Name: intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia at JoVE.com

Questo progetto è stato sostenuto dal NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 e dipartimento di Scienze clinica diffusione fondi

Per questi esperimenti, tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della North Carolina State University.
1. preparazione per la cultura
Nota: Tutti i reagenti sono elencati nella Tabella materiali. Concentrazioni di specifici fattori di crescita sono elencate nella tabella 1.
<ol><li>Preparare una soluzione 0,5 M di acido (EDTA) etilendiamminotetracetico in acqua distillata deionizzata (ddH2O). Mescolare in modo adeguato e regolare il pH a 7,4 utilizzando soluzioni di NaOH o HCl. Nota: Compongono soluzione EDTA fresco prima di ogni esperimento.</li>
	<li>Preparazione del reagente di dissociazione #1 (DR #1) come segue e metterli su ghiaccio: soluzione tampone fosfato di combinare senza Ca2 + e Mg2 + (PBS), 0,5 M EDTA, 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT), 10 µM Y27632 e 1 soluzione X antibiotico-antimicotica (Anti-Anti) contenenti penicillina, streptomicina e anfotericina b. Nota: Aggiungere Y27632 immediatamente prima della raccolta del tessuto.</li>
	<li>Preparazione del reagente di dissociazione #2 (DR n. 2) come indicato di seguito e inserire in bagnomaria a 37 ° C: combinare PBS senza Ca2 + e Mg2 +, EDTA 0.5 M, 10 µM Y27632 e 1 X anti-Anti. Nota: Aggiungere Y27632 immediatamente prima della raccolta del tessuto.</li>
	<li>Preparare i supporti delle cellule staminali epiteliali intestinali (IESC) come segue: Mix 25 mL advanced medium DMEM/F12 con 1 supplemento N2 X, 1 X B-27 supplemento, 10 mM HEPES, 2mm Glutamax e 1 X anti-Anti. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.</li>
	<li>Preparare un mix master di fattore di crescita ridotta della membrana dello scantinato matrix (matrice) e fattori di crescita supplementari come segue: scongelare la matrice sul ghiaccio. In un tubo del microcentrifuge, aggiungere 100 ng/mL Noggin umana ricombinante, 500 ng/mL 1 R-Spondin umano ricombinante, 50 ng/mL ricombinante umano fattore di crescita epidermico (EGF), 100 ng/mL Wnt3a umana ricombinante, 10mm nicotinammide, gastrina nM 10, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 e 2,5 µM glicogeno sintasi chinasi 3 inibitore (GSK3i, CHIR99021). Quando la matrice è scongelata, completare con il mix di fattore di crescita (facendo mix master) e memorizzare sul ghiaccio. Nota: Fare attenzione per evitare di introdurre bolle d'aria come questo creerà artefatto entro la patty di matrice durante placcatura.</li>
	<li>Pre-riscaldare un piatto di coltura del tessuto 24 pozzetti in un incubatore a 37 ° C prima di iniziare le procedure di isolamento delle cellule.</li>
</ol>2. modello chirurgico di Ischemia e di raccolta del tessuto
<ol><li>Uso da otto a dieci-settimana-vecchio Yorkshire incrociate maiali di entrambi i sessi (scelta consigliata). Rimuovere tutti i mangimi 16-18 h prima della chirurgia. Consentire l'accesso all'acqua in ogni momento suini.</li>
	<li>Pianificare i maiali di arrivare almeno 48 h prima degli esperimenti per consentire ambientale acclimatazione. Nota: Tecnici veterinari e/o laboratorio preparati sotto la supervisione di un veterinario autorizzato forniscono routine cura degli animali e assistenza con procedure anestetiche.</li>
	<li>Wow il maiale con xilazina (1,5 mg/kg per via intramuscolare (IM)) e ketamina (11-20 mg/kg (IM))15. Una volta calmo, intubare la orotracheally di maiale.</li>
	<li>Mantenere i maiali in anestesia generale con isoflurano (2-5%) vaporizzato in 100% O2 fino al momento dell'eutanasia.</li>
	<li>Posizionare un catetere endovenoso (IV) (vena orecchio consigliato) e amministrare un fluido sostitutivo come soluzione di Ringer lattato suonerie a un tasso di mantenimento di 15 mL/kg/h.</li>
	<li>Eseguire la routine di anestetico monitoraggio compreso pulsossimetria, elettrocardiografia e indiretta pressione sanguigna misure15. Monitorare la frequenza respiratoria e sforzo del maiale e ventilare manualmente o meccanicamente come necessario se end tidal CO2 supera i 55-60 mmHg. Nota: L'anestesia appropriata è confermata dal continuo monitoraggio delle tendenze nella frequenza cardiaca (gamma 80-130 battiti/min), pressione sanguigna non invasiva (media pressione arteriosa 75-100 mmHg) e frequenza respiratoria (10-25 respiri/min)16e controllo periodico per assenza di mascella e tono anale. Profondità dell'anestesia può anche essere giudicato da grado di rilassamento muscolare e fascicolazioni muscolari segue stimolo chirurgico. Riflessi oculari sono di solito di nessun valore16. L'analgesia può essere fornito come diretto dalla politica istituzioni IACUC. In questo caso, un oppiaceo, come la buprenorfina, può essere somministrato durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Posizionare il maiale su un rilievo di riscaldamento e trattengono in decubito dorsale per la procedura chirurgica.</li>
	<li>Radere l'addome ventrale e prepara con scrub chirurgico (soluzione di clorexidina) e alcool isopropilico.</li>
	<li>Fare un'incisione di 8-10 cm ventrale del midline usando un bisturi centrato al umbilicus per accedere all'addome.</li>
	<li>Identificare il piccolo intestino (digiuno) circa 40 cm per via orale alla giunzione ileocecale. Delineare il loop lungo dieci-cm del digiuno legando circonferenzialmente intestino due volte, uno cm tra ogni legatura, prima di creare successive loops 10cm trova oralmente (Figura 1).</li>
