Name: a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-03-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

Ringraziamo Dipa Bhaumik, Aaron Miller e Bob Hughes per assistenza tecnica. Ceppi sono stati forniti da CGC, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). Siamo grati a Georgia boschi e membri di Lithgow, Kapahi e Melov Labs per utili discussioni. M.L. era sostenuto da National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 AG000266 e un Ellison medica Foundation/American Federation of invecchiamento ricerca induttrici Fellowship. Quest'opera è stata sostenuta da una sovvenzione BioAge Labs, una sovvenzione di Larry L. Hillblom Foundation, così come i National Institutes of Health concede UL1024917, supportano il Consorzio di ricerca interdisciplinare su Geroscience e 1R01AG029631-01A1 a G.J.L.

1. preparazione di buffer
<ol><li>
Libbra di brodo
	<ol>
<li>Utilizzare granuli premiscelati (Vedi Materiali tavolo) e seguire il protocollo del produttore per la preparazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crescita del nematode Media (NGM) Agar
	<ol>
<li>Mescolare 23 g di agar, 3 g di NaCl, 2,5 g di bacto peptone, e acqua deionizzata in 0,972 L. Autoclave e lasciate raffreddare a 60 ° C, quindi aggiungere 25 mL di tampone di 1m potassio fosfato (KPO4) (pH 6.0), 1 mL di solfato di magnesio 1 M (MgSO4) , 1 mL di 1 M di cloruro di calcio (CaCl2) e 1 mL di colesterolo 5 mg/mL (in etanolo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soluzione di ipoclorito
	<ol>
<li>Mescolare 5 mL di 5m KOH, 4 mL di soluzione di ipoclorito di sodio (6%) e deionizzata di H2O a un volume totale di 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
S basale
	<ol>
<li>Mescolare 5 g di NaCl, 1 g di K2HPO4, 6 g di KH2PO4e acqua deionizzata a 1 L, quindi autoclave.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione del concentrato e. coli (OP50)
Nota: Questo passaggio si concentra 1 L di una soluzione satura e. coli in 25 mL di tampone basale S.
<ol><li>Inoculare 5 mL di libbra di brodo in autoclave (punto 1.1) con una singola colonia di Escherichia coli (Strain OP50) e incubare per 4-6 h a 37 ° C con agitazione (250 giri/min). 0,1 mL di questa soluzione consente di inoculare 1 L di LB in un matraccio di Erlenmeyer 2L. Incubare le 1L beute durante la notte (12-16 h) a 37 ° C con agitazione (250 giri/min).</li>
	<li>Centrifugare il culture pernottamento 1 L in bottiglie da 500 mL Centrifuga per 5 min a 10.000 x g e a 4 ° C per i batteri di pellet e decantare fluido rimasto lontano. Risospendere il pellet in 25 mL di S basale (punto 1.4). Conservare a 4 ° C.</li>
</ol>3. preparazione di piatti di coltura NGM
<ol><li>Per lastre di cultura di massa usate per produrre un numero elevato di vermi, versare 30 mL di agar di NGM fuso (60 ° C) (punto 1.2) in un flusso laminare sulle piastre di coltura di 10 cm con un apparato di erogazione fluido automatizzato o una pipetta sierologica. Lasciar asciugare durante la notte.</li>
	<li>Pipettare 2 mL di concentrato OP50 su ogni piatto di 10 cm, diffusa fino a coprire completamente la superficie dell'agar inclinando e ruotando la piastra, quindi consentire piastre ad asciugare. Conservare le piastre a 4 ° C fino a 2 settimane.</li>
	<li>Per piastre di coltura di dosaggio elevato throughput utilizzati per lo screening, utilizzare un erogatore di 8 canali automatizzati per dispensare 0,15 mL di agar di NGM fusa in ciascun pozzetto di una piastra ben 96 in un flusso laminare mobile. Prestare attenzione a rendere sicuri pozzi sono privi di bolle, come queste iniziative permetteranno di scavatori di vermi che comprometteranno il dosaggio in quel pozzo. Lasciar asciugare durante la notte. Conservare le piastre a 4 ° C fino a 2 settimane.</li>
</ol>4. preparazione delle colture massa di temperatura sensibile (ts) Sterile C. Elegans
<ol><li>Per avviare culture, utilizzando un 'pick verme' (una pipetta di vetro con un filo di platino associato o un verme fabbricato pick) sotto un microscopio per dissezione, trasferire 20 uova (ceppo TJ1060: spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) sulla cultura di massa piastre preparata al punto 3.1. Poi, incubare le piastre a 20 ° C per 6 giorni (consente più di una generazione di crescita, come ci si rivolge per la raccolta della prole delle 20 uova spostate).</li>
	<li>Confermare visivamente la presenza di adulti gravid (uova presenti nell'utero) con un microscopio per dissezione. Raccogliere gli adulti gravido di erogazione di 2-3 mL di S basale sulla piastra utilizzando una pipetta di vetro. Agitare il liquido intorno alla piastra a mano, quindi raccogliere il liquido in una provetta da 15 mL utilizzando una pipetta di vetro.</li>
	<li>Rotazione verso il basso il tubo (1.000 x g per 1,5 minuti a 20 ° C) per pellet vermi, quindi aspirare il sovranatante. Aggiungere 10 mL di soluzione di ipoclorito (punto 1.3) al pellet di verme e rapidamente agitare il tubo a mano in una direzione di top-to-bottom per 5 s. Incubare per 5 minuti, scuotendo ogni 2,5 min.</li>
	<li>Ancora una volta, girare giù per il tubo (1.000 x g per 1,5 min); il pellet dovrebbe essere bruno-giallastro. Aspirare il sovranatante. Aggiungere 10 mL di soluzione di ipoclorito al pellet di uovo e agitare vigorosamente il tubo. Incubare per 1-3 minuti, con agitazione occasionale e mentre aspetto il monitoraggio con il microscopio per dissezione. Confermare visivamente solo uova rimangono e procedere al passaggio successivo.</li>
