GLP-1 immuno-test sono stati eseguiti dal Nucleo biochimica Laboratorio Analisi dell&#39;Ospedale di Addenbrooke. Questo lavoro ha, nel corso degli anni, è stato sostenuto dalla Wellcome Trust (attualmente sovvenzioni attivi 106262 / Z / 14 / Z e 106263 / Z / 14 / Z) e il Medical Research Council (MRC) (sovvenzioni MRC_MC_UU_12012 / 3 e MRC_MC_UU_12012 / 5).

Tutte le procedure di animali sono stati approvati dalla University of Cambridge Animal Welfare ed etico organo di valutazione ed adeguato alle Animali (Procedure Scientifiche) Act del 1986 Emendamento regolamenti (SI 2012/3039). 1. Preparazione in anticipo <ol><li> Mettere un&#39;aliquota di matrice di membrana basale (BMM) (~ 200 mL) sul ghiaccio a sciogliersi. NOTA: Il BMM solidifica a temperatura ambiente (RT). </li><li> Preriscaldare 50 mL sterile ad alta glucosio Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (senza aggiunte) e ~ 40 mL cultura sterile media (DMEM high-glucosio supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), 100 U / mL di penicillina e 0,1 mg / mL di streptomicina (P / S), e 2 mM L-glutammina) in 50 mL provette da centrifuga in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Pre-freddo calcio e magnesio contenenti salina tamponata con fosfato (PBS). </li><li> Pesare 15 mg di collagenasi (XI greggio), aggiungere un tubo da 50 ml centrifuga e tenerlo in ghiaccio. <ol><li&gt; ATTENZIONE: Collagenasi è nocivo. Esso provoca irritazione della pelle (H315) e grave irritazione oculare (H319). Può provocare sintomi allergici o asmatici o difficoltà respiratorie se inalato (H334). Essa può causare irritazione respiratoria (H335). Utilizzare dispositivi di protezione adeguati, evitando la formazione di polvere e inalare polvere. Assicurare una adeguata ventilazione. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Collection <ol><li> Aggiungere 20 ml di L-15 di media ~ ad un tubo da 50 ml per centrifuga e posizionarlo sul ghiaccio. </li><li> Eutanasia un topo per dislocazione cervicale, o altro metodo approvato pianificazione 1. NOTA: intestinale tessuto è tipicamente ottenuto da topi su uno sfondo C57BL6. Tuttavia, altri sfondi genetici sono stati utilizzati anche per esempio 129 / SvEv 15. Esperimenti di imaging richiedono l&#39;uso di topi indicatori fluorescenti es GLU-Venere 1. Il tessuto è ottenuto da topi adulti (2-6 mesi) di entrambi i sessi. I topi sono alloggiati in individuagabbie con ad libitum accesso all&#39;acqua e chow regolare lly ventilato. Tuttavia, gli esperimenti per testare l&#39;effetto di una dieta ricca di grassi, ad esempio, sulla funzione delle cellule enteroendocrine 16 può essere eseguita se supportato da una licenza del progetto. </li><li> Sezionare e rimuovere delicatamente intestino mouse (dal piloro dell&#39;inizio della retto) con pinze e forbici dissezione. Conservarlo in media L-15 sul ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 3. Preparazione del tessuto <ol><li> Posizionare tessuto intestinale in una capsula di Petri 10 centimetri contenente PBS sufficiente a coprire il tessuto. Prendere 10 cm di tessuto desiderato (es superiore dell&#39;intestino tenue, primi 10 cm, distali al piloro). </li><li> Lavare contenuto intestinale usando una pipetta Pasteur di plastica e rilassato PBS. <ol><li> Utilizzando pinze, delicatamente presa un&#39;estremità del segmento intestinale e posizionare la punta di una pipetta Pasteur in esso. Lavare contenuti con refrigerata PBS. Ripetere da entrambe le estremità fino a quando il majorezza dei contenuti è stato stanato. Trasferimento in una capsula di Petri pulito contenente fresche, refrigerate PBS. </li></ol></li><li> Utilizzando pinze, rimuovere il tessuto adiposo e mesentere, avendo cura di non tirare fuori lo strato muscolare allo stesso tempo. </li><li> Sbucciare il muscolo strato off &quot;come un calzino&quot; sotto un microscopio da dissezione utilizzando due set di pinza sottile. NOTA: Questo passaggio non è essenziale, ma è altamente raccomandato. Ci sono modi alternativi di rimozione dello strato muscolare a quello descritto qui. Ad esempio, l&#39;intestino può essere sezionato longitudinalmente prima, prima della rimozione dello strato muscolare. <ol><li> Trovare un punto di partenza al termine più prossimale del tessuto in cui c&#39;è un lembo visibile del muscolo. Delicatamente tirare via una piccola quantità di tessuto