Questo lavoro è stato supportato da National Natural Science Foundation of China (31371596), centro di ricerca Bio-tecnologia, Università di Cina tre gole (2016KBC04) e la Fondazione di scienze naturali della provincia di Jiangsu, Cina (BK20151424).

1. sequenza di allineamento
<ol><li>
Raccogliere le sequenze dell'amminoacido di dolce eucariotici e procariotico passato in documenti separati e li elenco in formato FASTA. Scaricare sequenze dal centro nazionale per Biotechnology Information (NCBI), European Molecular Biology Laboratory (EMBL) e la banca dati del DNA dei database Japan (DDBJ) ricerca di similitudine con lo strumento di base locale allineamento Cerca strumento (BLAST).
	<ol>
<li>Nei file d'esempio, raccogliere 228 sequenze della proteina presunta dolce che possiede due domini MtN3/saliva (7 eliche transmembrane) di 57 sequenze di proteine semidolce che possiedono un singolo dominio di MtN3/saliva (3 eliche transmembrane) dei procarioti ed eucarioti 13.</li>
		<li>Per semplificare il processo, è necessario selezionare 35 proteine dolci candidato da organismi unicellulari eucariotici tra i 228 dolci putativi per costruzione di alberi filogenetici. Queste sequenze sono fissate in modo che il lettore può praticare su un vero set di dati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Allineare le sequenze dolce 35 inserendo le loro in Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).
	<ol>
<li>Copiare e incollare le sequenze aminoacidiche in formato FASTA nella casella di input o caricare un file di sequenza in formato FASTA. Specificare che essi sono sequenza aminoacidica facendo clic sull'icona sotto menu pull-down nella sezione 'Passaggio 1'.</li>
		<li>Specificare il formato di output e altri parametri nella sezione 'Passaggio 2', se necessario. Per questo studio, impostare il formato di output come "clustal w/o numero" e lasciare gli altri parametri sulle impostazioni predefinite. Nella maggior parte dei casi, i parametri di default funzionano bene senza alcuna specifica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inviare ed eseguire l'allineamento nella sezione 'Passaggio 3'. Ovunque potrebbe richiedere da alcuni secondi a minuti fino a quando l'allineamento è finito. Nel pannello "Riassunto dei risultati", pulsante destro del mouse sul collegamento sotto il "allineamento in formato CLUSTAL" e salvare le sequenze allineate come "35.clustal" (Figura 1).</li>
	<li>
Aprire il file di risultati di allineamento in BioEdit.
	<ol>
<li>Il pannello principale di BioEdit, "Sequenza" e selezionare "Modificare Mood" nel primo menu a discesa, scegliere "Edit residui" nel sottomenu (Figura 2).</li>
		<li>Selezionare le sequenze che sporge sul lato sinistro dell'allineamento con il cursore (la sequenza selezionata verrà visualizzata in nero) e fare clic sull'icona "Elimina" sotto il menu "Edit" per rimuovere le sequenze selezionate (Figura 3).</li>
		<li>Selezionare Elimina le sequenze che sporge sul lato destro del primo dominio MtN3/saliva e salvare le sequenze di dominio MtN3/saliva prime profilate come 35-I.fas (Figura 4). Allo stesso modo, eliminare il lato sinistro e destro sporgente sequenze del secondo dominio MtN3/saliva e salvarlo come 35-II.fas. Il primo e il seconda sequenze di dominio MtN3/saliva possono essere previsto in anticipo con ritmo (http://proteinformatics.charite.de/rhythm/inndex.php?site=helix) o TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aprire il file 35-I.fas con MEGA e fare clic su "allineare" quando richiesto. Sotto il menu "Modifica", scegliere "Seleziona tutto", quindi fare clic su "Selezionare sequenze"; saranno selezionati i nomi e le sequenze dei taxa in nero (Figura 5).
	<ol>
<li>Scegliere "Copia" dal menu "Edit" per copiare le sequenze negli Appunti e quindi incollare le sequenze copiate in un file doc.</li>
		<li>Nel file doc, sostituire tutte le "#" con ">" e quindi eliminare eventuali caratteri indipendenti per convertirli in formato FASTA. Aggiungere "-io" alla fine del nome di ogni taxon di contrassegnarli come le prime sequenze di dominio MtN3/saliva. La seconda sequenza del dominio MtN3/saliva seguendo lo stesso metodo di processo e aggiungere "-II" dopo il nome di ogni taxon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Combinare la prime e la seconda MtN3/saliva dominio sequenze in formato FASTA in un file doc.