	<li>Rotazione verso il basso il tubo (1.000 x g per 1,5 min) ed aspirare il sovranatante. La pallina deve essere bianca con nessuna colorazione marrone. Nota: Dopo la rimozione della soluzione di ipoclorito, è fondamentale utilizzare tecniche sterili e buffer, dal momento che la contaminazione (batteriche e fungine, in particolare) può rovinare l'esperimento, sprecando tempo prezioso e reagenti. Questo studio usato un filtrato a flusso laminare mobile e spostato liquidi utilizzando solo pipette sterili e suggerimenti.</li>
	<li>Aprire le provette in un spazio sterile. Lavare la pallina 3 volte con S basale, filatura giù (1.000 x g per 1,5 min) e aspirare via il supernatante ogni volta. Risospendere il pellet di uovo in 2-3 mL S basale. Queste uova possono ora utilizzabile per un pernottamento hatch nel buffer per raccogliere della larva L1 (passo 5).</li>
</ol>5. cova uova di C. Elegans in Buffer per ottenere colture sincroni (preparazione larvale L1 C. Elegans )
<ol><li>Decantare il buffer e pellet di uovo in un piatto di petri di vetro sterili con una copertura. Sciacquare le rimanenti uova dal tubo in un piatto utilizzando una pipetta sierologica con 2-3 mL di S basale. Aggiungere 5 mL di S basale per facilitare affollamento, come questo potrebbe incoraggiare la schiusa delle uova, come si illuminerà agitazione (20 giri/min con un agitatore orbitale danzatrice del ventre). Incubare per una notte a 20 ° C, per avere tempo di uova di tratteggio (16-24 h). Tutti i hatchlings arresto al 1° stadio larvale (L1) a causa della mancanza di cibo. Nota: Prova aneddotica indica che freschi preparati in L1 (16-36 h dopo il prelievo degli ovociti) generano le popolazioni più sincrone di vermi adulti.</li>
	<li>Raccogliere L1s in una provetta da 15 mL con una pipetta sierologica. Rotazione verso il basso L1s in una centrifuga (1.000 x g per 1,5 min), via aspirare il supernatante e ripetere fino a quando tutti L1s sono stati raccolti da cova piastre, lasciando 10 mL di S basale per il passo successivo.</li>
	<li>Dal tubo contenente L1s, micropipetta fuori 0,01 mL (immediatamente dopo la miscelazione) e dispensarlo su un non teste di serie (nessun Escherichia coli) piastra di NGM. Contare il numero di L1s sulla piastra. Ripetere 10 volte e ottenere una media per il numero di L1s in ciascuna aliquota. In genere, si aspettano tra 1-3 L1s per µ l (quando si inizia con 1 piastra di cultura di massa contenente 20 uova).</li>
	<li>Determinare con una pipetta sierologica del volume di S basale che tiene il L1s. Quindi estrapolare il numero medio determinato di vermi / 0,01 mL, ottenuti nel passaggio precedente, per stimare il numero totale di L1s. In genere, si aspettano tra 10.000-30.000 L1s (per piastra di cultura di massa contenente 20 uova).</li>
	<li>Per utilizzare questa cultura nell'analisi di 96 pozzetti, diluire la sospensione di L1 a 1 L1 per µ l in una bottiglia sterile rotonda media, quindi procedere al passaggio 7. Se questa cultura deve essere utilizzato per generare ulteriori c. elegans culture di massa, quindi procedere al passaggio 6.</li>
</ol>6. su larga scala sincrono cultura preparazione
Nota: Soluzioni L1 consente di aumentare rapidamente le popolazioni di verme.
<ol><li>Per generare numeri di grande vite senza fine con una soluzione di L1, erogare fino a 5.000 L1s su ciascuno del numero desiderato di piastre di cultura di massa. Raccogliere gli adulti gravid 2,5 giorni più tardi (20 ° C), come descritto ai punti 4.1-2 e passare al punto 4.3 per raccogliere le uova.</li>
	<li>Come è stato osservato anecdotally che ripetuto ipoclorito collection può sottolineare la popolazione sottomessa, dividere le popolazioni di raccolta uova per propagazione prima di sottoporre la popolazione restante ai trattamenti di ipoclorito, così che più generazioni della popolazione non sono ripetutamente sottoposti a trattamento di soluzione di ipoclorito.</li>
</ol>7. installazione di piastre a 96 pozzetti Assay
<ol><li>Lasciate le piastre di dosaggio (preparate al punto 3.3) a temperatura ambiente. Quindi, in un flusso laminare, aggiungere 5 µ l di concentrato OP50 (preparata al punto 2.2) in ciascun pozzetto. Come prima, utilizzare un erogatore di 8 canali automatizzati.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di sospensione di L1 ad ogni pozzetto usando un erogatore di 8 canali automatizzati. Questo produrrà il worm media 10 al pozzo, dal momento che sono presenti in sospensione a 1 L1 per µ l. Per promuovere la distribuzione uguale di L1s dai liquami, dispensare L1s da una bottiglia rotonda media attivamente mescolata con un moderatamente lentamente girando ancoretta.</li>
	<li>Coprire la piastra con il coperchio, lotti di casella di piastre e incubare a 25 ° C per 2 giorni.</li>
</ol>8. 1 st giorno adulto c. elegans con prodotti chimici di trattamento
<ol><li>Rimuovere piastre libreria chimica dal freezer e lasciare piastre a temperatura ambiente prima di procedere. Nota: Le piastre libreria chimica come descritto qui sono 96 pozzetti contenenti composti discreti in tutti i pozzetti, che sono alla stessa concentrazione e dissolto in DMSO. Queste librerie non utilizzano le colonne esterne, e così ogni piatto ha un massimo di 80 sostanze chimiche distinte. La concentrazione di biblioteca nel protocollo descritto qui, è di 10 mM. È importante prendere in considerazione effetti solvente sui fenotipi. Mentre questo studio schermi ad una concentrazione di DMSO dello 0,5%, questo livello è stato superato mai in queste analisi di durata della vita e nelle analisi di bassa velocità effettiva, dove è più probabile che a prendere una concentrazione di soluzione stock composto. Questo protocollo non superi 0,25%, che è un livello in cui le modifiche di durata della vita non si verificano16, almeno nel ceppo di N2.</li>
