Name: harvesting venom toxins from assassin bugs and other heteropteran insects
Uploaded: 2018-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects at JoVE.com

Riconosciamo finanziari di sostegno dall'Australian Research Council (sovvenzioni DP130103813 e LP140100832 a G.F.K., DECRA Fellowship DE160101142 a ELHAJEB), l'Australian National Health & Medical Research Council (Principal Research Fellowship APP1044414 a G.F.K.) e la University of Queensland (Postdoctoral Fellowship a A.A.W.).

Questo protocollo conforme alle politiche di The University of Queensland enunciati in Responsible Care e utilizzare degli animali nell'insegnamento e nella ricerca (PPL 4.20.11) così come il National Health e Medical Research Council codice australiano per la cura e uso di animali per fini scientifici (8th edizione 2013).
Attenzione: fare attenzione a non per essere envenomated quando si gestisce assassin bug. Fare attenzione a proteggere gli occhi quando si maneggia la specie che sputare veleno sulla difensiva. Prendersi cura in tutto di non ferire gli animali sperimentali. Questo include il monitoraggio della pressione sulle restrizioni come elastici e garantendo che la proboscide non è rotta.
Nota: Facoltativamente, anestetizzare gli animali tramite l'esposizione al CO2 per 0,5-2 min o raffreddamento a 4-10 ° C prima della raccolta di veleno mira 1-3 per facilitare il trasferimento sicuro e fermo. Anestetizzazione non è strettamente necessaria, ma può facilitare sicuro contenimento degli esemplari agili o forti. Tuttavia, gli animali devono essere svegli per consentire la raccolta di veleno. Mantenere le applicazioni a valle in mente quando si decide o meno di aggiungere gli inibitori della proteasi.
1. tossine veleno da elettrostimolazione di raccolta
<ol><li>Ottenere esemplari vivi da cui raccogliere le tossine.</li>
	<li>Pinzette di plastica pre-preparate di uso con elettrodi positivi e negativi montato su qualsiasi suggerimento. Connettersi elettrificate pinzette un elettrostimolatore o una fonte di tensione costante che permette la regolazione della tensione.<ol>
<li>Per le piccole (~ 10 mm) e grandi (circa 25 mm) assassin bug, utilizzare tensioni di picco di 15 e 25 V rispettivamente.</li>
		<li>Per heteropterans più grandi come insetti giganti di acqua, utilizzare fino a 40 V.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trattenere gli insetti vivi di reggiatura li a una piattaforma, utilizzando un nastro di gomma sopra il torace.</li>
	<li>Posizionare la punta della proboscide in una punta di raccolta adatta. Per assassin bug, usare una punta di pipetta P200. Per insetti giganti di acqua, tagliare l'estremità fuori una punta di P200 per aumentare la dimensione dell'apertura.<ol>
<li>Sollevare la proboscide con un paio di pinzette pulite chiusi delicatamente e spingere il diaframma aperto della collezione punta sopra l'estremità della proboscide.</li>
		<li>Se lo si desidera, prima di mettere la proboscide nella raccolta dell'acqua ultrapura assorbimento ~ 5 µ l suggerimento. Questo riduce le perdite di veleno rimanendo all'interno della punta, anche se il veleno raccolto sarà diluito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Applicare l'elettrostimolazione. Immergere gli elettrodi stimolanti in gel conduttivo, come glicerolo NaCl/50% 2,5 M. Applicare gli elettrodi al torace. Per belostomatids, applicare i due elettrodi di superficie dorsale posteriore della testa.</li>
	<li>Memorizzare il veleno per evitare autodegradation. Dopo veleno viene estruso, rapidamente di trasferirla a un tubo a-20 ° C o da-60 ° C, o un tubo contenente cocktail inibitore della proteasi.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.5 e 1.6 è acquisito sufficiente veleno o nessun ulteriore veleno è imminente.</li>
</ol>2. raccolta delle tossine veleno da molestie
<ol><li>Preparare gli animali per la raccolta del veleno e posizionare la punta della proboscide in un vestibolo di collezione, come descritto nei paragrafi 1.1 e 1.3-1.4.</li>
	<li>Se il veleno viene estruso spontaneamente, passare al punto 2.3. In caso contrario, molestare gli animali toccandola delicatamente sulle gambe, addome e antenne con pinzette fino a quando il veleno è prodotto.</li>
	<li>Trasferire rapidamente il veleno in una provetta a-20 ° C o da-60 ° C o un inibitore della proteasi che contengono tubo cocktail, se lo si desidera.</li>
</ol>3. raccolta delle tossine veleno da molestie da Venom "Sputare" specie
<ol><li>Anestetizzare, o anestetizzare parzialmente, l'insetto prima di rimuoverla dal suo alloggiamento per prevenire qualsiasi prematuro sputare sulla difensiva.</li>
	<li>Provocare il comportamento di sputare veleno. Contenere e riposizionare l'insetto con il coperchio profondo della standard 90 x 16mm di Petri. Tenere il coperchio leggermente posteriore e 1-4 cm sopra l'insetto per impedire il volo. Maggior parte degli insetti sputerà spesso parecchie volte, in rapida successione. Garantire che tutti i venom sono raccolti sul lato inferiore del piatto.</li>