	<ol>
<li>Caricare nuovamente le sequenze combinate in Clustal Omega e allineare le sequenze come descritto sopra. Salvare il risultato come "35 realigned.clustal".</li>
		<li>Aprire il file "35 realigned.clustal" in BioEdit, eliminare i residui dell'amminoacido (sporgente) irregolare alle estremità delle sequenze allineate e quindi salvare le sequenze come "35 realigned.fas". Fare clic su "Sì" quando ha avvertito che alcuni caratteri non standard non possono essere salvati.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. calcolo dell'albero filogenetico
<ol><li>
Aprire "35 realigned.fas" in MEGA.
	<ol>
<li>Fare clic sul menu "Dati" e scegliere "Esporta allineamento" e salvare l'allineamento in formato microscopio (nexus) come "35.nex" per un uso successivo in MrBayes (Figura 6).</li>
		<li>Nel frattempo, fare clic sull'icona di "Modelli" sul pannello principale del MEGA, scegliere "trovare migliori modelli di DNA/Protein (ML)" e fare clic su "OK" sulla finestra a comparsa. Fare clic su "Calcola" per iniziare il modello di processo (Figura 7) di ricerca. Si aprirà un nuovo pannello di progresso; Questo processo dura diversi minuti a diversi giorni, a seconda della complessità delle sequenze caricate e le prestazioni del computer. Nota: Una tabella indicante che i risultati apriranno al termine il processo di ricerca del modello ( Figura 8). Il più piccolo Punteggio BIC sarà elencato in primo luogo, seguito da una serie di diversi modelli con gradualmente aumentando i punteggi di BIC. Il primo modello "LG + G + F" con il Punteggio di BIC più piccolo è il modello consigliato per ML albero basato sul file "35 realigned.fas".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare clic sull'icona "Filogenesi" sul pannello principale del MEGA, fare clic su "Costrutto/Test the massima probabilità Tree" e quindi fare clic su "Sì" il pannello a comparsa. Una nuova finestra si aprirà mostrando diversi parametri che devono essere specificati (Figura 9).
	<ol>
<li>In primo luogo, impostare il valore di bootstrap nel test della finestra di filogenesi; 500 o 1.000 è adeguata nella maggior parte dei casi. Sotto il modello di sostituzione, scegliere "aminoacido" come il tipo di sostituzione. Lo scopo di scegliere un modello di sostituzione è quello di stimare la vera differenza tra sequenze in base alle loro attuali stati3.</li>
		<li>Selezionare "LG con Freqs. (+F) modello "(LG + F) nella casella modello/metodo. Nella casella modello e tariffe, selezionare "Gamma distribuita" (G) per descrivere le variazioni di tasso tra i siti, i. e., dare più peso alle modifiche in lenta evoluzione siti3. Nella casella sottoinsieme di dati, selezionare "Completare eliminazione" per rimuovere tutte le colonne che contengono trattini.</li>
		<li>Tenere tutti gli altri parametri negli stati predefiniti (Figura 9). Dopo specifica di questi parametri, fare clic sull'icona "Compute" per avviare il calcolo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. presentazione dell'albero filogenetico
Nota: Un albero filogenetico di ML sarà presentato quando è finito il calcolo utilizzando MEGA (Figura 10).
<ol><li>Sotto menu pull-down dell'icona sul pannello albero "File", scegliere "Salva sessione corrente" per salvare il risultato (. Mas è il tipo di file predefinito). Nello studio presente, il risultato è stato salvato come "35.mas". Il pannello di albero, molti parametri tra cui la durata del clade, albero stile, topologia albero, tipo di carattere del taxon nome, dimensione e colore, vengono visualizzati e può essere impostata su diverse opzioni.</li>
	<li>Salvare il file dell'albero finale facendo clic sull'icona di immagine e salvare la figura in diversi formati o copiare l'immagine come origine per fotoritocco.</li>
</ol>4. analisi del rapporto tra dolci e SemiSWEETs utilizzando l'allineamento di sequenza
Nota: Questo passaggio potrebbe non essere necessaria in analisi di sequenza ordinaria.