	<li>Scuotere delicatamente piastra a 60 giri su un agitatore per micropiastre per 1 min immediatamente prima dell'uso.</li>
	<li>Utilizzando un automatizzato 96 pozzetti liquido gestore, trasferire 0,75 µ l del composto (o DMSO) dalla cassa della libreria alla piastra di dosaggio. La profondità della pipetta durante la consegna del liquido alla piastra di dosaggio è controllata attentamente, tale che le punte di pipetta del gestore liquido stanno consegnando il volume 0,75 µ l per il ~ 15 µ l di liquido sulla superficie dell'agar (con vermi e concentrato OP50 da passaggi 7.1 -2) e non perforare la superficie dell'agar nel pozzo. Non usare pipette multicanale manuale 8 o 12 tranne in schermi molto piccoli (< 10 piastre), come possono aumentare errore e spesso sfociano in perforatura della superficie dell'agar, che compromette il dosaggio.</li>
	<li>Preparare piastre di controllo negativo libreria chimica con DMSO (dimetilsolfossido), supponendo che la libreria in fase di test utilizza DMSO come solvente. Fare 1 controllo negativo piastra per ogni 5 piastre, fino a 10 piastre di controllo negativo di prova. Se possibile, anche fare un piatto di controllo positivo (NP11 a 20 mM, per una concentrazione finale del dosaggio di 0,1 millimetri, è efficace per questo scopo; Vedi sezione risultati rappresentante). Non aggiungere prodotti chimici (test o controllo) a 2 colonne esterne delle piastre, così come sono particolarmente suscettibili di essiccazione.</li>
</ol>9. essiccazione culture
<ol><li>Per rimuovere il liquido dalla superficie dell'agar, asciugare piatti nel flusso laminare mobile per 4-8 h. È fondamentale che queste tavole sono completamente asciutto, ma non si asciugano. Come alcune piastre prenderà più tempo ad asciugarsi rispetto ad altri, monitorare attentamente tutte le piastre e rimuovere appena sono asciutti. Confermare l'essiccazione mediante un'attenta ispezione visiva dei singoli pozzetti della piastra. Nota: A seconda di fattori che includono il tasso di scarico del gabinetto, la durata del che operazione dovrà essere empiricamente determinata. Questa fase di essiccazione può prendere circa 4-8 h per un quadro completo.</li>
	<li>Sigillare piastre con pellicola trasparente, poi mettere sui coperchi di piastra.</li>
	<li>Girare le piastre a 96 pozzetti di saggio per 45 s a 1.000 x g.</li>
	<li>Piastre di archivio invertiti a 25 ° C.</li>
</ol>10. C. Elegans culture di scoring per la longevità
<ol><li>Monitorare le piastre di controllo negativo fino a > 95% mortalità è osservato. Verifica piastre settimanale per le prime due settimane e ogni giorno da allora in poi. Prova17 Caenorhabditis coorti della stessa specie e ceppo per visualizzare significativamente differenti aspettative di vita. Nota: Per il dosaggio di durata della vita descritto qui, con gli animali TJ1060 coltivati a 25 ° C, 95% di mortalità in queste popolazioni è verificato da adulto giorno 16-20.</li>
	<li>Pozzetti di controllo negativo vengono considerati di avere raggiunto il > 95% mark, rotazione verso il basso tutte le piastre di dosaggio di 96 pozzetti per 45 s su una centrifuga di piano d'appoggio con una micropiastra adattato rotore (250 x g per 45 s a 20 ° C).</li>
	<li>Punteggio ottenuto tutti i pozzetti delle piastre di controllo. Questo viene fatto dal conteggio e registrazione del numero di animali vivi e morti in ciascun pozzetto. Vermi morti possono essere differenziati da vermi vivi dalla loro mancanza completa di movimento. Provocare movimento in vermi vivi facendo cadere la piastra ben 96 da circa 7 cm sulla superficie del microscopio per dissezione osservando attraverso l'oculare per qualsiasi risposta evocata. Vermi morti non risponderà, e compagni di laboratorio nelle vicinanze potrebbero non apprezzare il rumore ripetitivo.</li>
	<li>Per le piastre di prova, contare e registrare solo i pozzetti contenenti vermi vivi. Quando si osserva un verme vivo, contare tutti gli animali vivi e morti in quel pozzo, insieme con la posizione ben e la piastra. Nota: È spesso utile segnare nuovamente le piastre dopo > 99% di controllo negativo vermi sono morti. Nelle schermate di larga scala, questo può essere il miglior punto per fare il punteggio iniziale. In entrambi i casi, il Punteggio/re-score come descritto sopra</li>
</ol>11. re-Testing composti
<ol><li>Quando si prova solo un piccolo numero di candidati composti (< 320 composti), come con un re-test o una schermata di candidati (Vedi risultati rappresentativi), limitare l'analisi a 32 pozzi centrali nel tentativo di minimizzare gli effetti possibili di piastra. Questo lascia i 2 pozzi più vicino al bordo della piastra non trattati ma ancora contenente agar, cibo e worm.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+activation+of+a+food+deprivation+signal+extends+lifespan.">Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan.</a> Aging Cell. , (2016).</li><li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. 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Gli autori dichiarano che nessun ente di finanziamento sostenere questo lavoro aveva alcun input sulla raccolta di dati, analisi dei risultati o la decisione di pubblicare.