muscolare tutto intorno l&#39;intestino. NOTA: per evitare la lacerazione dello strato muscolare o l&#39;epitelio intestinale, ridurre la forza di tensione serrando una superficie maggiore anziché utilizzare il tips delle belle pinze. </li><li> Bloccare l&#39;intestino e tanto del lembo muscolo possibile estrarre lentamente a parte e iniziare staccava lo strato muscolare intorno l&#39;intestino. Per evitare di strappare sia lo strato muscolare ed epitelio, mantenere reimpostato la posizione della pinza per tenerli ravvicinati. In questo modo, rimuovere lo strato muscolare della intera lunghezza del segmento intestinale e scarti. </li></ol></li><li> Tagliare l&#39;intestino aperta longitudinalmente e lavare agitando in un piatto pulito Petri con fresche refrigerate PBS. Ripetere, se necessario, per rimuovere ogni residuo di chimo o muco. </li><li> Tessuto tritare con una lama di bisturi chirurgico per raggiungere piazze di ~ 1-2 mm 2 e aggiungere questi per ~ 20 mL raffreddato PBS in una provetta da centrifuga da 50 ml con una pipetta Pasteur. Per evitare pezzi di tessuto che attaccano alla pipetta, tagliare la punta e bagnare la pipetta triturando con PBS. </li><li> Agitare delicatamente il tubo per lavare ulteriormente i pezzi di tessuto. Lasciare che il tessuto di stabilirsi e di versare o pipette fuori la maggior parte della PBS e ripetere con PBS fresco fino a quando la PBS sembra chiaro. </li></ol> 4. Preparazione di BBM-rivestito Piastra / Piatti e digestione Media NOTA: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in una cappa coltura tissutale (con fasi di incubazione a 37 ° C bagnomaria). <ol><li> Preparare una soluzione BMM 2% in DMEM freddo (senza aggiunte). Mentre si lavora, tenere la soluzione su ghiaccio. Per una soluzione al 2%, aggiungere 140 microlitri scongelato BMM a 7 ml DMEM (sufficiente per preparare una singola piastra da 24 pozzetti). <ol><li> Aggiungere 250 microlitri 2% soluzione BMM per pozzetto (24-pozzetti) o al bicchiere fondo piatto imaging. </li><li> Incubare rivestiti piatti / piatti per almeno 30 minuti in un incubatore a 37 ° C per consentire un&#39;adeguata polimerizzazione della BMM. </li></ol></li><li> Aggiungere il DMEM 50 mL pre-riscaldato (senza aggiunte) alla collagenasi 15 mg (da Piazza di 1.2 e 1.4) per formare una soluzione di 0,3 mg / ml e invertire a dissolversi. <ol><li> Soprace completamente sciolto, utilizzando una siringa da 20 ml, filtrata la soluzione di collagenasi attraverso un filtro sterile da 0,2 pm in una nuova provetta sterile 50 centrifuga. Etichettare questo come mezzo di digestione. </li></ol></li></ol> 5. Tessuto Digestione <ol><li> Rimuovere i pezzi di tessuto dalla PBS usando una pipetta 10 ml sierologica e aggiungere un sterile provetta da centrifuga da 50 mL contenente DMEM sterile raffreddata (senza aggiunte), turbolenza e quindi rimuovere DMEM. NOTA: per evitare tessuto attaccare alla pipetta sierologica, bagnò mediante triturazione con DMEM prima del contatto con il tessuto. </li><li> &#39;Digest&#39; 1 e 2: rimozione di detriti cellulari e cellule singole <ol><li> Aggiungere 7 ml di medio digestione per i pezzi di tessuto e dare il tubo di un vortice. </li><li> Incubare per 5 minuti in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Agitare delicatamente (non agitare) il tubo per ~ 3 s. </li><li> Lasciare che il tessuto di stabilirsi ed eliminare il mezzo di digestione, riservando unpiccolo volume a guardare sotto il microscopio. NOTA: Soprattutto quando si inizia, si consiglia vivamente di ispezionare un piccolo volume di ogni &#39;digerire&#39; (~ 30 mL) sotto il microscopio per valutare lo stato di avanzamento del processo di digestione. Se molti cripte sono osservati in questa fase, l&#39;agitazione può essere troppo vigorosa. Per le immagini rappresentative di ciò fasi diversa &#39;digest&#39; tipicamente assomigliano, fare riferimento alla Figura 1. </li><li> Ripetere i punti 5.2.-5.2.4 (con media digestione fresco). </li></ol></li><li> &#39;Digest&#39; 3-5: raccolta di frammenti cripta <ol><li> Aggiungere 7 ml di medio digestione al tessuto. </li><li> Incubare per 10 minuti a 37 ° C. <ol><li> Durante l&#39;incubazione, agitare ogni 5 minuti per 10-12 s. NOTA: L&#39;agitazione è più vigorosa rispetto al agitazione per &#39;digest&#39; 1 e 2. </li></ol></li><li> Lasciare che il tessuto non digerito di stabilirsi e raccogliere il mezzo di digestione in una provetta 15 centrifuga. Seil tessuto viene raccolto accidentalmente e il mezzo, permettono di risolvere, rimuoverlo usando una pipetta sierologica 10 mL e le trasferisce di nuovo al tubo da centrifuga da 50 mL contenente il tessuto non digerito. </li><li> Centrifuga raccolto medio / supernatante a RT per 3 min a 100 x g. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno di coltura pre-riscaldato mediante triturazione dolce e messo da parte. </li><li> Ispezionare un piccolo volume di sospensione cellulare al microscopio (vedi nota dal punto 5.2.4). NOTA: Idealmente, frammenti cripta iniziano a comparire in &#39;digerire&#39; 3 insieme a detriti cellulari e singole cellule. &#39;Digest&#39; 4 e 5 contengono un numero significativamente maggiore di frammenti cripta con ridotta detriti cellulari (Figura 1). Regolare scuotendo intensità come necessità, ossia se il tessuto non è digerire e frammenti cripta non stanno comparendo, agitare più vigorosamente. </li><li> Ripetere passaggi 5.3.1-5.3.6 fino al 5 &#39;digest&#39; sono staticompletato o finché è stato digerito la maggior parte del tessuto (a 6 ° digest può essere richiesto). </li><li> Una volta che tutti i supernatanti da &#39;digest&#39; 3-5 (o 3-6) sono state raccolte, centrifugare la digerire sopranatanti a temperatura ambiente per 3 min a 100 x g. </li><li> Per gli esperimenti di secrezione, combinare i surnatanti da &#39;digest&#39; 3-5 (o 3-6) prima della centrifugazione. NOTA: meno tessuto è necessaria per esperimenti di imaging, quindi scegliere il surnatante digest che è il più pulito (assenza di detriti cellulari e cellule singole) con il maggior numero di frammenti cripta. Questo è in genere &#39;digerire&#39; 4 o 5. </li><li> Eliminare il supernatante e delicatamente risospendere il pellet triturando fino grumi sono visibili. Risospendere il precipitato in mezzo di coltura pre-riscaldato supplementato con 10 pM Y-27632 dicloridrato (per evitare anoikis 17). Utilizzare 5 mL per esperimenti di secrezione e 2 mL di terreno di coltura per esperimenti di imaging. </li><li> Filtrosospensione cellulare attraverso un filtro da 100 micron (per rimuovere qualsiasi tessuto non digerito). Eseguire un ulteriore 2 ml di terreno di coltura pre-riscaldato attraverso il filtro di lavare (volume totale: 7 ml e 4 ml di secrezione e di imaging, rispettivamente). NOTA: Il filtro non è essenziale, tuttavia, frammenti di tessuto grandi non tendono ad aderire alle piastre / stoviglie. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> Figura 1: Immagini rappresentative di &#39;digest&#39; dal piccolo metodo di coltura intestinale primitiva. (A) materiale tipica dalla &#39;digest&#39; 1 e 2 contenente cellule principalmente singole e detriti cellulari. (B) Un esempio di prodotti di &#39;digerire&#39; 3. Le frecce nere indicano frammenti cripta appaiono nel materiale digerire. (C) tipica di &#39;digerire&#39; 4 o 5. Pannello (D) rappresenta pooled digerire materiale da&#39;digest&#39; 3-5 fatta passare attraverso un filtro 100 micron per rimuovere i frammenti di tessuto indesiderate grandi visto in (C). Tutte le immagini sono state scattate con un microscopio invertito digitale con un obiettivo 20X. Barre di scala = 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 6. Culture placcatura intestinali (arricchito da crypt cellule) <ol><li> Rimuovere la soluzione in eccesso dalla BMM piatto o piatti, e aggiungere 250 microlitri terreno di coltura pre-riscaldato per secrezione bene. NOTA: Imaging piatti sono lasciati senza prodotto così procedere al passo successivo rapidamente per impedire il piatto si secchi. </li><li> Piastra 250 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto (24-pozzetti) o per vetro piatto inferiore. <ol><li> Piastra goccia a goccia in un movimento lento &#39;zig-zag&#39; tutto il bene. Consentire frammenti cripta di stabilirsi per ~ 5 minuti prima di passare la piastra a the incubatore. NOTA: Questo dovrebbe incoraggiare una distribuzione uniforme delle cripte / cellule all&#39;interno del pozzo. </li></ol></li><li> Incubare la piastra o piatti notte a 37 ° C e 5% CO 2. NOTA: un monostrato &#39;macchia di leopardo&#39; avrebbe dovuto formata. Per un&#39;immagine rappresentativa di culture seguenti tre lavaggi, vedere la Figura 2A. </li><li> &#39;inondazione&#39; piatti di imaging con 2 mL di terreno di coltura pre-riscaldato a piatto. NOTA: Questi piatti saranno adatti per l&#39;imaging fino a ~ 72 ore dopo la placcatura. culture del colon in genere durano più a lungo, fino a 7 giorni. Le cellule che non hanno aderito possono essere rimossi da una fase di lavaggio. Colture primarie sono ora pronti per essere utilizzati per gli esperimenti. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive l&#39;isolamento e la coltura di piccole cellule intestinali murine misti per consentire lo studio della secrezione intestinale peptide e di imaging singola cellula di cellule enteroendocrine etichettati. Per aumentare la probabilità delle piccole colture intestinali avere successo, è importante che il protocollo avviene più rapidamente possibile (idealmente entro 3 h di raccolta del tessuto) e che il tessuto viene mantenuto in terreno ghiacciata o tampone prima per il processo di digestione, per limitare la morte cellulare. Mentre non è essenziale, soprattutto per culture colon, rimozione dello strato muscolare dall&#39;intestino tenue è fortemente incoraggiata. Il piccolo protocollo cultura intestinale è stato standardizzato, per quanto possibile. Tuttavia, è importante notare che nessun processo di digestione è identico. Ci sono molti passi durante questo protocollo in cui la variabilità può essere introdotto in un giorno per giorno ad esempio, il grado di rimozione del muscolo, la dimensione delle tha &#39;macinato&#39; pezzi di tessuto, la forza di scuotere, la potenza di un particolare lotto di collagenasi, ecc. È quindi di fondamentale importanza per ispezionare aliquote di ciascuno dei diversi &#39;digerisce&#39; al microscopio per valutare l&#39;avanzamento del processo di digestione e adattare lo scuotimento e il numero di &#39;digest&#39; di conseguenza. Si consiglia di scuotere più delicatamente per cominciare e, se frammenti cripta non sono evidenti da &#39;digest&#39; 3 in poi, per iniziare agitazione più vigorosamente. Dalla nostra esperienza, le cellule enteroendocrine non proliferano nella cultura e di solito sono persi da piccole culture intestinali entro 4 giorni. Tuttavia, questo consente tempo sufficiente per effettuare esperimenti secrezione intestinale peptide (tipicamente effettuata in 2 h, 18-24 ore dopo placcatura) per testare stimoli fisiologici e / o agenti farmacologici. Esperimenti che richiedono una notte di incubazione prima dell&#39;esperimento secrezione sono possibili anche esnel caso di pre-trattamento con la tossina della pertosse 15. La tecnica di coltura primaria qui presentato è un metodo ben noto, come dimostra il volume dei risultati della ricerca ha prodotto nel corso degli anni. Il modello di coltura primaria è stata usata per studiare la secrezione di una varietà di peptidi intestinali, compreso GLP-1 1, 18 e GIP PYY 19, in risposta a diverse nutrienti e non nutrienti 14, 20 stimoli e inibitori. Inoltre, la stessa tecnica è stata applicata con successo alla coltura di cellule intestinali umane 21. Spesso, una combinazione del metodo colture primarie insieme ad un ulteriore modello sperimentale es. ex vivo o in vivo in grado di fornire la più intuizione 6. In particolare ed in contrasto con altri metodi, questa tecnica ha imapplicazioni portanti al di là della misura del rilascio intestinale peptide. Abbiamo dimostrato che le piccole colture intestinali primarie derivate da topi transgenici transgenici sono strumenti potenti per l&#39;interrogazione dei segnali intracellulari accoppiati al budello secrezione peptide, usando per esempio il Ca 2+ e sensori cAMP, GCaMP3 11, 13 e Epac2camps 14, rispettivamente, nonché tecniche elettrofisiologiche 12. Come con tutti i modelli in vitro, le colture primarie intestinali hanno certe limitazioni inerenti compresa la perdita di polarità delle cellule epiteliali in coltura, così come il mancato afflusso di sangue e innervazione. È difficile stimare gli impatti potenziali di queste condizioni artificiali sulla funzione cellulare enteroendocrine. Tuttavia, i dati ottenuti da colture primarie sono state spesso traslabile in vivo setting (ad esempio effetti degli acidi grassi a catena corta di GLP-1 secrezione 15). Le colture primarie intestinali sono una tecnica versatile con molte applicazioni potenziali. Essi hanno già fornito importanti visione meccanicistica nella regolazione della secrezione intestinale peptide.