<ol><li>Allineare i 228 dolci eucariotici e procariotiche 57 SemiSWEETs in Clustal Omega come descritto sopra. I risultati di allineamento possono essere mostrati in Jalview, che è integrato in Clustal Omega e copiato per salvare in un editor di foto (Figura 11). Nota: L'allineamento di esempio, alcuni SemiSWEETs da α-Proteobacteria sono allineati con il primo dominio di MtN3/saliva delle sequenze dolce, considerando che SemiSWEETs da Metanobatteri (archaea) sono allineati con il secondo dominio MtN3/saliva delle sequenze di dolce.</li>
</ol>5. phylogenetic Tree costruzione con MrBayes
<ol><li>Per l'inferenza bayesiana con MrBayes, aprire il file eseguibile di MrBayes e un'interfaccia DOS arrivi in una nuova finestra. Il primo passo è quello di leggere il ﬁle di dati di nexus. Ingresso "eseguire 35.nex" dopo il prompt (ricordatevi di salvare il file di nex 35. nella stessa directory del file eseguibile MrBayes, o indicare il percorso del file prima di caricarlo). Apparirà un messaggio di "successo matrice lettura" successivi all'ultimo dei taxa elencati (Figura 12). Il file di nex 35. è già stato preparato e salvato in MEGA (vedere precedente punto 2.1).</li>
	<li>
Impostare il modello evolutivo.
	<ol>
<li>Dopo il prompt, digitare "prset aamodelpr = fixed(lg); LSet tariffe = g ". La "lg" e "g" corrispondono al modello "LG" e "G" che si trova nel MEGA. Dopo aver impostato correttamente il modello, digitare "mcmc nchains = 4 ngen = 5.000.000" dopo il prompt. Utilizzare il "nchains = 4" voce indica un numero totale di una catena del freddo e calde tre catene per accoppiamento di Metropolis. "ngen = 5.000.000" significa eseguire generazioni 5.000.000 di accoppiamento di Metropolis per la convergenza delle catene calde e fredde. In questo studio, scarto quadratico medio di Spalato frequenze inferiori a 0,01 è stato considerato come convergenza delle catene di piatti calde e fredde.</li>
		<li>Si noti che il numero di ngen non può essere previsto con precisione all'inizio del processo e di solito deve essere regolata basata sul cambiamento nella deviazione standard media delle frequenze di Spalato. Inoltre, il numero di ngen per convergenza può essere diverso ogni volta quando in esecuzione il programma basato sugli stessi dati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eseguire l'analisi: Questa fase dura da alcuni minuti a diversi giorni, a seconda della complessità dei dati di input e le prestazioni del computer. Dopo aver completato il calcolo predefinito, verrà richiesto "Continuare con analisi (sì/no)?" Se "no" viene digitato dopo il prompt, il computing si fermerà (Figura 13), altrimenti continuerà a calcolare dopo il numero di ulteriori generazioni è inserito. Quando è finito il calcolo (con una deviazione standard media di Spalato frequenze < 0.01 o 0,05), interrompere il calcolo digitando "n" dopo il prompt di richiesta. Nota: 0,01 è un criterio rigoroso, 0.05 è moderata e di solito adeguato.</li>
	<li>
Riassumere i campioni: Digitare "pozzetto" dopo il prompt per riepilogare i campioni dei parametri del modello (Figura 14). Quindi digitare "Bibola relburnin = yes burninfrac = 0.25" dopo il prompt per riepilogare i campioni dell'albero. Informazioni dettagliate sulla costruzione di alberi filogenetici verranno visualizzati come in Figura 15, seguita da due figure di albero che appariranno nel codice ASC II su schermo, un mostrando clade credibilità e le altre lunghezze del ramo visualizzando. Allo stesso tempo, un file di albero con il nome di "35.nex.con" verrà salvato automaticamente.</li>
	<li>Per una migliore presentazione dell'albero filogenetico, aprire il file di albero "35.nex.con" con lo strumento FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/), selezionare uno stile o un formato per visualizzare il risultato (Figura 16) o anche modificarlo in un editor di foto per renderlo più facile lettura.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Sta diventando sempre più popolare nella ricerca biologica per fare un albero filogenetico basato su nucleotide o dell'amminoacido sequenze8. In generale, ci sono tre fasi critiche della pratica compreso l'allineamento di sequenza, valutazione delle sequenze allineate con l'algoritmo o il metodo corretto e la visualizzazione del risultato computazionale come un albero filogenetico. Nello studio presentato, sono state condotte tre turni di allineamento di sequenza: in primo luogo, le sequenze di p...

