato.</li>
		<li>Posizionare il tubo di microfuge con pellettate cellule nella camera anaerobica prima di aprirlo. Aspirare il mezzo esaurito e sostituirlo con mezzo PS-74656 degassato fresco per un volume totale di 1 ml nel tubo del microfuge.</li>
		<li>Restituire le cellule dal tubo ad un pozzo nella piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. valutazione di differenziazione fenotipica delle cellule mediante microscopia di cellule coltivate in condizioni aerobiche
<ol><li>
Mentre nella camera anaerobica, posizionare la piastra in una scatola richiudibile lavata con la miscela di gas anaerobico e chiudere la finestra. Nota: La casella deve contenere un tovagliolo di carta umido per fornire umidità e prevenire la piastra dall'asciugarsi. Per microscopia, sacchetti per sandwich funzionano al meglio, dal momento che sono sottili.<ol>
<li>Per osservare le cellule al microscopio, completamente sigillare il sacchetto e rimuoverlo dalla camera.</li>
		<li>Con attenzione allungare il sacchetto di plastica sopra la piastra, esaminare cellule utilizzando un microscopio di contrasto di fase invertito con l'allegato di fotocamera e prendere microfotografie a vari ingrandimenti.</li>
		<li>Restituire la lastra nel sacchetto sigillato alla camera e continuare l'incubazione come descritto al punto 2.3.3.</li>
		<li>Per analizzare separatamente le cellule runagate che sono in sospensione, attenersi alla procedura descritta al punto 2.3.5. Nota: Queste cellule possono quindi essere utilizzate per il test aerobico o possono essere restituite alla camera anaerobica per la sperimentazione di questa specifica popolazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cummins, J., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+tumours:+causative+agents+or+opportunistic+inhabitants?.">Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?.</a> Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).</li><li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+generating+induced+pluripotent+stem+(iPS)+cells+from+human+somatic+cells+by+a+combination+of+six+transcription+factors.">Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors.</a> Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).</li><li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1:+mediator+of+physiological+and+pathophysiological+responses+to+hypoxia.">HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia.</a> Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).</li><li>Biedermann, L., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+microbiota:+its+role+in+health+and+disease.">The intestinal microbiota: its role in health and disease.</a> European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).</li><li>Cui, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+influences+stem+cell-like+properties+in+multidrug+resistant+K562+leukemic+cells.">Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Oxygen+and+Culture+Media+on+Plating+Efficiency+of+Some+Mammalian+Tissue+Cells.">Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells.</a> JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267, 423 (1977).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer.">On the origin of cancer.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li><li>D&#246;me, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., T&#243;v&#225;ri, J., T&#237;m&#225;r, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Vascularization+Mechanisms+in+Cancer.">Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).</li><li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+HIF-1&#945;+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous.">Induction of HIF-1&#945; in response to hypoxia is instantaneous.</a> The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li><li>Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+(HIF-1)alpha:+its+protein+stability+and+biological+functions.">Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).</li><li>Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etaypoxia-inducible+factor-1alpha,+von+Hippel-Lindau+protein,+and+heat+shock+protein+expression+in+ophthalmic+pterygium+and+normal+conjunctiva.">Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva.</a> Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).</li><li>Park, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-driven+glycolysis+supports+anoxia+resistance+in+the+naked+mole-rat.">Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat.</a> Science. 356 (6335), 307 (2017).</li><li>Johnston, I. A., Bernard, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+Ethanol+Pathway+in+Carp+Following+Exposure+to+Anoxia.">Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia.</a> Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).</li><li>Takahashi, E., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+respiration+sustains+mitochondrial+membrane+potential+in+a+prolyl+hydroxylase+pathway-activated+cancer+cell+line+in+a+hypoxic+microenvironment.">Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).</li><li>Mandziuk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hypoxia+on+toxicity+induced+by+anticancer+agents+in+cardiomyocyte+culture.">Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture.</a> Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).</li><li>Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+nirQOP+genes+in+energy+conservation+during+anaerobic+growth+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+and+Evolution+of+Anaerobic+Energy+Metabolism+in+Eukaryotes.">Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).</li><li>Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anoxic+plant+mitochondrion+as+a+nitrite:+NO+reductase.">The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase.</a> Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).</li><li>Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Nitrogen+Species+in+Mitochondria+and+Their+Implications+in+Plant+Energy+Status+and+Hypoxic+Stress+Tolerance.">Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).</li><li>Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reductase+activity+is+a+novel+function+of+mammalian+mitochondria.">Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria.</a> FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).</li><li>Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+and+significance+of+a+mitochondrial+nitrite+reductase.">The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase.</a> Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).</li><li>Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+breast+cancer+and+metastasis.">Cancer stem cells in breast cancer and metastasis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).</li><li>Plotkin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+long-term+cultivation+of+mammalian+cells+in+the+absence+of+oxygen:+Characterization+of+cell+replication,+hypoxia-inducible+factor+expression+and+reactive+oxygen+species+production.">A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production.</a> Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).</li><li>Sarmento, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+in+vitro+models+for+predicting+drug+permeability.">Cell-based in vitro models for predicting drug permeability.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).</li><li>Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+and+differentiation+of+human+myeloid+leukaemic+cells+in+suspension+culture.">Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture.</a> Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).</li><li>Plotkin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+long-term+cultivation+of+mammalian+cells+in+the+absence+of+oxygen:+Characterization+of+cell+replication,+hypoxia-inducible+factor+expression+and+reactive+oxygen+species+production.">A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production.</a> Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo metodo rappresenta la prima volta le cellule di mammiferi che sono state coltivate per lunghi periodi di tempo in assenza di ossigeno. Sulla base di osservazioni attuale la crescita anossico capacità tramite una via non-fermentativo sembra essere universale tra le cellule di mammiferi linee28, dove la crescita anaerobica ha provocato la divergenza di fenotipo. Questo è stato osservato per tutte le linee cellulari testate. Con la coltura anaerobica, aumentando le proporzioni delle...