	<li>Creare due cicli per ogni punto di tempo di ischemia adiacente a vicenda, uno per ischemia e uno per ischemia con un ulteriore 1h di riperfusione se lo si desidera. Per creare l'ischemia completa (nessun flusso di arterie o vene), morsetto o legare il sistema vascolare mesenterico usando pinze vascolari bulldog, emostatiche di zanzara Halstead curvi o seta non riassorbibile 2-0 per 1, 2, 3 e 4h e quindi rimuovere Morse per 1h di riperfusione, se lo si desidera. Nota: Gli autori creato tutti i cicli di ischemia in ordine a partire con il ciclo ischemico di 4h e progredito in movimento prossimalmente (minimizzare il tempo totale di chirurgia). Per affrontare la possibilità che la vicina ischemici segmenti intestinali può danneggiare spire adiacenti, l'ordine dei cicli ischemici può essere variata. Questo può alterare il tempo chirurgico totale. Nota: L'intervallo di tempo di riperfusione può essere variata basata sulla domanda di ricerca di interesse o se terapie volete essere testato durante il periodo di riperfusione. Tuttavia, come danno di tessuto diventa più grave dall'aumentare le durate di ischemia da solo, riperfusione probabilmente non contribuisce a ulteriori lesioni epiteliali. Riperfusione probabilmente un ruolo seguenti periodi lieve della lesione ischemica.</li>
	<li>Tra i punti di tempo di ischemia, tenere l'addome coperti o chiusi utilizzando un asciugamano sterile e/o un morsetto di asciugamano. Nota: All'interno di un singolo animale per questo esperimento, otto segmenti ischemici possono essere creati. Identificare un segmento aggiuntivo del digiuno, almeno 5-10 cm prossimale all'ultimo anello ischemico, che servirà come un normale controllo interno.</li>
	<li>Ostruire circa tre vasi mesenterici per bulldog morsetto vascolare o curvo pinza emostatica di zanzara di Halstead. Deve prestare attenzione durante l'applicazione del laccio emostatico perché i vasi sono facilmente traumatizzati. Tenta di impilare i vasi all'interno delle mascelle dei morsetti.</li>
	<li>Alla fine dell'esperimento, seguente l'eutanasia con pentobarbital 85-100 mg/kg IV, raccogliere tutti i cicli del tessuto utilizzando forbici metzenbaum, dopo la morte è stata confermata senza battito cardiaco auscultati con perdita del riflesso corneale. Iniziare raccogliendo un pezzo di controllo di digiuno normale almeno 5 - 10 cm prossimale all'ultimo anello ischemico.</li>
	<li>Separano e raccolgono il loop da ogni punto del tempo di ferita in piccoli contenitori di PBS freddo ghiaccio fino al momento per l'isolamento di cripta. Nota: Se lo si desidera, fare ischemico loop abbastanza a lungo per dividere in campioni separati per istologia e cultura intestinale delle cellule staminali; Tuttavia, gli autori hanno trovato che gli anelli superiori a circa 10 cm di lunghezza sono più probabili di diventare emorragica.</li>
</ol>3. cripta (cellule staminali) isolamento da ischemico e loop di controllo
<ol><li>Inverti ogni ciclo di piccolo intestino utilizzando un calibro 20 filo e pinze per esporre la superficie mucosa. Legare la parte superiore e inferiore del ciclo in modo sicuro al filo mediante sutura (2-0 non assorbibili seta o equivalente).</li>
	<li>A seguito di inversione, sciacquare ogni ciclo in PBS freddo ghiaccio per rimuovere i detriti luminal.</li>
	<li>Posizionare il campione immediatamente in provette coniche da 50 mL contenente DR #1 sul ghiaccio per 30 min.</li>
	<li>Raccogliere i cicli iniziano con controllo e seguire con cicli di aumento incrementale durate di ischemia. Loop da meno tessuto danneggiato (cioè 1 h e controllo tessuto ischemico) può essere agitato con forza, rompersi il polso per ottenere i migliori risultati. Tessuti dai tessuti gravemente danneggiati (3 e 4 h di ischemia) dovrebbero essere dolcemente cullati o invertiti solo come troppa agitazione provocherà cripta rottura e distruzione di tessuto supplementare. Tubi dovrebbero essere scossi o invertiti ogni 5 min mentre il ghiaccio.</li>
	<li>Trasferire i campioni in DR #2 per 10 min in bagnomaria a 37° C. Scuotere o invertire tubi ogni 5 min.</li>
	<li>Dopo aver trasferito i tessuti, centrifugare le provette coniche contenenti DR #1 dai loop 2-4 h danneggiato per rimuovere il surnatante EDTA (200 x g per 5 min). Come questi tessuti sono altamente danneggiati è possibile che le cripte hanno già diventare dissociate. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con un piccolo volume di PBS (5 mL) e procedere al punto 3.9.</li>
	<li>Rimuovere i campioni da DR #2 e inserire direttamente i campioni di tessuto 25 mL di PBS freddo sul ghiaccio (etichetta come lavare n. 1). Posizionare i campioni su agitatore orbitale su ghiaccio a 60 giri/min. Continuare a scuotere o capovolgere ogni provetta per 30 s ogni 2-5 min.</li>
	<li>Dopo aver trasferito i tessuti, spin le provette coniche contenenti DR #2 da 2-4 h danneggiato con passanti per rimuovere il surnatante EDTA (200 x g per 5 min). Come questi tessuti sono altamente danneggiati è possibile che le cripte hanno diventare dissociate. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con un piccolo volume di PBS (5 mL) e procedere al punto 3.9.</li>
	<li>Rimuovere un'aliquota di 50 µ l dal lavaggio #1 (o dal DR) per verificare il grado di dissociazione di cripta e quantità di detriti. Posizionare il tessuto in una nuova provetta conica 50 mL (Wash #2, #3, ecc.) riempito con 25 mL di PBS freddo e agitare fino a cripte intatte sono isolati con detriti minimal e villi. Nota: L'obiettivo è di essere in grado di isolare una frazione pulita con cripte intatte ed i residui minimi. Ogni ulteriore lavaggio pulirà le cellule tuttavia troppo agitazione inizierà a provocare il danno secondario dei tessuti/cellule. Inoltre, i migliori risultati con meno contaminazione si realizzerà se cripte sono rivestiti da una fase di lavaggio e non da un passo di reagente di dissociazione.</li>