Sequenze di DNA o RNA trasportano informazioni genetiche per i fenotipi sottostanti che può essere analizzato attraverso metodi fisiologici e biochimici o osservato attraverso prove morfologiche e fossili. In un certo senso, è più affidabile di valutazione esterni fenotipi perché il primo è la base per quest'ultima informazione genetica. In studio evolutivo, prova fossile è molto diretta e convincente. Tuttavia, molti organismi, quali microrganismi, hanno poche possibilità di formare un fossile durante Età geologiche lungo. Pertanto, informazioni molecolari quali sequenze nucleotidiche e sequenze dell'amminoacido da organismi esistenti correlati sono di valore per esplorare relazioni evolutive1. Nello studio presente, è stata fornita una semplice introduzione di conoscenza di base filogenetica protocollo facile da imparare per i nuovi arrivati che hanno bisogno di costruire un albero filogenetico in proprio.
Sia DNA (nucleotidi) e sequenze di proteine (aminoacidi) possono essere utilizzati per dedurre le relazioni filogenetiche tra geni omologhi, organelli o anche organismi2. Sequenze di DNA sono maggiori probabile di essere colpiti dai cambiamenti nel corso dell'evoluzione. Al contrario, sequenze dell'amminoacido sono molto più stabili, dato che sinonima mutazioni nelle sequenze nucleotidiche non causano mutazioni nelle sequenze dell'amminoacido. Di conseguenza, sequenze di DNA sono utili per il confronto di geni omologhi da organismi strettamente correlati, mentre sequenze dell'amminoacido sono appropriati per geni omologhi da organismi lontanamente correlati3.
Un'analisi filogenetica inizia con l'allineamento dell'amminoacido o nucleotide sequenze4 Estratto da un genoma con annotazioni sequenziamento database5 elencati in formato FASTA, vale a dire, proteina espressa o presunta sequenze, sequenze di RNA , o sequenze di DNA. Vale la pena notare che è fondamentale per raccogliere sequenze di alta qualità per l'analisi, e sequenze omologhe solo possono essere utilizzati per analizzare le relazioni filogenetiche. Molte piattaforme diverse come Clustal W, Clustal X, muscolo, T-caffè, MAFFT, può essere utilizzato per l'allineamento di sequenza. Il più ampiamente usato è Clustal Omega6,7 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), che può essere utilizzato online o può essere scaricato gratuitamente gratuitamente. Lo strumento di allineamento ha molti parametri che l'utente può regolare prima di iniziare l'allineamento, ma i parametri di default funzionano bene nella maggior parte dei casi. Dopo il processo è completo, le sequenze allineate devono essere salvate nel formato corretto per il passaggio successivo. Essi devono quindi essere modificati o tagliati utilizzando un software di editing, come ad esempio BioEdit, perché la costruzione di alberi filogenetici da MEGA richiede le sequenze per essere di uguale lunghezza (inclusi sia dell'amminoacido abbreviazioni e trattini. Nella sequenza allineata, qualsiasi posizione senza un amminoacido o nucleotide è rappresentato da un trattino "-"). In generale, tutte le sporgenti aminoacidi o nucleotidi alle due estremità dell'allineamento dovrebbe essere rimosso. Inoltre, le colonne che contengono le sequenze scarsamente allineate nell'allineamento possono essere eliminate perché trasmettere poche preziose informazioni e a volte può dare confusione o false informazioni3. Le colonne contenenti uno o più trattini possono essere eliminate in questo momento o nella successiva fase di costruzione di albero. In alternativa, sono utilizzabili per il calcolo filogenetica. Al termine della sequenza di allineamento e di rifilatura, le sequenze allineate devono essere salvate in formato FASTA, o il formato desiderato, per un uso successivo.
Molte piattaforme di software forniscono funzioni di costruzione albero utilizzando diversi metodi o algoritmi. In generale, i metodi possono essere classificati come metodi di matrice di distanza o metodi di dati discreti. Metodi di matrice di distanza sono semplici e veloci per calcolare, mentre i metodi di dati discreti sono complicati e che richiede tempo. Per taxa strettamente correlate con un alto grado di condivisione dell'identità di sequenza dell'amminoacido o nucleotide, un metodo di matrice di distanza (Neighbor unendo: NJ; Metodo di gruppo coppia non ponderata con media aritmetica: UPGMA) è appropriato; lontanamente correlate taxa, un metodo di dati discreti (metodo della massima verosimiglianza: ML; Massima parsimonia: MP; Inferenza bayesiana) è ottimale3,8. In questo studio, i metodi di ML in MEGA (6.0.6) e inferenza bayesiana (MrBayes 3.2) sono stati applicati per costruire alberi filogenetici9. Idealmente, quando vengono utilizzati i parametri e il modello adeguato, i risultati derivati da diversi metodi possono essere coerenti, e sono dunque più affidabile e convincente.
Per un albero filogenetico di ML costruito utilizzando MEGA10, il file di sequenza allineata in formato FASTA deve essere caricato nel programma. Il primo passo è quindi di selezionare il modello di sostituzione ottimale per i dati caricati. Tutti i modelli di sostituzione disponibili vengono confrontati in base sulle sequenze caricate, e loro punteggi finali verranno mostrati in una tabella di risultati. Selezionare il modello con il Punteggio di criterio BIC (Bayesian Information) più piccolo (elencato per primo nella tabella), impostare i parametri di ML secondo il modello raccomandato e avviare il calcolo. Il tempo di calcolo varia da alcuni minuti a diversi giorni, a seconda della complessità dei dati caricati (lunghezza delle sequenze e numero di taxa) e le prestazioni del computer su cui vengono eseguiti i programmi. Quando il calcolo è finito, un albero filogenetico appare in una nuova finestra. Salvare il file come "FileName.mat". Dopo aver impostato i parametri per specificare l'aspetto dell'albero, salvare ancora una volta. Utilizzando questo metodo, MEGA è in grado di generare figure di pubblicazione grado albero filogenetico.
Per la costruzione di albero con MrBayes11, il primo passo è quello di trasformare la sequenza allineata, che di solito è elencata in formato FASTA, in formato nexus (NEX come tipo di file). Trasformazione di file FASTA in nexus formato possono essere elaborati in MEGA. Successivamente, la sequenza allineata nel nexus formato possa essere caricata in MrBayes. Quando il file viene caricato correttamente, è necessario specificare i parametri dettagliati per il calcolo dell'albero. Questi parametri includono dettagli come modello di sostituzione dell'amminoacido, tassi di variazione, numero catena-catena di Markov Monte Carlo (MCMC) accoppiamento, numero ngen, media deviazione standard delle frequenze di Spalato e così via. Dopo questi parametri sono stati specificati, è possibile avviare il calcolo. Alla fine, due figure di albero in ASC II codice, un visualizzando clade credibilità e le altre lunghezze del ramo visualizzando, verrà visualizzato sullo schermo.
Il risultato di albero verrà salvato automaticamente come "FileName.nex.con". Questo file di albero può essere aperto e modificato da FigTree, e la cifra in FigTree può essere modificata ulteriormente per renderlo più adatto per la pubblicazione.
In questo studio, 228 proteine dolci, tra cui 35 dolci da eucarioti unicellulari e 57 SemiSWEETs da procarioti, sono stati analizzati come un esempio. I dolci e il SemiSWEETs sono stati caratterizzati come glucosio, fruttosio o saccarosio trasportatori attraverso membrane12,13. L'analisi filogenetica suggerisce che i due domini MtN3/saliva contenente dolci potrebbero essere derivati da una fusione evolutiva di un passato batterica e di un archaeon14.