	<li>Raccogliere il veleno sulla parte inferiore del piatto Petri risciacquando con 10 µ l di acqua ultrapura. Rapidamente di trasferirlo in un tubo a-20 ° C o da-60 ° C, o un tubo contenente cocktail inibitore della proteasi.</li>
</ol>4. raccolta Venom tossine tramite la dissezione della ghiandola
<ol><li>Sacrificare gli animali. Pesantemente anestetizzare o uccidere animali utilizzando > 5min esposizione al CO2. Tubo puro CO2 direttamente in aria-fori della recinzione di alloggiamento dell'animale.</li>
	<li>Insetto di pin al vassoio di dissezione. Per assassin bug, dissecare attraverso la superficie ventrale (4.3). Per insetti giganti di acqua, dissecare attraverso la superficie dorsale (4.4).</li>
	<li>Dissezione ventrale<ol>
<li>Inserire tre perni nell'addome posteriore per mantenere l'insetto senza perforare le ghiandole velenifere.</li>
		<li>Tagliare un'incisione del midline breve nella superficie ventrale dell'addome usando un bisturi in miniatura. Usare le forbici in miniatura per estendere l'incisione del midline anteriormente alla testa, avendo cura di tagliare l'esoscheletro solo e non danneggiare strutture interne.</li>
		<li>Per esporre le strutture interne, rendono più tagli laterali che si estende dall'incisione del midline al lato dell'insetto. Quindi, pin indietro ogni lembo di esoscheletro ventrale per rivelare strutture interne.</li>
		<li>Per grande assassino insetti, fare quattro incisioni laterali, in metà di-addome, anteriore addome, tra le gambe di prime e seconda e di fronte la prima tappa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissezione dorsale<ol>
<li>Rimuovere le ali vicino alla base. Inserire tre perni nell'addome posteriore per mantenere l'insetto senza perforare le ghiandole velenifere.</li>
		<li>Tagliare un'incisione mediana dalla testa all'addome con delle miniatura forbici, bisturi, avendo cura di tagliare l'esoscheletro solo e non danneggiare strutture interne.</li>
		<li>Forza a parte le due metà dell'insetto. Posto diversi pin lateralmente lungo la lunghezza dell'insetto per lasciare la cavità interna esposta.</li>
		<li>Rimuovere i muscoli di volo con una pinzetta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inondare il vassoio di dissezione. Aggiungere PBS fino a quando il bug è sommerso per consentire strutture interne galleggiano ed essere più facilmente visualizzati.</li>
	<li>Micro-forbici e pinzette, rimuovere delicatamente con connettivo e tessuto nervoso e della trachea. Le ghiandole velenifere appaiono come allungata, costruzioni trasparenti che si estendono lungo ciascun lato del canale alimentare.<ol>
<li>Identificare la ghiandola principale per il suo aspetto caratteristico, con lobi anteriori e posteriori e due condotti incontro al hilus.</li>
		<li>Se lo si desidera, è possibile identificare la ghiandola accessoria tracciando il condotto da hilus. Gratis la ghiandola principale tagliando i due condotti che emana dal hilus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere i lumen della ghiandola desiderata. Trasferire la ghiandola in una microcentrifuga sul ghiaccio contenente 30 µ l di PBS o PBS più inibitore di proteasi cocktail. Lancia le ghiandole con un pin pulito tagliente.<ol>
<li>Vortexare per 10 s e centrifugare (1 min, 5.000 × g, 4 ° C) per svuotare i lumen della ghiandola. Rimuovere il tessuto ghiandolare con una pinzetta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chiarire l'Estratto di tossina. Centrifugare (5 min, 17.000 × g, 4° C) per rimuovere eventuali particelle solide, conservando il supernatante e scartando il pellet. Conservare a-20 ° C o da-60 ° C per evitare la degradazione di autoproteolytic.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venoms+of+heteropteran+insects:+A+treasure+trove+of+diverse+pharmacological+toolkits.">Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits.</a> Toxins. 8 (2), 43 (2016).</li><li>Ribeiro, J. M. C., Assump&#231;&#227;o, T. C., Francischetti, I. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+the+sialomes+of+bloodsucking+Heteroptera.">An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera.</a> Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).</li><li>Ambrose, D. P., Maran, S. P. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La fase più critica nella raccolta del veleno assassin bug sta selezionando il metodo appropriato a seconda della finalità dello studio. Ognuno dei tre metodi presentati per la raccolta heteropteran veleni ha vantaggi e svantaggi a seconda delle applicazioni a valle.
Inducendo il bug di espellere il veleno da proboscide (protocolli 1-3) evita la contaminazione del veleno dai tessuti ghiandolari. Inoltre, questi metodi sono non-letale e possono essere ripetuti più volte nel corso della vita ...