Qui abbiamo descritto un metodo semplice per la coltura di c. elegans in piastre da 96 pozzetti. Descriviamo queste culture per screening chimico e saggi di durata della vita, ma possono essere utilizzati per molti tipi di analisi. Mentre condizioni di coltura multi-pozzetto per lo screening chimico precedentemente sono stati segnalati8, tra cui per durata della vita analisi10, il dosaggio descritto qui differisce in diversi modi. Il test di durata della vita qui descritto utilizza piastre da 96 pozzetti, si basa su mutanti sterili (invece di sterilizzazione chimica), utilizza condizioni di coltura agar, utilizza i componenti liquidi semplici per spostare il worm e manualmente viene segnato all'endpoint. I diversi approcci utilizzati in questo test possono essere di aiuto ai ricercatori alla ricerca di metodi che includono queste condizioni di screening.
Elementi cruciali per questo protocollo centro principalmente sulla qualità delle lastre prodotte per il dosaggio. In primo luogo, quando si effettuano piatti è imperativo che la superficie dell'agar è priva di bolle e altre imperfezioni. Queste variazioni nella superficie dell'agar quasi sempre portano a scavare e perdita del pozzo. In secondo luogo, questo protocollo si basa su l'asciugatura dei liquidi depositati durante le fasi di installazione e drogare. È fondamentale che questi liquidi vengono rimossi completamente, ma l'agar non diventare seccava. Aneddoticamente, sembra che vermi nei pozzi che non sono completamente asciutto (nuoto in liquido) vivono più a lungo di pozzi correttamente essiccati, mentre sopra-essiccamento delle piastre porta ad essiccamento e screpolature dell'agar, che conduce a vite senza fine scavando e perdita. Un altro elemento cruciale del presente protocollo è mantenere condizioni di sterilità. Come con qualsiasi test di durata della vita, c'è un sacco di lavoro coinvolti con la piastra di supporto, e molte opportunità e tempo esiste per dosaggio rovinando la contaminazione per insediarsi e crescere sulle piastre.
Mentre il test di durata della vita qui descritto è utile per lo screening di composti in c. elegans, è limitata a particolari ambiti di provenienza genetici, quanto si basa su un ceppo sterile temperatura sensibile (ts); Abbiamo usato TJ1060, che ha penetranza elevata sterilità. Questo limita i ceppi disponibili per lo screening con questo metodo. I metodi alternativi tra cui attraversando ts sterile mutazioni nello sfondo desiderato o mediante sterilizzazione chimica. Non abbiamo provato la sterilizzazione chimica con questo test, ma dovrebbe essere possibile. Potenziali ostacoli riguardano la collocazione dello sterilizzatore sui vermi nella fase corretta e nella dose corretta. Il protocollo descritto qui usa un dispenser liquido che è veloce, ma non viene visualizzato per erogare efficacemente gli adulti. Così, questi vermi si sviluppano le piastre e pertanto devono essere trattati con la sterilizzazione chimica sulle piastre. Determinare la dose ottima e la tempistica sarebbe importante per il successo. Strategie alternative includono l'utilizzo di un metodo di erogazione che possa spostare gli adulti. In passato, abbiamo trovato che le macchine in grado di identificare e ordinare gli adulti sono generalmente molto più lenti rispetto i gestori liquidi semplici, che possono erogare fanghi omogenee della larva sospesa.
In generale, usiamo questo metodo rapidamente schermo prodotti chimici e trattamenti per grandi effetti positivi sulla durata della vita. Il metodo è particolarmente efficace se usato con dosi multiple, alta replicare i numeri e un attento controllo di controlli negativi che sono sempre mantenuti e intercalati tra le piastre di prova. Controlli positivi sono anche utili nel definire e attuare le schermate descritte in questo manoscritto. Tuttavia, per essere un efficace positivo, il controllo avrebbe bisogno di essere abbastanza potente e/o estremamente robusto. Quando lo schermo è stato originariamente distribuito, non è stato identificato un composto adeguatamente potente e robusto. Attualmente, ci sono molti rapporti nella letteratura 'invecchiamento' di probabili candidati per controlli positivi utili nelle schermate descritte qui. Come descritto nella sezione screen candidato della sezione risultati attesi di questo manoscritto e nella Figura 2 e tabella 1, il composto NP1 è un efficace controllo positivo per questo schermo. Confermiamo generalmente risultati positivi da questi schermi con vita utile standard saggi su piastre di coltura di 3 mm.