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di isolare e coltura mista cellule intestinali murine per consentire lo studio della secrezione intestinale peptide e imaging cellulare dal vivo di cellule enteroendocrine. Una prima versione di questa procedura è stato originariamente pubblicato nel 2008 da Reimann et al. 1 e da allora ha costituito la base di ulteriori 20 pubblicazioni dal nostro gruppo. Per questo manoscritto, abbiamo scelto di concentrarsi su piccoli culture intestinale in quanto sono più difficili da stabilire di culture del colon. Cellule enteroendocrine secernono una serie di peptidi intestinali compresi glucagone-like peptide 1 (GLP-1), glucosio-dipendente insulinotropico peptide (GIP), colecistochinina (CCK) e peptide YY (PYY) 2. Questi peptidi intestinali hanno importanti ruoli fisiologici a orchestrare le risposte post-prandiali, come il rallentamento del budello di transito, potenziamento del rilascio di insulina glucosio-stimolata e l&#39;induzione di sazietà. GLP-1 mimetici and farmaci che inibiscono la degradazione sono attualmente licenza per il trattamento del diabete di tipo 2 e non v&#39;è costante valutazione del potenziale terapeutico di stimolare la secrezione endogena di questo peptide 3. Una migliore comprensione della fisiologia e enteroendocrine i meccanismi con cui secrezione è stimolata sia o inibita è, quindi, di importanza critica. Gut secrezione peptide può essere studiata utilizzando diversi in vitro ed ex vivo modelli sperimentali, ciascuno con vantaggi e svantaggi (per una rassegna recente completa comprendente anche l&#39;uso di modelli in vivo vedere Svendsen et al. 4). Ex vivo tecniche come l&#39;intestino 5 e Camera di Ussing perfusi isolati 6 sono attualmente utilizzate per esplorare intestinale secrezione peptide in risposta a varie sostanze. Il principale vantaggio di questi metodi, comerispetto a colture primarie, è che l&#39;ambiente immediato delle cellule enteroendocrine rimane in gran parte intatto e, soprattutto, la polarità delle cellule è conservato. Pertanto, è possibile ottenere informazioni riguardanti quale cella superficie un secretagogo agisce per 6. Tuttavia, queste sono in genere tecniche a basso throughput e la qualità dei dati da essi derivati ​​si basa molto sulla integrità e la vitalità del tessuto intestinale, che declina inevitabilmente nel corso del tempo. Organoidi intestinali sono ora sempre più utilizzati come modelli in vitro per lo studio della funzione delle cellule enteroendocrine e sviluppo 7. Organoidi, che possono derivare sia da topo e tessuti umani, hanno il vantaggio di formare strutture 3D &#39;cripta-simili&#39; che mantengono la polarità delle cellule in coltura. Tuttavia, le cellule enteroendocrine organoide derivate devono ancora essere completamente caratterizzati e loro somiglianza L cel nativols rimane in gran parte sconosciuto. colture primarie hanno il vantaggio di essere un passo verso l&#39;impostazione fisiologico, come cellule enteroendocrine non vengono mantenute e differenziate in condizioni artificiali per periodi di tempo prolungati. Un metodo di coltura primario alternativo che è stato usato per la valutazione della secrezione intestinale peptide è l&#39;isolamento delle cellule intestinali ratto fetale (FRICS) 8. Tuttavia, la coltura di tessuto intestinale adulta ha riscosso meno successo e alcune differenze sono state osservate nella sensibilità di FRICS vs cellule intestinali murine adulte (ad esempio glucosio 8). Linee cellulari enteroendocrine-simile (es GLUTag, STC-1 e NCI-H716) sono stati tradizionalmente utilizzati per distinguere diretta vs. effetti indiretti sulle cellule enteroendocrine e per sezionare meccanismi molecolari alla base accoppiamento stimolo alla secrezione; vedi Kuhre et al </em&gt;. 9 per la produzione e la secrezione del peptide da linee cellulari immortalizzate &#39;alveolari L&#39;. Questo è stato necessario in quanto le cellule enteroendocrine, sparsi lungo il tratto gastrointestinale, costituiscono poco meno dell&#39;1% delle cellule epiteliali intestinali 10 e cellule ordinati, nelle nostre mani, non sopravvivere in cultura 1. Linee cellulari rimangono strumenti utili per il fatto che essi sono una popolazione cellulare molto omogeneo che è favorevole a manipolazioni genetiche come gene silenziamento. Di conseguenza, è facile per indagare il ruolo delle proteine ​​che non possono essere mirati farmacologicamente, quando i topi transgenici non sono disponibili. Tuttavia, le linee cellulari non sono sempre validi modelli di pile. Mentre ci sono molte somiglianze, risultati di colture primarie sono talvolta differenze nelle vie di segnalazione attivate da