Heteropteran veleni sono sostanze bioattive potentemente1. Ad esempio, le secrezioni di veleno/saliva di sangue-alimentazione Heteroptera come kissing bugs (eziologico) e cimici (Cimicidae) facilita l'alimentazione interrompendo l'emostasi2. Tossine in questi veleni bersaglio vie multiple compreso coagulazione, aggregazione piastrinica e vasocostrizione, come pure il dolore e prurito vie. Veleni dalla maggior parte delle altre specie di heteropteran sono adattati per facilitare la predazione, piuttosto che sangue-alimentazione. Loro veleni causano paralisi, morte e liquefazione del tessuto quando iniettato in invertebrati3,4. Quando iniettato in vertebrati, il loro veleno può anche avere effetti drastici. Ad esempio, l'iniezione di veleno dal assassin bug Holotrichius interno nei vertebrati provoca dolore, paralisi del muscolo e l'emorragia; topi envenomated da questo bug muoiono rapidamente a causa di paralisi respiratoria5.
Trascrittomica e proteomica hanno rivelato la composizione proteica di alcuni veleni di heteropteran. Veleni di specie selvatiche sono ricchi di proteasi, altri enzimi e peptidi e proteine di struttura sconosciuta e funzione6,7,8. Bug baciare veleno è ricca di famiglia delle proteine triabin, i cui membri influenzano profondamente la coagulazione, l'aggregazione piastrinica e vasocostrizione2,9. Tuttavia, non è noto quali tossine sono alla base della maggior parte bioattività di veleno. Ad esempio, il veleno del bug baciare Triatoma infestans è stata segnalata per essere analgesico ed inibire i canali di sodio10, ma i componenti responsabili restano delucidare. Allo stesso modo, non è noto quali componenti di assassin bug veleno causano paralisi o dolore. Un prerequisito per l'identificazione le tossine responsabili bioattività particolare veleno e per la caratterizzazione di struttura e funzione delle tossine veleno romanzo, è l'ottenimento di veleno.
Veleno è stata ottenuta da heteropterans da elettrostimolazione5,6,7,8,11,12,13, provocazione di difensivo le risposte4,8, meccanicamente comprimendo il torace12,14,15,16, dissezione veleno ghiandole8,17 ,18,19,20,21,22e applicazione di agonisti del recettore muscarinico23. A giudicare i potenziali vantaggi e gli svantaggi di ogni metodo è complicata dalla morfologia delle ghiandole velenifere heteropteran, che consistono di una ghiandola principale con due separati lumen, la ghiandola principale anteriore (AMG) e la ghiandola principale posteriore (PMG), nonché un associato ghiandola accessoria (AG). Questi scomparti di diverse ghiandole producono secrezioni proteiche diverse, che possono essere specializzate per le diverse funzioni biologiche tra cui la cattura di prede, difesa e digestione extra-orale8,17. In peiratine ed ectrichodiine assassin bug, la AMG è stata associata con la cattura di prede e il PMG con digestione extra-orale17. Tuttavia, nel harpactorine bug Pristhesancus plagipennis PMG è specializzata per la cattura di prede e digestione mentre la AMG è supposto a secernere veleno difensivo8. L'AG è stato descritto come avendo poco funzione secretiva in assassin bug8 o come un importante sito di stoccaggio di proteasi in insetti giganti acqua23. Chiaramente, ulteriore lavoro è necessario per chiarire la funzione di ciascun comparto di ghiandola tra vari sottogruppi di heteropteran e per determinare la funzione della maggior parte delle tossine del veleno. In questo rapporto descriviamo i protocolli per la raccolta le tossine veleno da heteropterans verso questo obiettivo.