Qui un protocollo è descritto che è stato sviluppato per screening su vasta scala di composti chimici per gli effetti sulla durata della vita di Caenorhabditis elegans . Il protocollo stesso è facilmente adattabile agli altri schermi fenotipici, compresi gli studi utilizzando ceppi di c. elegans di reporter. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per identificare un romanzo composto biologicamente attivo, NP1 (nitrofenil-piperazina 1), che fortemente si estende la durata della vita di c. elegans attraverso un meccanismo di restrizione dietetica. NP1 e una caratterizzazione del suo effetto sulla durata della vita, compresa una descrizione delle vie genetiche in gioco, è stato precedentemente descritto altrove1. Tale relazione include anche una descrizione dei risultati da un'implementazione su larga scala dello schermo. Qui descriviamo molto più dettagliatamente la metodologia e il programma di installazione dello schermo stesso, che è scalabile per applicazioni piccole e grandi dimensioni.
L'obiettivo che ha portato alla creazione del protocollo descritto qui era di sviluppare una piattaforma di cultura di c. elegans che ha permesso per la selezione veloce di grandi librerie chimiche per nuovi composti biologicamente attivi. Mentre gli schermi chimici sono stati eseguiti prima dello sviluppo del presente protocollo, questi erano principalmente su piccola scala e/o tipo di candidato si avvicina2,3. Infatti, la maggior parte degli schermi eseguite in laboratorio su decine di composti utilizzati saggi di resistenza di sforzo, con colpi essere proiettati per longevità effetti4. Questo studio ha cercato invece di direttamente per effetti di durata della vita dello schermo. Notevolmente, c'erano poche descrizioni nella letteratura scientifica al momento dell'esecuzione di schermi chimico su larga scala con c. elegans. Infatti, rispetto ad altri tipi di schermi5,6,7, schermatura chimica su larga scala utilizzando c. elegans sembrava essere sotto-occupati.
C'erano due descrizioni di schermi chimico su larga scala in c. elegans che sono stati utilizzati come base per sviluppare questo approccio. Il primo di questi era un elegante studio da laboratorio di Peter Roy utilizzando schermi chimici per identificare i composti che potrebbero perturbare lo sviluppo degli animali. Lo studio poi seguiti con uno schermo di mutagenesi avanti identificare i bersagli genetici di questi prodotti chimici8. Il protocollo descritto in quello studio usato 24 pozzetti pates, che era semplicemente inattuabile per esigenze specifiche di questo studio (limitate quantità di prodotto chimico nella biblioteca e lo spazio limitato disponibile incubatrice). L'altro studio era innovativa e ambiziosa della piccolo-molecola a schermo di Michael Petrascheck per durata della vita estendendo prodotti chimici9,10. Tale studio ha utilizzato piastre da 384 pozzetti e colture liquide. L'altra caratteristica principale di questo schermo è stato l'uso di FUDR (5-fluorodeossiuridina) chimicamente inibizione della produzione di progenie. Dopo una notevole considerazione del protocollo descritto in quello studio, sterilizzazione chimica sia colture liquide di c. elegans sono stati evitati.
Sebbene FUDR è ampiamente usato negli esperimenti di durata della vita di c. elegans , c'erano preoccupazioni che FUDR potrebbe causare interazioni farmacologiche imprevisti, o che FUDR stesso può avere qualche effetto sulla durata della vita. Recentemente questa preoccupazione di quest'ultima è stata convalidata, almeno in alcune concentrazioni e in particolare a 25 ° C11. Per aggirare il problema della contaminazione di progenie, ceppo di c. elegans TJ1060 è stato usato, che ospita due mutazioni sensibili di temperatura indipendente (spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) che abolire la produzione di spermatozoi e sono stati dimostrati per essere utile per le culture di massa di popolazioni sincrono12. Questo ceppo era completamente sterile a 25 ° C, ma produrrà progenie quando coltivate a 15-20 ° C. Questo studio ha usato condizioni di coltura convenzionale, con i vermi strisciando sulla superficie dell'agar, come i risultati ottenuti con colture liquide non sono sempre riproducibili con piastre di agar convenzionali. Mentre questo fenomeno completamente non è capito, è stato dimostrato che vermi coltivate nel liquido rispondere alla DR (restrizione dietetica) in maniera diversa rispetto vermi coltivate su supporti standard13,14. È pertanto plausibile che mezzi liquidi potrebbero mascherare alcuni mimetics DR che altrimenti sarebbe stato identificato con lo schermo.
Dopo aver depositato su condizioni di coltura agar, diverse opzioni per le prestazioni dei pozzi in questo test di punteggio sono stati considerati. Mentre varie analisi automatizzate o imaging base erano disponibili, hanno reso necessario acquisizione e distribuzione di tecnicamente impegnativi dispositivi, molte delle quali erano proibitivamente costosi. Pur considerando queste opzioni, era indispensabile fare riferimento alle schermate precedenti di durata della vita di tutti i tipi. In definitiva, questo studio ha usato un metodo segnante adattato dalla schermata di RNAi del Siu Sylvia Lee laboratorio intero genoma per durata della vita fenotipi15. In particolare, tutte le piastre di durata della vita sono state istituite nello stesso modo, ma solo controlli negativi sono stati controllati. Una volta che le piastre di controllo negativo sono state confermate per avere vicino completa mortalità, piastre di prova sono stati segnati a mano. In questa schermata su larga scala, aspetti positivi sono stati confermati da ri-test con prodotti chimici preparati al momento, utilizzando ripetizioni in triplice copia dei lati positivi di primari.