	<li>Rimuovere il tessuto restante e centrifugare le provette coniche da 50 mL a 200 x g per 5 minuti per rimuovere il surnatante, quindi risospendere restanti il pellet cripta nel più piccolo volume di PBS (5 mL).</li>
	<li>Utilizzando un microscopio invertito, esaminare 50 aliquote µ l di ogni campione per determinare il numero di cripte o frazione. L'obiettivo è di 50-100 µ l di cripte/50, come questa sarà la dimensione del mondo di patty di matrice finale. Nota: Se il campione è troppo concentrato, continuare ad aggiungere PBS freddo fino a quando non viene raggiunta la concentrazione desiderata. Se il campione è troppo diluito, determinare il numero di aliquote necessarie per raggiungere la resa desiderata cripta e regolare.</li>
	<li>Aliquotare volumi appropriati delle cripte (determinati dall'aliquotare osservazioni) in un tubo del microcentrifuge. Ad esempio, se il campione contiene 50 µ l di cripte/50 poi aliquota 50 µ l per patty X3 replica = 150 µ l / tubo del microcentrifuge. Se il campione contiene solo 25 µ l di cripte/50 poi 2 aliquote necessarie / patty X 3 replica = 300 µ l/tubo.</li>
	<li>Cripte di pellet a 200 x g per 5 min a 4° C.</li>
	<li>Risospendere delicatamente pellettati cripte con volume appropriato di mix master (50 µ l per pozzetto). Mescolare accuratamente pipettando rapidamente 15 volte senza creare bolle d'aria. Nota: Pre-raffreddare la punta della pipetta con PBS freddo sterile prima di aspirare il mix master. Questo vi aiuterà a mantenere il mix master dalla diffusione. Suggerimenti possono essere conservati in frigorifero e collocati nella cappa immediatamente prima dell'uso.</li>
	<li>Erogare una 50 mix master µ l plus gocciolina cripta nel centro di ciascun pozzetto di una piastra ben 24 pre-riscaldato.</li>
	<li>Incubare la piastra di coltura per 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Sovrapposizione di ogni tortino di matrice con 500 µ l / pozzo di media IESC (senza ulteriori fattori di crescita necessari il giorno 0 come si trovassero all'interno del master mix).</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l PBS sterile eventuali pozzetti inutilizzati a sinistra sulla piastra per mantenere l'umidità.</li>
	<li>Contare il numero di cripte placcati il giorno 0. Nota: È utile per pre-griglia ogni cella cultura piastra in quadranti per contribuire a garantire il conteggio più preciso.</li>
	<li>Contare il numero di enterospheres ogni 24h e monitorare per lo sviluppo di enteroid al giorno.</li>
	<li>Aggiungere fattori di crescita per ogni bene ogni 48 h. rimuovere il supporto IESC ogni 96 ore e sostituire con media fresco di 500 µ l (fattori di crescita deve essere aggiunto ai media).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation.">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li><li>Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+gastrointestinal+ischemic+injury.">Treatment of gastrointestinal ischemic injury.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).</li><li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemia-reperfusion-induced+intestinal+injury:+progress+and+promise+for+translational+research.">Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).</li><li>Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+and+inflammation.+V.+Innate+mechanisms+of+mucosal+defense+and+repair:+the+best+offense+is+a+good+defense.">Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense.</a> Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).</li><li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+clinical+manifestations,+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury.">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li><li>Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+injury+of+the+intestine+and+protective+strategies+against+injury.">Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury.</a> Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).</li><li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+models+of+digestive+disease:+the+future+of+large+animal+translational+research.">Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research.</a> Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Meneses, A. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids-Current+and+future+applications.">Intestinal organoids-Current and future applications.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 31 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy.">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).</li><li>Swindle, M. M., Smith, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging &amp; Experimental Techniques, 3rd Ed. , (2015).</li><li>Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , (1995).</li><li>Parks, D. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+ischemia+and+reperfusion+to+mucosal+lesion+formation.">Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation.</a> Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).</li><li>Schoenberg, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+neutrophils+in+postischaemic+damage+to+the+small+intestine.">Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine.</a> Gut. 32 (8), 905-912 (1991).</li><li>Nilsson, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+and+pathogenesis+during+ischemia+and+reperfusion+of+the+cat+small+intestine.">Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine.</a> Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).</li><li>Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ischemia/reperfusion+tolerance+in+the+rat+small+intestine.+An+epithelium-independent+event.">Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event.