<table><tbody><tr><td>Electostimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>S48 Square Pulse Stimulator</td><td>Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation</td></tr><tr><td>Featherlight tweezers</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E122B</td><td>For handling live venomous insects</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma</td><td>4693124001</td><td>For preventing autoproteolytic digestion of venom</td></tr><tr><td>Dissection equipment</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E152Micro</td><td>For fine dissections</td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E162</td><td>For fine dissections</td></tr></tbody></table>

harvesting venom toxins from assassin bugs and other heteropteran insects

Heteropteran insetti ad esempio assassin bug (Reduviidae) e insetti giganti di acqua (Belostomatidae) discendono da un antenato comune selvatiche e velenoso, e la maggior parte dei heteropterans esistenti conserva questa strategia trofica. Alcuni heteropterans hanno effettuato la transizione a nutrire il sangue dei vertebrati (ad esempio i bug baciare, eziologico; e cimici, Cimicidae) mentre gli altri sono ritornati all'alimentazione sulle piante (la maggior parte Pentatomomorpha). Tuttavia, con l'eccezione della saliva utilizzata da kissing bugs per facilitare l'alimentazione di sangue, poco è conosciuta circa i veleni di heteropteran rispetto ai veleni di ragni, scorpioni e serpenti.
Un ostacolo alla caratterizzazione delle tossine del veleno di heteropteran è la struttura e la funzione delle ghiandole labiali/veleno, che sono entrambi morfologicamente complessa e svolgere più ruoli biologici (difesa, cattura di prede e digestione extra-orale). In questo articolo, descriviamo tre metodi che abbiamo usato con successo per raccogliere heteropteran veleni. In primo luogo, vi presentiamo l'elettrostimolazione come un modo pratico per raccogliere il veleno che è spesso letale quando iniettato in preda di animali, e che previene la contaminazione di tessuto ghiandolare. In secondo luogo, indichiamo che dolce molestie degli animali sono sufficiente a produrre estrusione di veleno dalla proboscide e/o veleno sputare in alcuni gruppi di heteropterans. In terzo luogo, descriviamo i metodi per raccogliere le tossine veleno tramite la dissezione di animali anestetizzati per ottenere le ghiandole velenifere. Questo metodo è complementare ad altri metodi, come può consentire la raccolta delle tossine da taxa in cui l'elettrostimolazione e molestie sono inefficaci. Questi protocolli permetterà ai ricercatori di raccogliere le tossine da insetti di heteropteran per la caratterizzazione di struttura-funzione e possibili applicazioni in medicina e agricoltura.

Alcune specie di heteropteran, come harpactorine p. plagipennis e il reduviine Platymeris rhadamanthus, resa in modo affidabile grandi quantità (5-20 µ l) di veleno in risposta all'elettrostimolazione (tabella 1). In generale, peiratine, reduviine e harpactorine maggior parte dei bug resa veleno in risposta a questo metodo. Tra stenopodaine bug, elettrostimolazione ha suscitato veleno da sp. Oncocephalus ma non Thodelmus sp. I bug di ...

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Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Anche se molti insetti in sottordine Heteroptera (Insecta: Hemiptera) sono velenoso, loro composizione del veleno e le funzioni delle loro tossine del veleno sono per lo più sconosciute. Questo protocollo descrive i metodi per la raccolta heteropteran veleni per ulteriore caratterizzazione, mediante elettrostimolazione, molestie e dissezione della ghiandola.

Raccolta le tossine veleno da Assassin Bugs e altri insetti Heteropteran

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

13.0K Views.  The University of Queensland. Anche se molti insetti in sottordine Heteroptera (Insecta: Hemiptera) sono velenoso, loro composizione del veleno e le funzioni delle loro tossine del veleno sono per lo più sconosciute. Questo protocollo descrive i metodi per la raccolta heteropteran veleni per ulteriore caratterizzazione, mediante elettrostimolazione, molestie e dissezione della ghiandola.