<table><tbody><tr><td>LB Broth Miller Granules</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unispense&amp;nbsp;</td><td>Wheaton Science Products</td><td></td><td>automated fluid dispensing apparatus</td></tr><tr><td>96 well assay plate; COSTAR 3370</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop 384; automated 8 channel dispenser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>manufactored worm pick</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Stovall Life Science inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microplate shaker; MTS 2/4 Digital</td><td>IKA Works, inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler</td><td>&amp;nbsp;Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor&amp;nbsp;</td><td>Sorenson Bioscience, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>manual 8 or 12 multi-channel pipettes</td><td>we use rainin&amp;hellip;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>table top centrifuge; Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans è un organismo utile per testare gli effetti chimici sulla fisiologia. Tutto l'organismo piccola molecola schermi offrono vantaggi significativi per l'identificazione di strutture chimiche biologicamente attive che possono modificare i fenotipi complessi come la durata della vita. Descritto qui è un semplice protocollo per la produzione di centinaia di piatti di coltura 96 pozzetti con un numero abbastanza consistente di c. elegans in ciascun pozzetto. Successivamente, abbiamo specificato come utilizzare queste culture allo schermo migliaia di sostanze chimiche per gli effetti sulla durata del nematode c. elegans. Questo protocollo si avvale di ceppi sterili sensibili di temperatura, condizioni di piastra di agar e animale di semplice gestione per facilitare la produzione rapida e di alta velocità effettiva delle culture sincronizzate animale per lo screening.