alcune sostanze nutritive in cellule primarie L rispetto alle cellule GLUTag evidenziate, per esempio (es. Peptoni &lt;class = sup &quot;xref&quot;&gt; 11). Cruciale, in combinazione con i topi transgenici reporter fluorescente, il modello coltura primaria permette un esame particolareggiato delle singole celle enteroendocrine primario a livello intracellulare. Cellule L fluorescenti-tag all&#39;interno colture primarie sono state usate dal nostro gruppo di patch di bloccaggio 1, 12 studi e unicellulare calcio 11, 13 e ciclico adenosina immagini monofosfato-FRET 14 studi, che hanno dato significativi progressi nel campo della enteroendocrine fisiologia. Il seguente protocollo è ottimizzato per eseguire esperimenti secrezione, utilizzando una piastra a 24 pozzetti o per la preparazione di fino a 16 piatti di imaging, da una sezione 10 cm tenue da un singolo topo adulto. Il protocollo può essere facilmente modificato per lo studio delle cellule del colon aumentando tempi di digestione e coconcentrazione llagenase.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Costar</td><td>3524</td><td>For secretion experiments</td></tr><tr><td>Bombesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4272</td><td>Positive control (calcium imaging experiment)</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 15 mL, sterile</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td>For tissue preperation/digestion</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 50 mL, sterile</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430828</td><td>For tissue preperation/ digestion</td></tr><tr><td>Collagenase XI (Crude)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>For making up digestion medium</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>DMEM High glucose (4500 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6546</td><td>For dissolving matrigel (keep at 4 &amp;deg;C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Forceps/Tweezers</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT520</td><td>For dissection/removal of intestine</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td>Positive control (secretion experiment)</td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes (35 mm)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>High precision tweezer (110 mm)</td><td>IDEAL-TEK</td><td>3480641 (5 SA)</td><td>For removing muscle layer</td></tr><tr><td>High resolution digital CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-ER</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Positive control (secretion experiment)</td></tr><tr><td>L-15 Medium (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>For collecting tissue, keep on ice</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes</td></tr><tr><td>MetaFluor&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices (supplied by Cairn Research)</td><td>-</td><td>Fluorescence ratio imaging software</td></tr><tr><td>Mice (C57BL6)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>C57BL/6J</td><td>Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments</td></tr><tr><td>Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td><td>in house</td><td>-</td><td>For calcium imaging and secretion experiments</td></tr><tr><td>Microscope (EVOS XL Core)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>For photomicrographs of cultures</td></tr><tr><td>Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4234</td><td>For cleaning tissue</td></tr><tr><td>PBS containing Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>For washing tissue, keep on ice</td></tr><tr><td>Penicillin &amp;amp; Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td>For cleaning tissue and removing muscle layer</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td>Positive control (calcium imaging experiment)</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT554</td><td>For dissection/removal of intestine</td></tr><tr><td>Sterile cell strainer 100 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>For filtering crypt cell suspension prior to plating</td></tr><tr><td>Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)</td><td>Swann Morton</td><td>0308</td><td>For dicing tissue</td></tr><tr><td>Syringe filters, Minisart NML (0.2 &amp;micro;m pore size)</td><td>Sartorius</td><td>16534-K</td><td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td></tr><tr><td>Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip</td><td>BD</td><td>300613</td><td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td></tr><tr><td>Xenon arc lamp 75W</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium)</td></tr></tbody></table>

mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells

L&#39;intestino è l&#39;organo più endocrino del corpo, con celle enteroendocrine GH secernenti situati lungo la lunghezza dell&#39;epitelio gastrointestinale. Nonostante la loro importanza fisiologica, le cellule enteroendocrine rappresentano solo una piccola frazione della popolazione di cellule epiteliali e, in passato, la loro caratterizzazione ha presentato una notevole sfida con un conseguente affidamento su modelli della linea cellulare. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l&#39;isolamento e la coltura di piccole cellule intestinali murine misti. Queste colture primarie sono state usate per identificare le vie di segnalazione sottostanti la stimolazione e inibizione della secrezione intestinale peptide in risposta ad un numero di sostanze nutritive e neuropeptidi nonché agenti farmacologici. Inoltre, in combinazione con l&#39;uso di topi transgenici reporter fluorescente, abbiamo dimostrato che queste colture primarie diventano un potente strumento per l&#39;esame delle cellule enteroendocrine fluorescenza-tag al dilivello tracellular, utilizzando metodi come serraggio cerotto e calcio cella singola e l&#39;imaging cAMP-FRET.

L&#39;uso di mineralizzazione seriali permette la raccolta di una preparazione relativamente pulita di frammenti cripta da placcare per esperimenti. I primi due digest rimuovono le cellule principalmente singole e detriti cellulari dal materiale digerire (Figura 1A). Durante il terzo digest, frammenti cripta appaiono nel materiale digerito (Figura 1B). Digerisce 4 e 5 resa un maggior numero di frammenti cripta con meno cellule singole (Figura 1C). Filtrare il materiale raggruppata dei digest 3-5 rimuove grandi pezzi di tessuto non digerito, che possono essere dannosi per la coltura, producendo un pulito preparazione frammento cripta (Figura 1D). Seguendo 18-24 ore di coltura, si osservano monostrati di piccole cellule intestinali primarie (Figura 2A). Utilizzando le culture generate da topi transgenici che esprimono in particolare il calsensore fluorescente Cium, GCaMP3, sotto il controllo del promotore proglucagon 11, cellule L sono facilmente identificabili e intervallati nella cultura (Figura 2B). Nelle piccole colture primarie intestinali, composti targeting G q -Ca 2+ i e cAMP i percorsi -dipendente stimolato la secrezione di GLP-1 (per metodologia esperimento secrezione vedi Reimann et al. 1). Bombesina (BBS, 100 nM) e co-applicazione di forskolina e 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (F / I, 10 pM ciascuno) innescato una stimolazione 2 e 11 volte, di GLP-1 rispetto al rilascio basale, rispettivamente (Figura 2C). espressione cellula L specifica del GCaMP3 permette di individuare e monitoraggio in tempo reale di mobilitazione del calcio nelle singole cellule L. Sia 100 nM bombesin (BBS) e cloruro di potassio 30 mM (KCl) stimolati aumenti transitorie del calcio intracellulare indicativi della nota G q &lt;/ sub&gt; - e percorsi elettrogeniche accoppiati in cellule primarie L (Figura 2D). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> Figura 2: Dati rappresentativi derivanti da piccole colture primarie intestinali. Immagini di esempio di piccole colture primarie intestinali miste usate per (A) e la secrezione esperimenti di imaging (B) posta 24 h placcatura. (A) Immagine tratta da una piastra a 24 pozzetti, utilizzando un microscopio invertito digitale con un obiettivo 4X. Barra di scala = 500 micron. (B) Usando GLU-Cre x topi ROSA26 GCamP3, cellule L nel campo visivo (cellule verdi) sono stati identificati dalla fluorescenza di GCaMP3. bar scala rappresenta 50 um. (C) GLP-1 secrezione è stato misurato in risposta a bombesina (BBS, 100 nM) e forskolin / 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (F / I, 10 pM ciascuno). Percentuale GLP-1 è stata calcolata secrezionemisurando i livelli di GLP-1 nei surnatanti e lisati cellulari. Dati rappresentano le medie ± SEM di n = 3 per ogni condizione. (D) GCaMP3 fluorescenza (riflettente calcio citosolico) delle due celle descritte in (B) monitorati in tempo reale in risposta al cloruro di potassio (KCl, 30 mM) e BBS (100 nM). Imaging singola cella è stata effettuata utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza con un obiettivo ad immersione in olio 40X. GCaMP3 stato eccitato a 475/10 nm, utilizzando una lampada allo xeno ad arco 75 W ed un monocromatore controllato dal software di imaging di fluorescenza. Emissione è stato registrato con una fotocamera digitale ad alta risoluzione dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) usando uno specchio dicroico e un filtro a banda 510-560 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Questo protocollo descrive l&#39;isolamento e la coltura di piccole cellule intestinali murine misti. Queste colture primarie intestinali consentono la ricerca di vie di segnalazione sottostanti intestinale secrezione peptide utilizzando un numero di tecniche.