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Helminth Collection and Identification from Wildlife

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths. The four major types of helminths are &#34;roundworms&#34; (nematodes), &#34;thorny-headed worms&#34; (acanthocephalans), &#34;flukes&#34; (trematodes), and &#34;tapeworms&#34; (cestodes). The optimum method for collecting helminths is to examine a host that has been dead less than 4-6 hr since most helminths will still be alive. A thorough necropsy should be conducted and all major organs examined. Organs are washed over a 106 &#956;m sieve under running water and contents examined under a stereo microscope. All helminths are counted and a representative number are fixed (either in 70% ethanol, 10% buffered formalin, or alcohol-formalin-acetic acid). For species identification, helminths are either cleared in lactophenol (nematodes and small acanthocephalans) or stained (trematodes, cestodes, and large acanthocephalans) using Harris&#39; hematoxylin or Semichon&#39;s carmine. Helminths are keyed to species by examining different structures (e.g. male spicules in nematodes or the rostellum in cestodes). The protocols outlined here can be applied to any vertebrate animal. They require some expertise on recognizing the different organs and being able to differentiate helminths from other tissue debris or gut contents. Collection, preservation, and staining are straightforward techniques that require minimal equipment and reagents. Taxonomic identification, especially to species, can be very time consuming and might require the submission of specimens to an expert or DNA analysis.

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths.&#160; The four major types of helminths are &#8220;roundworms&#8221; (nematodes), &#8220;thorny-headed worms&#8221; (acanthocephalans), &#8220;flukes&#8221; (trematodes), and &#8220;tapeworms&#8221; (cestodes).&#160; Here we describe how helminths are collected from a vertebrate animal and how they are preserved and taxonomically identified.&#160;

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths. The four major types of helminths are &#34;roundworms&#34; (nematodes), ...

Ricerca

Ambiente

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages include high potential yield, use of non-arable land and integration with waste streams. The nutrient requirements of a large-scale microalgae production system will require the coupling of cultivation systems with industrial waste resources, such as carbon dioxide from flue gas and nutrients from wastewater. Inorganic contaminants present in these wastes can potentially lead to bioaccumulation in microalgal biomass negatively impact productivity and limiting end use. This study focuses on the experimental evaluation of the impact and the fate of 14 inorganic contaminants (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn) on Nannochloropsis salina growth. Microalgae were cultivated in photobioreactors illuminated at 984 &#181;mol m-2 sec-1 and maintained at pH 7 in a growth media polluted with inorganic contaminants at levels expected based on the composition found in commercial coal flue gas systems. Contaminants present in the biomass and the medium at the end of a 7 day growth period were analytically quantified through cold vapor atomic absorption spectrometry for Hg and through inductively coupled plasma mass spectrometry for As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn. Results show N. salina is a sensitive strain to the multi-metal environment with a statistical decrease in biomass yieldwith the introduction of these contaminants. The techniques presented here are adequate for quantifying algal growth and determining the fate of inorganic contaminants.

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

Quantificazione dei metalli pesanti e altri contaminanti inorganici sulla produttività delle microalghe

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both "corpse assays" and "bite assays" on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.

Saggio comportamenti alimentari predatori in<em&gt; Pristionchus</em&gt; E altri nematodi

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

Estrazione di pesticidi di organochlorato da pellicole di plastica e analisi di tipo plastico

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in the Earth&#39;s atmosphere, a central process in meteorology, hydrology, and for the climate system. But because specific extraction and characterization of these compounds have been lacking for decades, very little is known on their identity, properties, mode of action and origins, thus preventing the full understanding of cloud formation and its potential links with the Earth&#39;s ecosystems.
In this paper we present recently developed methods for 1) the targeted extraction of all the surfactants from atmospheric aerosol samples and for the determination of 2) their absolute concentrations in the aerosol phase and 3) their static surface tension curves in water, including their Critical Micelle Concentration (CMC). These methods have been validated with 9 references surfactants, including anionic, cationic and non-ionic ones. Examples of results are presented for surfactants found in fine aerosol particles (diameter &#60;1 &#956;m) collected at a coastal site in Croatia and suggestions for future improvements and other characterizations than those presented are discussed.

Methods are presented for the targeted extraction of surfactants present in atmospheric aerosols and the determination of their absolute concentrations and surface tension curves in water, including their Critical Micelle Concentration (CMC).