Cominciamo esaminando risultati rappresentativi da impiegando questo protocollo per i test di durata di 96 pozzetti. Nel primo esempio, il metodo è stato utilizzato per schermo con successo attraverso 30.000 sostanze chimiche per identificare le sostanze chimiche che prolungano la durata del c. elegans e includono anche i risultati dalla schermata di follow-up ri-testare performanti prodotti chimici utilizzando il stesso protocollo. Questi risultati sono stati descritti in precedenza1. Il secondo esempio utilizza lo stesso protocollo in una schermata su scala ridotta di candidati composti.
Schermo su larga scala e ripetere il test: Lo schermo su larga scala test 30.000 composti è stato eseguito una dose singola, in duplice copia. Ogni prodotto chimico è stato quindi testato in due pozzi con una popolazione animale totale prevista di 20. A tale scopo, tre insiemi discreti di 10.000 composti (in duplicato) sono stati selezionati per un periodo di circa 3 mesi per coprire l'intero 30.000 composti. Ciò è stato fatto in parte, per garantire una quantità gestibile di Punteggio manuale alla fine del test ed ha richiesto un totale di 260 delle piastre a 96 pozzetti di saggio in ogni set di. In piastre d'archivio biblioteca, solo 80 pozzi contenuto composto; una replica di 10.000 composti rende 125 piastre di dosaggio. Questo studio ha usato 2 repliche con 10 piastre di controllo negativo in ogni set. Per aumentare la velocità effettiva, piastre sono stati segnati quando popolazioni di controllo negativo sono state valutate ad aver sperimentato ~ 99% di mortalità. Prova tutti i pozzi sono stati quindi esaminati per vermi vivi.
Prodotti chimici in pozzi con un verme di terra sono stati denominati hits. Prodotti chimici in pozzetti contenenti più di 1 verme vivo erano anche chiamato hits e inoltre tutti i vermi in quei pozzetti (vivi e morti) sono stati contati per generare un punteggio semplice (percentuale vivo Punteggio; il numero di vermi vivi diviso per il numero di vermi morti). Ogni prodotto chimico nella libreria potrebbe pertanto essere chiamato un colpo due volte e quelli colpi potrebbero, ma potrebbero non avere punteggi associati con loro. 512 prodotti chimici distinti sono stati denominati hits (almeno una volta) dalla schermata di 30.000 composti. Lo schermo è stato effettuato con l'intento di identificare effetti pro-longevità (riproducibili), potenti e/o robusti. Queste due proprietà diverse possono avere effetti distinti. Potenti sostanze chimiche potrebbero aumentare notevolmente la durata della vita, nel qual caso ci si aspetterebbe un'alta percentuale di vermi che vivo nel pozzo di quella sostanza chimica. Per le sostanze chimiche solide, entrambi replica dovrebbe avere vermi vivi. Lista di colpo è stata classificata sulla base di questi criteri. 179 di sostanze chimiche ha reso punteggi percentuali vivi, o sono stati colpiti in entrambi replicati e pertanto sono stati scelti per il re-test. La maggior parte dei prodotti chimici rimanenti che sono stati chiamati colpi, ma non selezionati per la ri-prova, conteneva solo un singolo verme vivo in uno dei pozzi replicati.
Ri-test dei successi è stato svolto, simile alla schermata principale tranne con 3 repliche (popolazione animale totale prevista di 30) e accurata quantificazione delle durate della vita degli animali nelle piastre di controllo non trattato. Questi cambiamenti sono stati aggiunti per aiutare a confrontare i pozzetti di controllo e test. 179 dei successi chimici erano ri-ordinato, diluito a 10 mM e si trasferì in piastre a 96 pozzetti. Solo l'interni 24 pozzetti sono stati utilizzati per il dosaggio di ripetere il test (versioni correnti di questo protocollo sarebbero hanno usato l'interni 32 pozzi come descritto nella sezione protocollo per testare nuovamente gli schermi) e i composti sono stati ri-testati in triplice copia con sei tavole di analisi di controllo negativo trattati con solvente DMSO. Una piastra di controllo negativo è stata segnata periodicamente per la sopravvivenza totale (Figura 1A). Quando circa il 95% degli animali di controllo erano morti, tutte le piastre completamente sono state segnate (vivere tutti trattati e vermi morti sono stati contati).
Per chiamare colpi dai risultati della ri-prova, un cut-off è stato effettuato presso il Punteggio medio di vivo delle percentuali di controllo negativo + 2 deviazioni standard (SD). Per i pozzi di prova, una media di cento vivo (al momento di segnare) calcolando il punteggio percentuale vivo da tre repliche per ogni pozzetto sono stati calcolati i punteggi. Per questo particolare test, Spartiti di vivo percentuale media dei pozzetti di controllo negativo sono stati calcolati come la media dei tre replicati per 48 pozzetti (2 set di piastre di controllo negativo triplice copia). La SD utilizzata per chiamare hits dal set di chimica di ripetere il test era che la SD attraverso il controllo negativo 48 una media percentuale punteggi vivi. Utilizzando questa strategia, questo studio ha trovato 57 risultati dalla libreria di ripetere il test di 179 composti, dimostrando che un totale di 32% delle sostanze chimiche re-test risultati positivi (Figura 1B). Binning dei media percentuali punteggi vivi per i pozzetti di controllo e test negativi hanno indicato che i pozzi di prova ha superato i pozzetti di controllo (Figura 1C).
Schermo candidati: Schermi di piccole dimensioni possono essere eseguiti in un modo simile al retest descritto sopra. Qui, descriviamo i risultati da uno schermo di candidati con 139 composti. Questi candidati sono stati assemblati come strutture in grado di favorire la longevità. Per questo schermo, abbiamo effettuato 5 replicati delle piastre prova a due diverse dosi (50 µM e 100 µM). Inoltre, abbiamo usato 8 piastre di controllo negativo, con una piastra di singolo controllo positivo (NP1) contenente due dosi differenti; 50 µM e 100 µM.
Piastre di controllo negativo sono stati monitorati fino a ~ 90% degli animali erano morti. A quel tempo, pozzi sono stati segnati da vermi vivi e morti in tutti i pozzetti di controllo e da pozzi di prova contenente Vermi vivi di conteggio. La percentuale viva al tempo di punteggio sono stata utilizzata per calcolare una media percentuale punteggi vivi per ciascun pozzetto. Per i controlli negativi, 32 pozzi avevano punteggi percentuali vivi da 8 ripetizioni. Per i controlli positivi, c'erano 4 punteggi ben media attraverso 4 ripetizioni per ogni dose. Colpi sono stati chiamati per i pozzi con un punteggio di vivo percentuale media che era superiore alla media per cento di controllo negativo vivo Punteggio + 2 SD Questa frequenza di taglio 14 colpi a sinistra nella schermata del candidato ed esclusi tutti i pozzetti di controllo negativo. Quel taglio incluso anche tutto il positivo controllo pozzi trattati a 100 µM e 50% dei controlli positivi trattati a 50 µM. Questi risultati sono presentati qui come cestinate una media percentuali punteggi vivi per entrambi il 50 µM (Figura 2A) e le schermate di test 100 µM (Figura 2B).
Infine, tutti i piatti erano ri-ha ottenuti ad un punto di tempo tardo, che ha corrisposto ad un tempo quando superiore al 99% del controllo negativo trattati gli animali erano morti. Questi risultati hanno indicato che i pozzetti di controllo positivo lontano fuori-eseguita i pozzetti di controllo e test negativi (Figura 2C). Mentre i pozzi di prova erano leggermente meglio di controlli negativi. Questo risultato quest'ultimo è prevenuto dall'indicazione che molti dei pozzi prova sembravano mostrano una tossicità relativa al trattamento di controllo (tabella 1), quindi confondere questa semplice interpretazione. Questo era da aspettarselo, dato che la libreria candidati era un vero schermo di prodotti chimici con attività biologica sconosciuta in c. elegans, mentre lo schermo ri-testare era essenzialmente pre-screening per i composti che non erano tossici. Poiché questa schermata principale era per i composti che allunga la durata della vita, significativamente sostanze chimiche tossiche dovrebbero non nel ri-test impostati.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig1.jpg"> Figura 1 : Rappresentante deriva da un alto throughput schermo e ri-test Curva di sopravvivenza (A) da una piastra di controllo negativo rappresentativo utilizzata nell'analisi di ripetere il test. Questa curva è stata costruita dal segnando tutti i vermi vivi e morti a 24 pozzetti usati per questo test 4 volte sopra i 18 giorni del dosaggio. Giorno 18 di età adulta, i controlli sono stati valutati per avere sopravvivenza ~ 5% e poi sono stati segnati anche tutti i test di controllo e piastre. (B) tabella che riassume i risultati dello schermo e ripetere il test. (C) Binning dei pozzi in media percentuale punteggi vivo per le condizioni di controllo e di prova dalla schermata di ripetere il test. Per i controlli, punteggi sono da 48 pozzetti ciascuna consistente della media dei 3 replicati. Risultati del test sono da 179 pozzi ciascuno composto il Punteggio medio da tre replicati. Figura 1 è riprodotto da una precedente pubblicazione1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig2.jpg"> Figura 2 : Rappresentante risultati da uno schermo di candidati (A) Binning dei risultati dalla schermata del candidato di 50 µM. 139 risultati di prova-ben rappresentano il Punteggio vivo percentuale media da 5 replicati. 32 risultati di controllo negativo è costituito da una media percentuali punteggi vivi da 8 ripetizioni. 4 risultati di controllo positivo è costituito da una media percentuali punteggi vivi da 4 repliche (Totale 16 pozzetti contenenti NP1 a 50 µM). (B) Binning dei risultati dalla schermata del candidato di 100 µM. Tutto è lo stesso come in (A), salvo che i pozzi di prova e controlli positivi sono stati trattati alle concentrazioni di 100 µM. Le stesse piastre di controllo negativo sono mostrate in entrambi (A e B). (C) rappresentante risultati da ri-segnando le piastre presso un punto di tempo di ritardo relativamente estreme. Controlli positivi drammaticamente superato tutti gli altri, se solo contabilità per la percentuale di pozzi con vermi vivi a questo punto del tempo, che è prevenuto nei confronti di pozzi di prova, come descritto nel testo principale e tabella 1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="6">Binning dei punteggi vivi percentuale media</td>
		</tr>
<tr>
<td>Punteggi raggruppati</td>
			<td>Tutti morti (0)</td>
			<td>1-10</td>
			<td>11-20</td>
			<td>21-30</td>
			<td>31-40</td>
			<td>> 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ripetere il test</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>n # di (-) controllo</td>
			<td>16</td>
			<td>31</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># Test pozzi (50 µm)</td>
			<td>46</td>
			<td>69</td>
			<td>50</td>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Schermo del candidato</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>n # di (-) controllo</td>
			<td>0</td>
			<td>11</td>
			<td>21</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>n # di (+) controllo (50 µm)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>n # di (+) controllo (100 µm)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td># Test pozzi (50 µm)</td>
			<td>94</td>
			<td>22</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># Test pozzi (100 µm)</td>
			<td>86</td>
			<td>25</td>
			<td>21</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Risultati rappresentante da binning diversi schermi Qui vi presentiamo il binning dei media percentuali punteggi vivi dai due schermi (re-test e candidato). Nella schermata di ripetere il test, il picco è simile al controllo negativo con il re-test superando il controllo negativo drammaticamente sulla destra (lunga vita) lato del tavolo. Ciò indica la presenza di più pro-longevità composti presenti nel set di ripetere il test. Nella schermata di candidato, vediamo che il picco sia nella categoria tutti i morti, mentre c'è anche un evidente segnale dal lato destro della tabella. Questo indica la presenza di composti pro-longevità nel set di candidati, ma indica anche la presenza di tossicità significativa tra l'insieme di candidati di composti.