</a> J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).</li><li>Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+reperfusion+injury+an+important+cause+of+mucosal+damage+after+porcine+intestinal+ischemia.">Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia.</a> Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).</li><li>Shegarfi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CCN1+(Cyr61)+in+a+porcine+model+of+intestinal+ischemia/reperfusion.">Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion.</a> Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).</li><li>Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+intestinal+ischemia-reperfusion+injury.">Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Lo sviluppo di un modello porcino di ischemia intestinale segmentale si espande sulla precedenti modelli murini consentendo per lo studio di più punti di tempo della lesione del tessuto all'interno dello stesso animale. Ci sono diversi punti di discussione critica del presente protocollo, tra cui la legatura corretta nave, riperfusione del tessuto e coltura cellulare successo cripta.
La legatura vaso corretto è fondamentale per la creazione di un modello di ischemia completa. Se la sutura è legata in modo non uniforme o il morsetto non serrate completamente, sangue dall'arteria pareti spesse può continuare ad immettere il tessuto e non è possibile uscire a causa del crollo della vena con pareti sottili. In questo modo lo stravaso di sangue nella lamina propria causando danni di tessuto supplementare. Tuttavia, a seconda del tipo di lesione ischemica in fase di studio, ischemia completa o emorragica può essere desiderato. Ad esempio, nel processo di trapianto intestinale, intestino è completamente separato dal rifornimento vascolare (arteria e vena) durante la fase di resezione della procedura, che si traduce in ischemia intestinale completa. In alternativa, tuttavia, quando il mesentere è contorto durante un evento come un volvolo intestinale, il ritorno venoso è spesso ostacolato in primo luogo, che conduce sangue addizionale all'interno del tessuto prima di essere il rifornimento arterioso occluso, creando così ischemia emorragica.
Lesione ischemica provoca danni ai tessuti inizia sulla punta del villo e si estende fino alla base della cripta3. Durante l'ischemia, energia sotto forma di trifosfato di adenosina continua ad essere utilizzata e genera l'ipoxantina metabolita. Quando il tessuto è reperfused con ossigeno, ipoxantina diventa metabolizzato dalla xantina ossidasi e produce radicali liberi superossido che conduce alla ferita mucosa e l'attrazione del tessuto danneggiando i neutrofili17,18. Differenze tra specie in architettura vascolare della mucosa così come espressione variante della xantina ossidasi, causare vari gradi di riperfusione lesioni3. Felini e roditore modelli di ischemia-riperfusione sono più suscettibili alla riperfusione da metaboliti reattivi dell'ossigeno19,20. Al contrario, maiali sono stati trovati per avere meno xantina ossidasi e conseguenza meno riperfusione, rendendo questo modello più paragonabile a quella di ischemia intestinale umano21. In questo momento, l'utilizzo di Ko o modelli transgenici suini per lo studio di lesione intestinale non è stata descritta, rendendo questo una limitazione importante di questo modello. Selezione del modello animale adeguato dipende dal processo di malattia o condizione specifica il ricercatore desidera studiare. Ad esempio, modelli porcine della lesione ischemica fino a 6 h sono stati descritti22, considerando che le procedure più ischemiche in modelli murini sono 45-60 min23.
Successo isolamento delle cripte intestinali dall'intestino normale e ischemically danneggiato consente lo studio di recupero epiteliale nella cultura. Questo sistema consente al ricercatore di concentrarsi unicamente sull'epitelio da solo, come c'è rifornimento non vascolare o componente delle cellule immuni da considerare. Questo offre l'opportunità di studiare le interazioni delle cellule epiteliali e recupero dopo la lesione oltre alla risposta a diversi fattori di crescita, o trattamenti somministrati durante chirurgia o seguente cripta isolamento completando i terreni di coltura. Questo passaggio rimane il più difficile, come isolamento dai loop gravemente danneggiato richiede agitazione delicata e la rimozione rapida delle soluzioni contenenti EDTA nel caso in cui le cripte hanno diventare prematuramente dissociati. Se queste anse dell'intestino non vengono lavate accuratamente, le cripte hanno il potenziale per diventare contaminato nella cultura. Di conseguenza, soluzione antibiotico antimicotico inserito in entrambe le soluzioni DR oltre i media IESC. Un altro punto di discussione si concentra sull'intestino raccolto come un normale controllo. Come gli animali subiscono l'anestesia con possibili alterazioni in perfusione tissutale sistemica, assieme alla possibilità di circolanti di mediatori infiammatori secondarie ad ischemia, tessuto di controllo anche "normali" non può rappresentare un vero controllo. In questi esperimenti, è di nota che il tessuto di controllo è sembrato grossolanamente ed istologicamente paragonabile al tessuto da animali che non subissero l'ischemia in altri esperimenti (Gonzalez, L.M., dati non pubblicati, 2017).
In sintesi, questo metodo viene descritto un modello riproducibile di ischemia intestinale porcina, che modella molto attentamente ciò che avviene nella lesione ischemica umana. Inoltre, l'isolamento di cellule staminali intestinale da loop ischemico è descritto, che serve per studiare la riparazione epiteliale e possibile risposta al trattamento nella cultura.