<table><tbody><tr><td>Adobe Illustration</td><td></td><td></td><td>a graphical tool developed by Adobe Systems Software Ireland Ltd. Copyright &amp;copy; 2017</td></tr><tr><td>BioEdit</td><td></td><td></td><td>a biological sequence alignment editor written for Windows 95/98/NT/2000/XP/7. Copyright &amp;copy; Tom Hall</td></tr><tr><td>Clustal Omega</td><td></td><td></td><td>a package for making multiple sequence alignments of amino acid or nucleotide sequences.&amp;nbsp; http://www.clustal.org/</td></tr><tr><td>CorelDRAW</td><td></td><td></td><td>a graphic design software. Copyright &amp;copy; 2017 Corel Corporation</td></tr><tr><td>FigTree</td><td></td><td></td><td>a graphical viewer of phylogenetic trees designed by the University of Edinburgh</td></tr><tr><td>MEGA</td><td></td><td></td><td>MolecularEvolutionary Genetics Analysis version6.0 http://www.megasoftware.net/home</td></tr><tr><td>MrBayes</td><td></td><td></td><td>an Bayesian phylogenetic inference tool</td></tr><tr><td>NVIDIA</td><td></td><td></td><td>a company designs graphics processing units (GPUs) for the gaming and professional markets. Corporation Copyright &amp;copy; 2017</td></tr><tr><td>PAUP</td><td></td><td></td><td>Phylogenetic Analysis Using Parsimony. David Swofford&#039;s program implements the maximum likelihood method under a number of nucleotide models.</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td></td><td></td><td>a raster graphics editor developed and published by Adobe Systems Software Ireland Ltd. Copyright &amp;copy; 2017</td></tr><tr><td>RHYTHM</td><td></td><td></td><td>a knowledge based prediction of hekix contacts. Charit&amp;eacute; Berlin &amp;ndash; Protein Formatics Group - Copyright 2007-2009</td></tr><tr><td>TMHMM</td><td></td><td></td><td>a tool for prediction of transmembrane helices in proteins. http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/</td></tr><tr><td>Compter</td><td></td><td></td><td>4 GB memory, Core 2 or above CPU. Windows 7, Windows 10</td></tr></tbody></table>