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Qui descriviamo un protocollo semplice per produrre rapidamente centinaia di agar media di crescita del nematode, piastre di coltura 96 pozzetti con un numero consistente di Caenorhhabditis elegans per pozzetto. Queste culture sono utili per lo screening fenotipico di interi organismi. Qui ci concentriamo sull'utilizzo di queste culture ai prodotti chimici schermo per effetti di pro-longevità.

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

a-simple-method-for-high-throughput-chemical-screening-caenorhabditis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

8.7K Views.  The Buck Institute for Research on Aging. Qui descriviamo un protocollo semplice per produrre rapidamente centinaia di agar media di crescita del nematode, piastre di coltura 96 pozzetti con un numero consistente di Caenorhhabditis elegans per pozzetto. Queste culture sono utili per lo screening fenotipico di interi organismi. Qui ci concentriamo sull'utilizzo di queste culture ai prodotti chimici schermo per effetti di pro-longevità.

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple and inexpensive method to obtain a large number of animals for the isolation of proteins to proceed with a western blot, mass spectrometry, or further proteomics analyses. Furthermore, an increase of nematode numbers for immunostainings and the integration of multiple analyses under the same culturing conditions can easily be achieved. Additionally, a transfer between plates with different experimental conditions is facilitated. Common techniques in plate culture involve the transfer of a single C. elegans using a platinum wire and the transfer of populated agar chunks using a scalpel. However, with increasing nematode numbers, these techniques become overly time-consuming. This protocol describes the large-scale culture of C. elegans including numerous steps to minimize the impact of the sample preparation on the physiology of the worm. Fluid and shear stress can alter the lifespan of and metabolic processes in C. elegans, thus requiring a detailed description of the critical steps in order to retrieve reliable and reproducible results. C. elegans is a model organism, consisting of neuronal cells for up to one-third, but lacking blood vessels, thus providing the possibility to investigate solely neuronal alterations independent of vascular control. Recently, early neurodegeneration in diabetic retinopathy was found prior to vascular alterations. Thus, C. elegans is of special interest for studying general mechanisms of diabetic complications. For example, an increased formation of advanced glycation end products (AGEs) and reactive oxygen species (ROS) is observed, which are reproducibly found in C. elegans. Protocols to handle samples of adequate size for a broader spectrum of investigations are presented here, exemplified by the study of diabetes-induced biochemical alterations. In general, this protocol can be useful for studies requiring large C. elegans numbers and in which liquid culture is not suitable.

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

This protocol describes a method for the large-scale cultivation of Caenorhabditis elegans on solid media. As an alternative to liquid culture, this protocol allows obtaining parameters of different scales under plate-based cultivation. This increases the comparability of results by omitting the morphological and metabolic differences between liquid and solid media culture.

Piastra-base di coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Biochimica

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Analisi automatizzata di un esame preferenziale di Chemosensory basato sulla popolazione di Nematode

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamento

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Un saggio di High-throughput per la previsione di tossicità chimica di Automated fenotipica profilatura di Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Ambiente

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biologia

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Immunologia e infezioni

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

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RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Analisi del comportamento di grande c. elegans popolazioni utilizzando un ampio campo di vista Monitoraggio piattaforma automatizzata

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemiotassi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Riepilogo

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Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode