Name: trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
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Questa ricerca è stata sostenuta [in parte] dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Si ringrazia Shyamal Peddada per l'analisi statistica. Desideriamo anche ringraziare Humphrey Yao, Gary Bird e Yuki Arao per la revisione di questo manoscritto e Franco DeMayo per il suo continuo supporto e consulenza.

Tutte le operazioni sono state eseguite come parte del normale funzionamento dell'impianto NIEHS Knock Out Mouse Core. Tutti i topi sono stati tenuti su un 12:12 ciclo di luce: scuro h e sono stati di alimentazione una dieta di NIH-31 e acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il Comitato di uso del National Institute of Environmental Health Sciences e cura degli animali.
1. animale preparazione
<ol><li>Razza di topi di donatore, B6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j topi femmina a 8-10 settimane di età naturalmente a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > il topo maschio/j tra 8 e 26 settimane di età. Tappi di verificare visivamente la mattina seguente (0.5).</li>
	<li>Razza destinatari topi, topi femminili tra 6 e 9 settimane di età naturalmente sono allevati per vasectomia topi maschi Swiss Webster svizzero di Webster. Tappi di verificare visivamente la mattina seguente (0.5).</li>
</ol>2. preparazione delle cellule ES
<ol><li>Per 129-derieved AB2.2 ES cells, cultura cellule in DMEM completate con 15% FBS, 1% glutammina, 1% Penn/strep e 0,1% β-mercaptoetanolo. Tutte le altre celle di ES secondo le istruzioni del fornitore di cellule ES, utilizzando i protocolli consigliati della coltura.</li>
</ol>3. gruppi di raccolta
<ol><li>
Dissezione animale
	<ol>
<li>Preparare diversi piatti di 60 mm, circa 1 / 5 topi più 3 extra, con 10 mL collezione di granigliatura (BCM) (10% FBS IN DMEM), e un 4 piatto bene con 0,5 mL BCM per pozzetto. Equilibrare a 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Eutanasia B6 (Cg)-Tyr < c-2J > topi femmina/j a E3.5 usando CO2 asfissia, con una portata di 10%.</li>
		<li>Dopo l'eutanasia, posizionare i mouse nella posizione supina e bagnato l'addome accuratamente con etanolo al 70%.</li>
		<li>Fare la prima incisione attraverso la pelle solo, al punto centrale dell'addome, rendendo l'apertura più ampio possibile. Quindi aprire attraverso la parete addominale, rendendo nuovamente l'incisione più ampio possibile. Nota: Questa operazione in due passaggi aiuta a ridurre o eliminare la contaminazione di pelliccia.</li>
		<li>A partire da un'ovaia e che tiene il cuscinetto adiposo dell'ovaia con il forcipe smussato, rimuovere con cautela l'ovaia, ovidotto e dell'utero, prendendo cura in più per mantenere il tessuto adiposo al minimo. Rimuovere l'utero come una singola unità, o come corna individuali, con nessun cambiamento nella procedura seguente.</li>
		<li>Dopo la rimozione, è necessario mettere l'utero in un piatto di 60 mm contenente materiale di granigliatura collezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rimozione di embrione
	<ol>
<li>Preparare una siringa da 10 mL riempita con BCM e misura con un ago da 25 G.</li>
		<li>Uno utero alla volta, rimuoverli dal piatto della holding del BCM, li asciugare su un panno per rimuovere il sangue in eccesso e mettere in un piatto di 60 mm con un basso ingrandimento microscopio per dissezione.</li>
		<li>Tenendo accuratamente e delicatamente l'utero appena sotto l'estremità distale (vicino l'ovidotto) con forcipe di dissezione, inserire l'ago al centro dell'utero in parallelo un aereo come possibile. Inserire l'ago appena oltre le punte della pinza.</li>
		<li>Applicare un po' di pressione per il forcipe per tenere l'utero per l'ago e di espellere circa 1 mL di BCM attraverso il corno dell'utero. Nota: Deve prestare attenzione a questo punto, come troppa pressione sulla siringa causerà un flusso incontrollabile dei media, spesso lasciando il piatto.</li>
		<li>Dopo aver sciacquato l'utero, uteri interi fino a 5 per ogni piatto di 60 mm, posizionare il piatto indietro nell'incubatore fino alla raccolta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccolta degli embrioni
	<ol>
<li>Utilizzando una pipetta di vetro tirato a mano e un apparato di pipetta di bocca, raccogliere blastocisti in un ambito di dissezione, impostare tra 25 X e 35 X. (Figura 1). Nota: Bocca pipetta apparato è costituito da 30-40 cm di tubo flessibile, inferiore a 5 mm I.D. Inserire un 1, punta della pipetta 000 µ l, scegliere innanzitutto a un'estremità e apporre la pipetta di vetro in esso. Aggiungere un filtro per siringa a altra estremità, con un annesso 1 cc siringa, non lo stantuffo, per agire come un pezzo di bocca.</li>