Lesione ischemica intestinale, il risultato della disponibilità di ossigeno in diminuzione a causa di una riduzione o l'occlusione completa del flusso di sangue all'intestino, rimane una causa significativa della morbosità e della mortalità in pazienti umani e animali1,2. Danno ischemico, con conseguente infiammazione e infiltrazione cellulare, conduce al compromesso di barriera mucosa. La barriera mucosa è fondamentale per la prevenzione della traslocazione batterica e tossine associate nella circolazione sistemica3,4. La successiva riperfusione dei tessuti ischemici può provocare la formazione di danneggiare specie reattive dell'ossigeno che possono esacerbare la ferita5. Da ischemia intestinale è raramente evitabile, ricerca più corrente è stato incentrato sulla promozione di tecniche per la diagnosi precoce di ischemia e lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici che riducono la riparazione della mucosa di riperfusione lesioni o destinazione.
Modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per ampliare le nostre conoscenze di scienza di base di ischemia-riperfusione e rimanere imperativo per ricerca traslazionale. Modelli di roditori sono stati il più ampiamente usato dovuto la loro capacità di essere geneticamente manipolati6. Più recentemente, tuttavia, l'uso di modelli animali grandi, in particolare il maiale, è stato sostenuto per futuri studi traslazionali a causa di una serie di vantaggi, tra cui le somiglianze di anatomici e fisiologici di maiali a esseri umani7,8. Una varietà di modelli di lesione sono stati sviluppati per lo studio di ischemia-riperfusione e includono l'occlusione vascolare completa, ischemia di flusso debole e occlusione vascolare mesenterica segmentale. Una recensione completa di questi modelli è di fuori del Regno di questo articolo tuttavia gli autori diretta ai lettori di una recente revisione3.
Oltre ai modelli in vivo , l'uso di ex vivo sistemi di coltura cellulare offre uno strumento promettente per lo studio dell'omeostasi intestinale e riparazione dopo la lesione. Cellule staminali intestinali sono responsabili della proliferazione cellulare e fatturato del rivestimento epiteliale intestinale. Quando isolato dall'intestino normale o ferito, cellule staminali intestinali possono essere mantenute in coltura e servire come uno strumento o un modello per lo studio delle cellule staminali e biologia delle cellule epiteliali. Metodi per isolare e stabilire questi tridimensionale cultura sistemi (chiamati enteroids e colonoids quando derivato dal piccolo e grande intestino, rispettivamente) sono stati descritti per una varietà di specie e organo sistemi9,10 ,11,12,13. In particolare, all'interno del tratto gastrointestinale, questi sistemi di coltura sono stati utilizzati per la malattia gastrointestinale compreso cancro, agente patogeno infezione e malattia di viscere infiammatoria14modello. In questo momento, non ci sono rapporti che descrive l'isolamento e la manutenzione delle cellule staminali intestinale dal tenue ischemically feriti in ogni specie. Di conseguenza, qui descriviamo il processo di ischemia intestinale in un romanzo, grande modello animale porcino che provoca lesioni riproducibile e la capacità di isolare cellule staminali intestinale dall'intestino normale e ischemically ferito per l'ulteriore studio di recupero ex vivo.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP-399</td><td>Dilute 1:10</td></tr><tr><td>Distilled, deionized water (ddH2O)</td><td></td><td></td><td>Used to prepare EDTA and PBS</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED45</td><td>Make fresh before each experiment; pH 7.4</td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Anti-Anti solution</td></tr><tr><td>Recombinant human Wnt-3a</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>5036 WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Rspondin1</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>4645- RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Noggin</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Human [leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Water, WFI Quality</td><td>Corning, Inc.</td><td>25-055-CM</td><td>Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, GFR</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Phenol red free</td></tr><tr><td>24 Well Culture Dish</td><td>Corning, Inc.</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube, 50 ml&amp;nbsp;</td><td>Corning, Inc.</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Steel Surgical Blade, No. 10</td><td>World Precision Instruments</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>Debakey Tissue Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501239</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501752</td><td>Curved or straight</td></tr><tr><td>Metzenbaum Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501739</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Forceps, Curved</td><td>World Precision Instruments</td><td>503724-12</td><td>Curved or straight (503728-12)</td></tr><tr><td>Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Stoelting Co.</td><td>52120-40P</td><td>Straight</td></tr><tr><td>Silk, 2-0&amp;nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>685S-BUT</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>Towel Clamps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>Wire suture, 20 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>19075</td><td>Cut and straighten before use.</td></tr><tr><td>Surgical Towels</td><td>Henry Schein</td><td>ST1833</td><td>Any similar product is acceptable.</td></tr><tr><td>Lactated Ringers Solution</td><td>Henry Schein</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhex antiseptic scrub (4%)</td><td>Henry Schein</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol 70%</td><td>Henry Schein</td><td>MS071HS</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>IV catheter, 22 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>2225PUR</td><td>May need 20g or 24 g depending on size of the vein</td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6835-1</td><td>Controlled medication</td></tr><tr><td>Isoflurane solution</td><td>Henry Schein</td><td>10015516</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))</td><td>Vortech Pharm.</td><td></td><td>Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.</td></tr><tr><td>Heating pad&amp;nbsp;</td><td>Gaymar</td><td></td><td>Tpump Core Warming System; others are available.</td></tr><tr><td>Mindray Datascope Monitor</td><td>Mindray North America</td><td></td><td>Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable</td></tr><tr><td>Vaporizer&amp;nbsp;</td><td>Vetland Medical</td><td></td><td>Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.</td></tr><tr><td>Fluid Pump</td><td>Abbott Hospira</td><td></td><td>Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.</td></tr></tbody></table>

intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia

Ischemia intestinale rimane una causa importante di morbilità e mortalità in pazienti umani e veterinari. Molti processi di malattia causare ischemia intestinale, quando il rifornimento di sangue e quindi ossigeno è diminuita all'intestino. Questo porta alla perdita di barriera intestinale e danni al tessuto sottostante. Cellule staminali intestinali risiedono alla base delle cripte di Lieberkühn e sono responsabili per rinnovo intestinale durante l'omeostasi e lesione seguente. Tecniche di coltura ex vivo delle cellule hanno permesso per il riuscito studio delle interazioni delle cellule staminali epiteliali stabilendo condizioni di coltura che supportano la crescita dei sistemi organo-come epiteliali tridimensionali (chiamato "enteroids" e" colonoids"dal piccolo e grande intestino, rispettivamente). Questi enteroids sono composti da cripta e villi coriali-come i dominii e maturo per contenere tutti i tipi di cellulare trovati all'interno dell'epitelio. Storicamente, i modelli murini sono stati utilizzati per studiare la lesione intestinale. Tuttavia, un modello porcino offre diversi vantaggi tra cui la somiglianza di dimensioni così come gastrointestinale anatomia e fisiologia a quello degli esseri umani. Utilizzando un modello porcino, stabiliamo un protocollo in cui il loop segmentale di ischemia intestinale possono essere creati all'interno di un singolo animale, consentendo lo studio di differenti punti della lesione ischemica tempo e riparare in vivo. Inoltre, descriviamo un metodo per isolare e coltura delle cellule staminali intestinali dai loop ischemica dell'intestino, consentendo lo studio continuo di riparazione epiteliale, modulata dalle cellule staminali, ex vivo.