Le cellule dai tumori solidi, nicchie di cellule staminali e quelle rivestimento superfici mucose presenti in ambienti che sperimentano livelli di ossigeno ridotto, tra cui anossia1,2,3,4. In condizioni fisiologiche normali, ossigenazione varia oltre quello di ipossia per anossia (la completa assenza di ossigeno)5,6. La realizzazione che ossigeno atmosferico influisce negativamente sulla replica delle cellule dei mammiferi e tale crescita in vitro delle cellule può essere ottimizzata in condizioni impoverito di ossigeno è stata segnalata nei primi anni 1970. Richter et al. 7 ha mostrato che 1 – 3% dei livelli di ossigeno (ipossia) migliorare l'efficienza della placcatura rispetto ad ossigeno atmosferico (20%). La durata della vita umana cellula diploide è esteso anche in condizioni ipossiche cultura8.
In vivo, condizioni di ipossia si verificano quando i negozi di ossigeno sono impoverito (ad es., durante l'esercizio intenso), in cui la produzione di ATP è inserita nel muscolo scheletrico da respirazione aerobica alla fermentazione (respirazione anaerobica) con la prodotto finale di acido lattico9. Patologico, in tumori cancerosi, all'interno del tumore massa è ipossica a anossico a causa della scarsa vascolarizzazione10. L'effetto della perfusione limitata all'interno del tumore viene convalidato indipendentemente da interni di tumore colonizzati da anaerobi1. Meccanicistico, sopravvivenza delle cellule del tumore nell'ipossia è pensata per essere dipendente unicamente sull'espressione del gene di 1 alfa fattore ipossia-inducibile (HIF1-alfa), che è la prima risposta spontanea alla ipossia4,11 , 12. HIF1-alfa è indotta in condizioni di ipossia da proteine dello shock termico che legano il HIF1-alfa promotore e aumentano la trascrizione genica12. Si ritiene che queste proteine di scossa di calore aiuto nell'induzione dei vari fenotipi visto nel microambiente tumorale ipossica. Questi fenotipi mostrano un incremento dell'espressione dei trasportatori del glucosio della membrana cellulare e il tasso di glicolisi (l'effetto Warburg)13. Il risultato è un interruttore da fosforilazione ossidativa mitocondriale di lattato fermentazione.
Anossico sopravvivenza possa anche utilizzare delle alternative a glucosio per sostenere la sopravvivenza fenomeno14,15. Il miglior esempio di mammiferi studiato è il Ratto talpa, che possono sopravvivere per quasi 20 minuti senza ossigeno attraverso una fermentazione glicolitico fruttosio-driven via14. Un adattamento alternativo si verifica in alcuni pesci (ad es., carpa [Carassius SP.], che possa sopravvivere per significativamente più lungamente periodi utilizzando glicolisi con etanolo come il sottoprodotto terminale di tempo)15. In entrambi i casi, fermentazione unità il metabolismo consentendo la sopravvivenza in assenza di ossigeno. L'ipotesi corrente per la sopravvivenza anossico è che così a lungo come HIF1-alfa è attivato durante l'ipossia, la respirazione mitocondriale, senza la necessità di ossigeno, si verifica in condizioni anaerobiche16. Inoltre, è postulato che l'uso di una via fermentativa per sopravvivenza ipossico/anossico migliora la sopravvivenza del tumore dal momento che le cellule evitare stress ossidativo che potrebbe rivelarsi dannosa per la sopravvivenza delle cellule17. Questo postulato è supportato da uno studio recente che mostra che in cardiomiociti, ipossia riduce lo stress ossidativo collocato sul tumore cella17.
Fin qui, la natura essenziale di una via fermentativa per la sopravvivenza della cellula di mammiferi anossico è stata radicata nella letteratura, dovute, in gran parte, ad un'incapacità di cellule di mammifero di cultura in completa assenza di ossigeno per più di 3 giorni. Tuttavia, un'alternativa alla glicolisi per la sopravvivenza anaerobica si verifica nei batteri. In alcuni batteri, azoto o solfato (tra altri composti) può servire come accettori terminali per il sistema del citocromo ossidasi in assenza di ossigeno18. Sebbene l'evoluzione batterica ed eucariotica è avvenuta in parallelo dal divergenti dall'ultimo antenato comune universale, si stima che i mitocondri sono state fornendo energia alle cellule per 1,542 milioni anni prima l'ossigenazione degli oceani19 . Poiché i ricercatori hanno indicato che i mitocondri isolati possono produrre ATP in assenza di ossigeno, con nitrito come accettore terminale di elettroni, è ragionevole supporre che le cellule potrebbero funzionare per periodi di tempo più lungo di 3 giorni in assenza di ossigeno 20 , 21 , 22 , 23. la metodologia descritta in questo studio è un programma di utilità per la crescita di cellule di mammifero anaerobica di numerose linee cellulari.