		<li>Rimozione di piatti dall'incubatrice e utilizzando un modello di griglia, esaminare ogni parte del piatto per gli embrioni. Gli embrioni vengono raccolte fino individualmente e posizionarvi la goccia di BCM in un piatto secondario.</li>
		<li>Dopo aver raccolto da tutti i piatti, lavare gli embrioni ancora una volta in una goccia di BCM fresco e quindi posizionare nel piatto ben 4 in attesa di iniezione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. embrione iniezione
<ol><li>Pick up cellule ES individualmente con l'ago per iniezione basata sulla conferma.<ol>
<li>Preparare un piatto di iniezione con l'aggiunta di 5-7 mL di media di iniezione (DMEM, 10% FBS e 20 mM HEPES) per un piatto di vetro inferiore ad iniezione. Le iniezioni sono fatte a temperatura ambiente.</li>
		<li>Utilizzando un olio o aria microinjector, applicare il vuoto per l'inserimento dell'ago per disegnare le cellule ES in. Fare attenzione a tenere il piccolo spazio possibile tra le celle. Contare le celle ES qui, o nella fase di iniezione.</li>
		<li>Selezionare le celle di ES che sono medio-piccole dimensioni rispetto alla popolazione generale delle cellule, con una superficie liscia e senza difetti evidenti come vacuoli. Nota: Le popolazioni delle cellule ES variano notevolmente nella qualità morfologiche, e gli standard utilizzati saranno necessario regolare con loro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniettare gli embrioni con circa 15 cellule ES (Figura 1).<ol>
<li>Allegare una pipetta di supporto punta a una seconda microinjector di aria e posizionare un embrione vicino all'apertura del titolare. Applicare il vuoto per proteggere l'embrione al titolare.</li>
		<li>Regolare per l'asse z spostando la pipetta di supporto verso l'alto o verso il basso così che l'embrione è solo toccare la diapositiva, seguita da una messa a fuoco fine sulla zona. Successivamente, regolare l'asse Z dell'ago per iniezione in modo che le cellule ES vicino alla punta sono a fuoco.</li>
		<li>Regolare l'embrione ora spingendo delicatamente dall'ago per iniezione nella parte superiore o inferiore, ruotandola per mettere l'ICM nella posizione desiderata.</li>
		<li>Inserire l'ago per iniezione attraverso la zona e l'ICM o il trofoblasto, utilizzando una spinta costante ma controllata. Esercitare una leggera pressione per la microinjector dell'ago per iniezione per aiutare a mantenere il Blastocele dal collasso.</li>
		<li>Una volta che l'ago ha penetrato il Blastocele, applicare una pressione da microinjector per trasferire le cellule ES al Blastocele dell'embrione. Pausa brevemente come la smussatura dell'ago inizia a uscire l'embrione per consentire la pressione nell'embrione di tornare alla normalità, pur mantenendo le cellule. Nota: Le celle di riferimento gruppo ES sono state iniettate normalmente, seguendo una tradizionale ES cell iniezione protocollo9, avendo cura di non per toccare l'ICM. Le cellule ES sono state iniettate anche attraverso l'ICM, spingendo l'ago direttamente attraverso l'ICM (TICM) (Figura 2film supplementare).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. trasferimento di eEmbryos
<ol><li>Trasferire gli embrioni in topi Swiss Webster a E2.5, utilizzando un dispositivo di trasferimento di embrioni non chirurgico, per le procedure di fabbricazione. Questa procedura non chirurgica non richiede alcuna anestesia o la speciale cura post-op. Casa topi singolarmente dopo il trasferimento degli embrioni e attraverso la consegna e lo svezzamento successive.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li><li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program.">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li><li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li><li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells:+A+Case+Study.">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation.">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li><li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo.">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation.">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse embryo. , (2014).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).</li><li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.

Si è a lungo pensato che qualsiasi disturbo del ICM potrebbe portare alla mortalità, infatti, protocolli di microinjection di blastocisti correnti ancora avvertono di questo12,13. Quello che vi abbiamo mostrato qui è che microiniezione attraverso l'ICM non è dannosa per l'embrione e aumenta la resa delle chimere.
L'esatto meccanismo di questo effetto non è stato identificato. Tuttavia, la rottura meccanica del ICM e l'accompagname...