Ischemia intestinale completa è stata creata in piccole anse intestinali utilizzando occlusione vascolare con sutura o i morsetti come mostrato in Figura 1. Rilasciando i morsetti, può essere eseguito un controllata periodo di riperfusione, consentendo lo studio supplementare della successiva riperfusione se lo si desidera. Tutti gli animali sopravvissero durante la procedura con la minima complicazione fino ad eutanasia. La più comune complicanza chirurgica era ipotensione, che ha risolto con il completamento di un inotropa positiva come dobutamina.
Se eseguita correttamente, la lesione ischemica inizierà sulla punta del villo intestinale e migrare verso il basso all'interno della cripta, come la durata di aumenti di ischemia (Figura 2). Un errore comune con la tecnica chirurgica può verificarsi quando i vasi sanguigni non sono legati o fissati in modo uniforme. Il risultato è un'ischemia emorragica (Figura 3), in cui la vena sottili crolla prima l'arteria, consentendo ulteriori sangue di infiltrare i tessuti. Questo è visto grossolanamente come una superficie serosal viola scura (Figura 3, a sinistra) rispetto ad una superficie più chiara durante ischemia completa (Figura 3, destra).
A seguito di rimozione delle anse intestinali ischemiche, cripte intestinali sono stati correttamente isolati seguendo il protocollo di dissociazione (Figura 4). Come previsto, le cripte da punti temporali più severamente danneggiato spesso erano rotti (f; frammento) e frazioni di cripta conteneva più detriti cellulari di sfondo rispetto a quelli che hanno subito di no o lievi danni. Durante il protocollo, l'intestino gravemente infortunato deve essere agitata delicatamente per evitare ulteriori danni al tessuto sottostante. Agitando troppo approssimativamente può causare ulteriori danni di cripta e la maggior parte delle cripte finendo nella DR soluzioni contenenti EDTA, conseguente rottura aggiuntiva.
Una volta placcato, cripte da tutti i punti di tempo di ischemia sopravvivono e sono in grado di stabilirsi in cultura (Figura 5). Quando cripte intestinali normali e lievemente danneggiati sono placcati in cultura, enterospheres forma entro 24-48 h. Con grave danno ischemico (3 e 4 h), cripte intestinali sopravvivono ma sono danneggiate, causando la formazione di sfere molto più piccoli inizialmente. Da 72-120 h, enteroids diventano più complesse con evidente lumen centrale e strutture in erba. Nel complesso, c'è un'efficienza di crescita è diminuito delle cripte e anche una dimensione ridotta di enteroids derivato dal tessuto intestinale gravemente danneggiato (Gonzalez, L.M., dati non pubblicati, 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> Figura 1 : Modello chirurgico di ischemia intestinale completa in un modello porcino. A) normale digiuno porcina esteriorizzato. B) mesenteriche vasi sono state legate con sutura creazione di ischemia intestinale. C) ischemia creato utilizzando pinze vascolari bulldog per consentire riperfusione del tessuto se lo si desidera. D) intestinale vascolarizzazione immediatamente dopo rimozione dei morsetti vascolari. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> Figura 2 : Prova istologica (ematossilina ed eosina (H & E) macchia) di aumentare il danno epiteliale seguendo le durate più lunghe di ischemia intestinale completa. Danni inizia sulla punta del del villo con graduale perdita dello strato epiteliale unicellulare, villo smussamento e danno cellulare che si estende verso il basso per la cripta base con lesioni gravi (durata fino a 4 h). barra della scala 100 µm. Io = Ischemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> Figura 3 : Prova lorda ed istologica di ischemia emorragica. A) lorda fotografia confrontando l'ischemia emorragica (loop di sinistra) e ischemia completa (loop di destra). Quando il sistema vascolare non è legato o fissato uniformemente, sangue può continuare a infiltrare i tessuti, con conseguente ulteriore infiammazione e danno. B) H & E immagini di ischemia emorragica di aumento della durata da 1-4 h. Oltre al danno cellulare visto con ischemia completa, c'è prova di infiltrazione di globuli rossi all'interno della lamina propria circostante. barra della scala 100 µm. Io = Ischemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> Figura 4 : Aliquote delle cripte intestinali isolati dai cicli dell'intestino ischemico e normale. Completi, intatti cripte intestinali (asterischi) sono stati correttamente isolati da ogni ansa dell'intestino. Come previsto, le cripte da più punti di tempo gravemente danneggiato spesso erano rotti (f; frammento) e frazioni di cripta conteneva più detriti cellulari di sfondo rispetto a quelli che hanno subito di no o lievi danni. barra della scala 100 µm. Io = Ischemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> Figura 5 : Corso di tempo di crescita intestinale delle cellule staminali dopo isolamento da loop ischemica dell'intestino tenue. Quando cripte intestinali normali erano cromate nella cultura, enterospheres formata entro 24-48 h. Con grave danno ischemico (3 e 4 h), cripte sopravvivono ma formano inizialmente molto più piccole sfere. Da 72-120 h, enteroids diventano più complesse con evidente lumen centrale e strutture in erba. 20 µm scala bar se non diversamente. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Fattore di crescita</td>
			<td>Diluente</td>
			<td>Concentrazione d'archivio</td>
			<td>Diluizione di stock</td>
			<td>Diluizione di lavoro</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>1 µ g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zucca</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>FEG</td>
			<td>10mM acido acetico</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>500 µ g/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 ΜM</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinammide</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2.</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrina</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>2,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 µ g/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: tabella dei fattori di crescita di reagente. Sintesi delle soluzioni di riserva del fattore di crescita e soluzioni di lavoro utilizzate nel presente protocollo.

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia at JoVE.com

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Questo protocollo consentirà ai lettori di stabilire con successo un modello porcino di ischemia intestinale segmentale e successivamente isolare e coltura di cellule staminali intestinali per lo studio della riparazione epiteliale dopo la lesione.

Isolamento delle cellule staminali intestinale e cultura in un modello porcino di segmentale piccola Ischemia intestinale

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

intestinal-stem-cell-isolation-culture-porcine-model-segmental-small

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K Views.  North Carolina State University. Questo protocollo consentirà ai lettori di stabilire con successo un modello porcino di ischemia intestinale segmentale e successivamente isolare e coltura di cellule staminali intestinali per lo studio della riparazione epiteliale dopo la lesione.