Estrazione e caratterizzazione di tensioattivi da Atmospheric Aerosol

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Parassita artificiale dell'ospite mediante Trichogramma dendrolimi ed estrazione del veleno

Extracting Venom from the Parasitoid Wasp Trichogramma dendrolimi Using an Artificial Host

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, parasitoid wasps inject venom into their hosts to suppress their hosts&#39; immunity, modulate hosts&#39; development, metabolism, and even behavior. With over 600,000 estimated species, the diversity of parasitoid wasps surpasses that of other venomous animals, such as snakes, cone snails, and spiders. Parasitoid wasp venom is an underexplored source of bioactive molecules with potential applications in pest control and medicine. However, collecting parasitoid venom is challenging due to the inability to use direct or electrical stimulation and the difficulty in dissection because of their small size. Trichogramma is a genus of tiny (~0.5 mm) egg parasitoid wasps that are widely used for the biological control of lepidopteran pests in both agriculture and forests. Here, we report a method for extracting venom from T. dendrolimi using artificial hosts. These artificial hosts are created with polyethylene film and amino acid solutions and then inoculated with Trichogramma wasps for parasitism. The venom was subsequently collected and concentrated. This method enables the extraction of large amounts of Trichogramma venom while avoiding contamination from other tissues caused by dissection, a common issue in venom reservoir dissection protocols. This innovative approach facilitates the study of Trichogramma venom, paving the way for new research and potential applications.

Autore in primo piano: Metodo efficiente di estrazione del veleno dalle vespe parassitoidi Trichogramma 

Here, we present a protocol for extracting venom from Trichogramma dendrolimi using an artificial host created with polyethylene film and amino acid solution.

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, ...

Biochimica

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of developing offspring 1,2. Spiders accomplish these tasks by spinning several distinct fiber types that have diverse mechanical properties. Such specialization of fiber types has occurred through the evolution of different silk-producing glands, which function as small biofactories. These biofactories manufacture and store large quantities of silk proteins for fiber production. Through a complex series of biochemical events, these silk proteins are converted from a liquid into a solid material upon extrusion.
Mechanical studies have demonstrated that spider silks are stronger than high-tensile steel 3. Analyses to understand the relationship between the structure and function of spider silk threads have revealed that spider silk consists largely of proteins, or fibroins, that have block repeats within their protein sequences 4. Common molecular signatures that contribute to the incredible tensile strength and extensibility of spider silks are being unraveled through the analyses of translated silk cDNAs. Given the extraordinary material properties of spider silks, research labs across the globe are racing to understand and mimic the spinning process to produce synthetic silk fibers for commercial, military and industrial applications. One of the main challenges to spinning artificial spider silk in the research lab involves a complete understanding of the biochemical processes that occur during extrusion of the fibers from the silk-producing glands.
Here we present a method for the isolation of the seven different silk-producing glands from the cobweaving black widow spider, which includes the major and minor ampullate glands [manufactures dragline and scaffolding silk] 5,6, tubuliform [synthesizes egg case silk] 7,8, flagelliform [unknown function in cob-weavers], aggregate [makes glue silk], aciniform [synthesizes prey wrapping and egg case threads] 9 and pyriform [produces attachment disc silk] 10. This approach is based upon anesthetizing the spider with carbon dioxide gas, subsequent separation of the cephalothorax from the abdomen, and microdissection of the abdomen to obtain the silk-producing glands. Following the separation of the different silk-producing glands, these tissues can be used to retrieve different macromolecules for distinct biochemical analyses, including quantitative real-time PCR, northern- and western blotting, mass spectrometry (MS or MS/MS) analyses to identify new silk protein sequences, search for proteins that participate in the silk assembly pathway, or use the intact tissue for cell culture or histological experiments.

Here we describe an efficient strategy to remove the silk-producing glands from the abdomen of female black widow spiders. This procedure allows the rapid isolation of the seven distinct silk-producing glands in a highly purified fashion, an important process for investigators studying spider silk production and fiber assembly.

Microdissezione di Black Widow Spider Silk ghiandole che producono

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

Biologia

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

Raccolta le tossine veleno da Assassin Bugs e altri insetti Heteropteran

Riepilogo

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Helminth Collection and Identification from Wildlife

Quantificazione dei metalli pesanti e altri contaminanti inorganici sulla produttività delle microalghe

Saggio comportamenti alimentari predatori in

Estrazione di pesticidi di organochlorato da pellicole di plastica e analisi di tipo plastico

Estrazione e caratterizzazione di tensioattivi da Atmospheric Aerosol

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Microdissezione di Black Widow Spider Silk ghiandole che producono

Estrazione di Venom Venom e Gland Microdissections da Spiders per proteomica e analisi trascrittomica