Mixed colture primarie di murino tenue finalizzate allo studio di Gut secrezione dell&#39;ormone e imaging cellulare dal vivo di celle enteroendocrine

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

mixed-primary-cultures-murine-small-intestine-intended-for-study-gut

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Views.  Wellcome Trust-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge.  Questo protocollo descrive l'isolamento e la coltura di piccole cellule intestinali murine misti. Queste colture primarie intestinali consentono la ricerca di vie di segnalazione sottostanti intestinale secrezione peptide utilizzando un numero di tecniche. 

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Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

L&#39;ingegneria dei tessuti del colon in un modello murino

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Ricerca

Bioingegneria

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Biologia dello sviluppo

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Medicina

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, nutrient absorption and distribution, and post-prandial glucose excursions. Understanding the molecular mechanisms that regulate gut hormone secretion is fundamental for understanding and translating gut hormone physiology. Traditionally, the mechanisms underlying gut hormone secretion are either studied in vivo (in experimental animals or humans) or using gut hormone-secreting primary mucosal cell cultures or cell lines. Here, we introduce an isolated perfused rat small intestine as an alternative method for studying gut hormone secretion. The virtues of this model are that it relies on the intact gut, meaning that it recapitulates most of the physiologically important parameters responsible for the secretion in in vivo studies, including mucosal polarization, paracrine relationships and routes of perfusion/stimulus exposure. In addition, and unlike in vivo studies, the isolated perfused rat small intestine allows for almost complete experimental control and direct assessment of secretion. In contrast to in vitro studies, it is possible to study both the magnitude and the dynamics of secretion and to address important questions, such as what stimuli cause secretion of different gut hormones, from which side of the gut (luminal or vascular) is secretion stimulated, and to analyze in detail molecular sensors underlying the secretory response. In addition, the preparation is a powerful model for the study of intestinal absorption and details regarding the dynamics of intestinal absorption including the responsible transporters.

Here, we present a powerful and physiological model to study the molecular mechanisms underlying gut hormone secretion and intestinal absorption &#8212; the isolated perfused rat small intestine.

Meccanismi di secrezione dell'ormone intestinale utilizzando l'isolato irrorati intestino tenue del ratto

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Immunologia e infezioni

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per<em&gt; Ex Vivo</em&gt; La manipolazione delle vie di segnalazione e tridimensionale Imaging in diretta di Sviluppo del villo

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Biologia

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

A cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

Generazione di monostrati epiteliali del colon primario murino da cripte intestinali

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Metodi di coltura per studiare interazioni apicali-specifiche utilizzando modelli organoidi intestinali

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Coltura 3D di Organoidi da Cripte Intestinali Murine e Singola Cellula Staminale

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Autore in primo piano: La coltura 3D di organoidi da cripte intestinali murine e una singola cellula staminale per la ricerca sugli organoidi  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

La coltura 3D di organoidi da cripte intestinali murine e una singola cellula staminale per la ricerca sugli organoidi

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Mixed colture primarie di murino tenue finalizzate allo studio di Gut secrezione dell'ormone e imaging cellulare dal vivo di celle enteroendocrine

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L'ingegneria dei tessuti del colon in un modello murino