Per quasi 25 anni, la creazione di topi geneticamente mirati è stato un processo lento, spesso ostacolato da un collo di bottiglia nella fase blastocisti ES cella microiniezione per la generazione di germline trasmissione chimere. Gli avanzamenti recenti, tra cui CRISPR/Cas91,2 di targeting in cellule ES ed ES di alto-rendimento cella consorzi di generazione come KOMP, hanno migliorato la disponibilità/generazione di cellule geneticamente modificate ES. Tuttavia, la generazione di germline chimere rimane un collo di bottiglia nella creazione di topi geneticamente modificati da queste cellule ES3,4. Progetti di generazione di alto-rendimento ES cella sono stati afflitti da alta variabilità nella qualità delle cellule di ES, che è fondamentale per la riuscita creazione di chimere di germline. Inoltre, alcune delle varietà di cellula ES comunemente utilizzati sono noti per aneuploidia alta e difficile produzione di germline chimere competente5.
Sono stati sviluppati molti metodi per la creazione di topi con una chimera o superiore, o completamente delle cellule di ES derivato topi6,7,8,9,10. Mentre ciascuno di questi sistemi ha i suoi meriti, hanno anche le loro carenze. La generazione delle chimere tetraploide, mentre la generazione delle cellule di ES 100% derivato topi, è inefficiente e generalmente limitata a linee nazionali 5,6. Recensioni più recenti metodi di iniezione morula possono produrre alta percentuale chimere, prossima al 100%, ma in genere richiedono significative ulteriori apparecchiature (laser o piezo) e formazione10,11. Nei laboratori dove queste tecniche sono già in atto, questa nuova metodologia potrebbe non essere necessaria.
Obiettivo di questo studio era di trovare un metodo che utilizza tecniche comuni e prontamente disponibili attrezzature per aumentare il tasso di generazione di chimera, aumentando la probabilità di trasmissione nella linea germinale dell'allele del mutante per fondare la Colonia del mouse successiva.

<table><tbody><tr><td>ES Cell injection needle</td><td>Humagen</td><td>MSC-20-0</td><td></td></tr><tr><td>NSET device</td><td>Paratechs</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>10439-024</td><td>lots should be individually tested for ES Cell compatibility.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Micro manipulator</td><td>Leica</td><td>Micro manipulator</td><td></td></tr><tr><td>micro injector</td><td>Eppendorf AG</td><td>Cell Tram Air 5176</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>4 well dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>60 mm dish</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td></td></tr><tr><td>B6(Cg)-Tyr&amp;#60;c-2J&amp;#62;/J</td><td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>Swiss Webster mice</td><td>Taconic, USA</td><td>Tac:SW</td><td></td></tr><tr><td>Injection Dish</td><td>MatTek Corp.</td><td>P50G-0-30-F</td><td></td></tr></tbody></table>

trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates

Nel tentativo di aumentare l'efficienza nella creazione di topi geneticamente modificati tramite metodologie delle cellule di ES, presentiamo un adattamento per l'attuale protocollo di iniezione di blastocisti. Qui segnaliamo che una semplice rotazione dell'embrione e iniezione attraverso massa cellulare Trans-interno (TICM) ha aumentato la percentuale dei topi chimerici dal 31% al 50%, con nessun equipaggiamento supplementare o ulteriore formazione specialistica. inbred 26 differenti cloni, e cloni totali 35 sono stati iniettati in un periodo di 9 mesi. Non c'era differenza significativa nel tasso di recupero di embrioni o di tasso di gravidanza tra tecniche di iniezione tradizionale e TICM. Pertanto, senza alcuna alterazione principali nel processo di iniezione e un semplice posizionamento della blastocisti e iniettare attraverso l'ICM, rilasciando le cellule ES nella cavità Blastocele possa potenzialmente migliorare la quantità di produzione chimerici e successive trasmissione nella linea germinale.

Trattamento linea cellulare come l'effetto casuale, un modello lineare di effetti misti è stato utilizzato per analizzare i dati nel software (ad es. SAS (versione 9.2)). Ogni analisi controllata per il numero di embrioni trasferiti e la linea cellulare. La seconda analisi anche controllata per il numero dei cuccioli che sono sopravvissuti.
Per questo studio, ogni linea cellulare ES e clone è stato iniettato entrambi con tradi...