<table><tbody><tr><td>Whitney A35 anaerobic chamber</td><td>Don Whitley Scientific&amp;nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td>The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>3531</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>Labconco</td><td>DO55735</td><td></td></tr><tr><td>pipet aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>sterile transfer pipets</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-358867</td><td></td></tr><tr><td>50 cc sterile conical centrifuge tubes</td><td>DOT</td><td>451-PG</td><td></td></tr><tr><td>vaccum jar</td><td>Nalgene 111410862889</td><td>BTA-Mall 5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose (4.5 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM low glucose (1 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>VWR</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>VWR</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>sterile pipets</td><td>CellTreat</td><td>229210B, 229205B</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask (T75 or T150)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200263, sc-200264</td><td></td></tr><tr><td>24 well tissue culture treated dishes</td><td>DOT</td><td>667124</td><td></td></tr><tr><td>glad ziplock sandwich bags</td><td>Ziploc</td><td>Costco</td><td></td></tr><tr><td>inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont)</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin microtiter pipets</td><td>Mettler Toledo</td><td>Rainin Classic Pipette PR-100</td><td></td></tr><tr><td>microtiter tips</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-213233 &amp;amp; sc-201717&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>test tube rack (50cc tubes)</td><td>The Lab Depot</td><td>HS29050A</td><td></td></tr><tr><td>sodium nitrite</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&amp;amp;region=US</td><td></td></tr><tr><td>clear boxes with lids</td><td>Rosti Mepal</td><td>Rubber maid</td><td></td></tr><tr><td>paper towels</td><td>In House</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>In house prepared</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tubes sterile</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200273</td><td></td></tr><tr><td>biohazard bags with holder (desktop)</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS10320</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Gloves</td><td>VWR</td><td>89428</td><td></td></tr><tr><td>oxygen electrode</td><td>eDAQ</td><td>EPO354</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Jenway</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>pH paper/ pHydrion</td><td>Sigma Aldich</td><td>Z111813</td><td></td></tr></tbody></table>

anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines

Più superfici mucose insieme i punti medi in tumori e nicchie staminali sono aree geografiche del corpo che sono anossiche. Gli studi precedenti indicano che l'incubazione in condizioni di normossia (5% CO2 nell'aria) o hypoxic condizioni (bassi livelli di ossigeno) seguirono da un risultati di incubazione anossico (un'assenza di ossigeno libero) nell'attuabilità limitato (2 – 3 giorni). Una nuova metodologia è stata sviluppata che consente una coltura cellulare anossica (per almeno 17 giorni; il tempo massimo testato). L'aspetto più critico di questa metodologia è quello di garantire che nessun ossigeno è stato introdotto nel sistema. Ciò si ottiene il degassamento dei media e di lavaggio tubi, piatti, boccette e le pipette con una miscela di gas anaerobico (H2, CO2, N2) seguita da permettendo i materiali per equilibrare l'ambiente anossico (non-ossigeno) prima dell'uso. Maggiore cura deve essere esercitato quando l'acquisizione di microfotografie per garantire che le micrografie ottenute non contengono artefatti. In assenza di ossigeno, la morfologia delle cellule è alterata significativamente. Due morfotipi distinti sono noti per tutte le cellule coltivate in condizioni aerobiche. La capacità di crescere e mantenere le cellule di mammiferi in assenza di ossigeno può essere applicata all'analisi della fisiologia cellulare, interazioni polimicrobica e la caratterizzazione delle vie biosintetiche per lo sviluppo di farmaci innovarici del cancro.

La forza di questo protocollo sta nel suo sostegno la longevità e la crescita di linee cellulari multiple e nel riconoscimento che ci sono una profonda alterazione e la divergenza nella morfologia delle cellule25. L'elemento più critico di questo studio è il trasferimento e la manutenzione delle cellule sotto rigorosa anaerobiosi. Ciò richiede una camera anaerobica organizzato per massimizzare il protocollo (Figura 1) e l'assicuraz...

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Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Crescita anaerobica e la manutenzione di linee cellulari di mammifero

Qui, descriviamo un nuovo metodo che consente la coltivazione anaerobica a lungo termine di linee cellulari stabilizzate. Il tempo di sopravvivenza massima che è stato testato è di 17 giorni. Questo metodo è adatto per la sperimentazione di agenti citotossici ed esplorare la fisiologia di replicare anoxically cellule.

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Views.  Midwestern University. Qui, descriviamo un nuovo metodo che consente la coltivazione anaerobica a lungo termine di linee cellulari stabilizzate. Il tempo di sopravvivenza massima che è stato testato è di 17 giorni. Questo metodo è adatto per la sperimentazione di agenti citotossici ed esplorare la fisiologia di replicare anoxically cellule.

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l&#39;interruttore di crescita metastatica

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Ricerca

Medicina

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Bioingegneria

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Biochimica

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l&#39;espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

Propagazione di<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Immunologia e infezioni

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Biologia

Raccolta del muscolo scheletrico del topo per coltivare cellule staminali e la loro nicchia

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

Autore in primo piano: Protocollo ex vivo per la coltura di cellule staminali muscolari quiescenti con componenti di nicchia 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

Coltura di massa non frazionata di muscolo scheletrico di topo per ricapitolare la quiescenza di nicchie e cellule staminali

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

Crescita anaerobica e la manutenzione di linee cellulari di mammifero

Riepilogo

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Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l'interruttore di crescita metastatica

FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero

La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l'espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

Propagazione di

Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero

Coltura di massa non frazionata di muscolo scheletrico di topo per ricapitolare la quiescenza di nicchie e cellule staminali

Coltura di massa non frazionata di muscolo scheletrico di topo per ricapitolare la quiescenza di nicchie e cellule staminali

Coltura di massa non frazionata di muscolo scheletrico di topo per ricapitolare la quiescenza di nicchie e cellule staminali