Questo metodo può aiutare ad affrontare questioni chiave in neurobiologia, come la polarità dei motoneuroni, la guida dell'assone, il traffico di assone e i meccanismi neurodegenerativi. Il principale vantaggio di questa tecnica è quello di ottenere una cultura del motoneurone altamente arricchita mentre prendiamo per esprimere la nostra proteina knockdown per affetto minuto. Per iniziare questa procedura, mettere un embrione in un piatto di mezzi di dissezione codificati con silicio.
Al microscopio, tenere l'embrione con l'addome contro il silicio con le forcep. Con la seconda coppia di forcep, inserire una delle punte nel canale centrale del midollo spinale rostrad. Quindi, chiudere le forcep per strappare leggermente il tessuto dorsale.
Ripetere questa operazione verso il lato connell fino all'apertura dell'intero midollo spinale. Quindi, posizionare l'embrione in modo che il midollo spinale aperto sia contro il silicio. Successivamente, staccare la parte rostrad del midollo spinale dal corpo.
Pizzicare la parte rostrad del midollo spinale e tirare l'embrione dalla testa per estrarre il midollo spinale. Allontanare con cura tutte le meningi e le DRAG rimanenti ancora attaccate al midollo spinale. Appiattire il midollo spinale sul silicio e usando un bisturi, rimuovere la metà dorsale del cordone tagliando lungo il centro di ciascun lato.
Tagliare la parte centrale in dieci pezzi e trasferirli in un nuovo tubo. Per preparare la sospensione cellulare del midollo spinale, raccogliere i pezzi del midollo spinale nella parte inferiore del tubo. Sostituire HBSS con un millilitro di prosciutto F-10 medio e aggiungere dieci microlitri di tripina.
Incubare il tubo per dieci minuti a 37 gradi Celsius. Per interrompere la digestione enzimatica, trasferire i frammenti in un nuovo tubo da 15 millilitri, contenente 800 microlitri di mezzo L-15 completo, 100 microlitri di 4%BSA e 100 microlitri di DNA e titolazione, due volte. Lasciare che i frammenti si sistemino per due minuti prima di raccogliere il supernatante in un tubo fresco da 15 millilitri.
Aggiungere delicatamente due millilitri di 4%BSA nella parte inferiore del tubo supernatante. Centro fusibile a 470 x gravità per 5 minuti. Dopo 5 minuti, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pallet cellulare con 2 millilitri di mezzo L-15 completo.
Per l'arricchimento del motoneurone, dividere la sospensione cellulare in due tubi da 15 millilitri. Quindi, aggiungere due millilitri di mezzo L-15 PH a ciascun tubo. Se si inizia con sei embrioni, utilizzare l'equivalente di tre embrioni per tubo e tre millilitri di mezzo.
Aggiungere lentamente 2 millilitri di soluzione di grado di densità, sul fondo di ogni tubo per ottenere un'interfaccia nitida. Successivamente, centro fonderlo a 830 x gravità per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo questo passaggio, le piccole cellule dovrebbero essere nella parte inferiore del tubo, mentre le cellule di grandi dimensioni, come il motoneurone, dovrebbero essere alla soluzione gradiente di densità / interfaccia media.
Asperae da 1 a 2 millilitri delle cellule all'interfaccia e trasferirle in un tubo fresco da 15 millilitri. Regolare il volume a dieci millilitri con mezzo L-15 PH. Successivamente, aggiungere due millilitri del cuscino 4%BSA sul fondo dei due tubi.
E fusibile centro a 470 x gravità per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo 5 minuti, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pallet e 3 millilitri di mezzo L-15 completo. Ripetere il centrifugato a 470 x gravità per 5 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pallet cellulare e due millilitri di mezzo di coltura completo. Per coltura dei motoneuroni, diluirli a 5.000-10.000 cellule in 500 microlitri di mezzo di coltura per pozzo in una piastra di 24 pozzi. Quindi, rimuovere la soluzione di lamina con a punta di pipetta P-1,000.
Trasferire immediatamente i motoneuroni diluiti nel mezzo di coltura. alle piastre di codifica per evitare l'asciugatura. Per preparare il DNA, sospendere di nuovo 1 microgrammo di DNA in 50 microlitri di terreno di coltura neuronale.
E vortice per 5 secondi. Per preparare il tubo B, sospendere di nuovo 1,5 microlitri di perline in 50 microlitri di terreno di coltura neuronale. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di perline a 50 microlitri di soluzione di DNA e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
Durante questa incubazione, prelevare 100 microlitri di mezzo di coltura dal pozzo che verrà trasfetto. Successivamente, trasferire 100 microlitri del mix di perline di DNA ad ogni pozzo. E incubare la piastra di 24 pozzi, 20-30 minuti sulla piastra magnetica a 37 gradi Celsius.
Qui è mostrata la morfologia dei neuroni moderna rivelata dalla posizione della catena pesante di neurofilamento non fosforilato endogeno dopo quattro giorni di coltura. In queste immagini, mostra la morfologia dei neuroni modem dopo quattro giorni in vitro e trasfettato per il gene trans EGFP per magnetofezione al secondo giorno. I neuroni motto erano contro-macchiati con il marcatore SMI-32 o il marcatore pan-neuro TUJ-1 e le frecce indicano il soma dei neuroni.
Queste sono le loro immagini confocali di motoneuroni magneto influenzati, che esprimono costrutti NEFH di tipo selvaggio o mutante EGFP e macchiati per il loro marcatore autofagico LC-3B. Le frecce mostrano gli aggregati proteici mutanti EGFP NEFH che sono anche positivi all'LC-3B Seguendo questa procedura, montoholda curcha può essere analizzato mediante microscopia video per visualizzare il traffico di axon e aggiungere alcune linee guida. Dopo il suo sviluppo iniziale per affrontare questioni fondamentali in biologia neurale, questa tecnica si rivela anche un potente strumento per esplorare i meccanismi fisiopatologici che coinvolgono lo spettro dei disturbi del motoneurone, come la malattia da sindrome da shock tossico, la sclerosi laterale trofica samuele o l'atrofia muscolare spinale.