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Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Qui presentiamo un protocollo per aumentare la produzione di chimera senza l'uso di nuove attrezzature. Un cambiamento di orientamento semplice dell'embrione per iniezione può aumentare il numero di embrioni prodotti e potenzialmente ridurre la timeline di trasmissione nella linea germinale.

Trans-inner Cell Mass iniezione delle cellule staminali embrionali porta a tassi più elevati di chimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

trans-inner-cell-mass-injection-embryonic-stem-cells-leads-to-higher

Universidad de Cartagena UDEC

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JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  NIEHS/NIH. Qui presentiamo un protocollo per aumentare la produzione di chimera senza l'uso di nuove attrezzature. Un cambiamento di orientamento semplice dell'embrione per iniezione può aumentare il numero di embrioni prodotti e potenzialmente ridurre la timeline di trasmissione nella linea germinale.

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Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Metodi di trasferimento Proprio localizzata di cellule o DNA in precoce post-impianto di embrioni di topo

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Biologia dello sviluppo

Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) provides a unique opportunity to directly produce a cloned animal from a donor cell, and it requires the use of skillful techniques. Additionally, the efficiencies of cloning have remained low since the successful production of cloned animals, especially mice. There have been many attempts to improve the cloning efficiency, and trichostatin A (TSA), a histone deacetylase inhibitor, has been widely used to enhance the efficiency of cloning. Here, we report a dramatically improved cloning method in mice. This somatic cell nuclear transfer method involves usage of Hemagglutinating virus of Japan Envelope (HVJ-E), which enables easy manipulation. Moreover, the treatment using two small molecules, TSA and vitamin C (VC), with deionized bovine serum albumin (dBSA), is highly effective for embryonic development. This approach requires neither additional injection nor genetic manipulation, and thus presents a simple, suitable method for practical use. This method could become a technically feasible approach for researchers to produce genetically modified animals from cultured cells. Furthermore, it might be a useful way for the rescue of endangered animals via cloning.

We describe a dramatically improved method for mouse cloning using trichostatin A, vitamin C, and deionized bovine serum albumin. We show a simplified, reproducible protocol that supports efficient development of cloned embryos. Hence, this method could become a standardized procedure for mouse cloning.

Trattamento combinatorio di tricostatina A e la vitamina C migliora l'efficienza di clonazione topi da trasferimento nucleare di cellule somatiche

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) provides a unique opportunity to directly produce a cloned animal from a donor cell, and it requires the use of ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tessuto Chimere mirate embrionali: Zebrafish gastrula trapianto di cellule

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Biologia

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema basato su microiniezione per In Vivo l'impianto di cardiomiociti embrionali nell'embrione aviaria

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the behavior of cells in a standardized in vivo environment. The main advantages of the chicken embryo include low cost, high accessibility, ease of surgical manipulation and lack of a fully developed immune system. Xenotransplantation into chicken embryos can provide valuable information about cell proliferation, differentiation and behavior, the responses of cells to signals in defined embryonic tissue niches, and tumorigenic potential. Transplanting cells into chicken embryos can also be a step towards transplantation experiments in other animal models. Recently the chicken embryo has been used to evaluate the neurogenic potential of human stem and progenitor cells following implantation into neural anlage1-6. In this video we document the entire procedure for transplanting human stem cells into the developing central nervous system of the chicken embryo. The procedure starts with incubation of fertilized eggs until embryos of the desired age have developed. The eggshell is then opened, and the embryo contrasted by injecting dye between the embryo and the yolk. Small lesions are made in the neural tube using microsurgery, creating a regenerative site for cell deposition that promotes subsequent integration into the host tissue. We demonstrate injections of human stem cells into such lesions made in the part of the neural tube that forms the hindbrain and the spinal cord, and into the lumen of the part of the neural tube that forms the brain. Systemic injections into extraembryonic veins and arteries are also demonstrated as an alternative way to deliver cells to vascularized tissues including the central nervous system. Finally we show how to remove the embryo from the egg after several days of further development and how to dissect the spinal cord free for subsequent physiological, histological or biochemical analyses.

In this paper we present a method for transplanting human stem cells into various regions of the central nervous system of the chicken embryo. This provides an in vivo model for assessing the proliferation and differentiation of various types of human stem cells in embryonic tissue environments.

Lo xenotrapianto di cellule staminali umane in embrioni di pollo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Cella Transfection singola in embrioni di pollo

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

Targeting genico altamente efficiente mediato da CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali per lo sviluppo di modelli murini manipolati da geni

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...