Video: Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

L&#39;ingegneria dei tessuti del colon in un modello murino

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Ricerca

Bioingegneria

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Modello murino di ischemia-riperfusione intestinale Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Medicina

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Immunologia e infezioni

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Mixed colture primarie di murino tenue finalizzate allo studio di Gut secrezione dell&#39;ormone e imaging cellulare dal vivo di celle enteroendocrine

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Biologia

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Isolamento del mesenchima intestinale murino con conseguente alta resa di telociti

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, such as gastric dilatation volvulus (GDV), mesenteric torsion, and colic, are observed in animals such as dogs and horses. An initial interruption of blood flow causes tissues to become ischemic. Although necessary to salvage viable tissue, subsequent reperfusion can induce further injury. The main mechanism responsible for IRI is free radical formation upon reperfusion and reintroduction of oxygen into damaged tissue, but there are many other components involved. The resulting local and systemic effects often impart a poor prognosis. 
Intestinal IRI has been the subject of extensive research over the past 50 years. An in vivo rodent model in which the base of the superior mesenteric artery (SMA) is temporarily ligated is currently the most common method used to study intestinal IRI. Here, we describe a model of intestinal IRI utilizing isoflurane anesthesia in 21% O2 medical air that yields reproducible injury, as demonstrated by consistent histopathology of the small intestines. Tissue injury was also assessed in the colon, liver, and kidneys.

We describe how to generate a widely used surgical model of intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) in rodents. The procedure involves occlusion of the superior mesenteric artery followed by the restoration of blood flow. This model is useful for studies investigating occlusive causes of intestinal IRI in both veterinary and human medicine.

Modello di roditore di danno da ischemia-riperfusione intestinale attraverso l'occlusione dell'arteria mesenterica superiore

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Purificazione delle isole suine mediante perfusione chirurgica del pancreas suino

Surgical Perfusion and Isolation of the Porcine Pancreas for Islet Isolation

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet xenotransplantation offers a promising alternative to allotransplantation, with the potential for large-scale production of on-demand, functional islets. The yield and viability of isolated islets is highly susceptible to the quality of the donor pancreas and the method of procurement, particularly the duration of warm-ischemia time. To improve organ preservation and subsequent islet yield and viability, we have developed a protocol for surgical perfusion and resection of the porcine pancreas. This protocol employs direct infrarenal aortic cannulation and organ perfusion to both minimize warm-ischemia time and simplify the procedure for operators who do not have extensive surgical expertise. Subsequent arterial perfusion of the pancreas via the aorta flushes stagnant blood from the microvasculature, thereby reducing thrombosis and oxidative damage to the tissue. This manuscript provides a detailed protocol for surgical perfusion and resection of the porcine pancreas, followed by islet isolation and purification.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Tecniche e sfide nella purificazione delle isole per lo xenotrapianto

This protocol provides a step-by-step guide for the procurement of a porcine pancreas for islet isolation and purification.

Perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per l'isolamento delle isole

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, nutrients, metabolites, pathogens, and the microbiota. Methods to culture intestinal organoids are now available for multiple species, including pigs, which is a species of major interest both as a farm animal and as a translational model for humans, for example, to study zoonotic diseases. Here, we give an in-depth description of a procedure used to culture pig intestinal 3D organoids from frozen epithelial crypts. The protocol describes how to cryopreserve epithelial crypts from the pig intestine and the subsequent procedures to culture 3D intestinal organoids. The main advantages of this method are (i) the temporal dissociation of the isolation of crypts from the culture of 3D organoids, (ii) the preparation of large stocks of cryopreserved crypts derived from multiple intestinal segments and from several animals at once, and thus (iii) the reduction in the need to sample fresh tissues from living animals. We also detail a protocol to establish cell monolayers derived from 3D organoids to allow access to the apical side of epithelial cells, which is the site of interactions with nutrients, microbes, or drugs. Overall, the protocols described here is a useful resource for studying the pig intestinal epithelium in veterinary and biomedical research.

Here, we describe a protocol to culture pig intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts. We also describe a method to establish cell monolayers derived from 3D organoids, allowing access to the apical side of epithelial cells.

Coltura di organoidi intestinali 3D di maialino da cripte epiteliali crioconservate e creazione di monostrati cellulari

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Isolamento delle cellule staminali intestinale e cultura in un modello porcino di segmentale piccola Ischemia intestinale

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

L'ingegneria dei tessuti del colon in un modello murino

Modello murino di ischemia-riperfusione intestinale Injury

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Mixed colture primarie di murino tenue finalizzate allo studio di Gut secrezione dell'ormone e imaging cellulare dal vivo di celle enteroendocrine

Isolamento del mesenchima intestinale murino con conseguente alta resa di telociti

Modello di roditore di danno da ischemia-riperfusione intestinale attraverso l'occlusione dell'arteria mesenterica superiore

Perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per l'isolamento delle isole

Perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per l'isolamento delle isole

Perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per l'isolamento delle isole

Coltura di organoidi intestinali 3D di maialino da cripte epiteliali crioconservate e creazione di monostrati cellulari