using phylogenetic analysis to investigate eukaryotic gene origin

L'analisi filogenetica utilizza del nucleotide o sequenze aminoacidiche o altri parametri, quali sequenze di dominio e struttura tridimensionale, per costruire un albero per mostrare le relazioni evolutive tra diversi taxa (unità di classificazione) presso il molecolare livello. L'analisi filogenetica può essere utilizzata anche per indagare le relazioni di dominio nell'ambito di un singolo taxon, particolarmente per organismi che hanno subito un sostanziale cambiamento nella morfologia e fisiologia, ma per cui i ricercatori mancano prove fossili a causa della degli organismi lunga storia evolutiva o scarsità di fossilizzazione.
In questo testo, un protocollo dettagliato è descritto con il metodo filogenetico, compreso l'allineamento di sequenza dell'amminoacido usando la costruzione albero filogenetico successive utilizzando entrambi probabilità massima (ML) di genetica molecolare evolutiva e Clustal Omega Analisi (MEGA) e inferenza bayesiana tramite MrBayes. Per indagare l'origine di geni eucariotici Zuccheri sarà alla fine essere esportati i trasportatori (dolce), 228 dolci tra cui 35 dolce da eucarioti unicellulari e semidolce 57 proteine da procarioti sono stati analizzati. Interessante, SemiSWEETs sono stati trovati nei procarioti, ma dolci sono stati trovati negli eucarioti. Due alberi filogenetici costruiti utilizzando metodi teoricamente distinti costantemente hanno suggerito che il primo gene eucariotico dolce potrebbe derivano dalla fusione di un gene batterico semidolce e un gene semidolce degli Archaea. Vale la pena notare che uno dovrebbe essere prudente per trarre una conclusione basata esclusivamente sull'analisi filogenetica, anche se è utile spiegare il rapporto sottostante tra taxa diversi, che è difficile o addirittura impossibile discernere attraverso mezzi sperimentali .

Alberi filogenetici mostrano che tutti i domini di MtN3/saliva primi delle sequenze dolce 35 cluster come un clade e i domini di MtN3/saliva secondo delle sequenze dolce cluster come un altro clade. Inoltre, risultati di allineamento delle dolci e SemiSWEETs mostrano che alcuni SemiSWEETs da α-Proteobacteria allineato con il primo dominio di MtN3/saliva delle sequenze dolce, considerando che SemiSWEETs da Metanobatteri (archaea) allineato con la seconda MtN3/saliva dominio delle sequenze...

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Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

È descritto un metodo per costruire un albero filogenetico basato su omologia di sequenza di dolci da eucarioti e SemiSWEETs da procarioti. L'analisi filogenetica è uno strumento utile per spiegare la parentela evolutiva tra proteine omologhe o geni da gruppi di organismi diversi.

Utilizzando l'analisi filogenetica di indagare l'origine genica negli eucarioti

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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Molecular Biology

Immunology and Infection

Unit 2

Genomes and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

15.7K Views.  China Three Gorges University. È descritto un metodo per costruire un albero filogenetico basato su omologia di sequenza di dolci da eucarioti e SemiSWEETs da procarioti. L'analisi filogenetica è uno strumento utile per spiegare la parentela evolutiva tra proteine omologhe o geni da gruppi di organismi diversi.

Video: Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations

Routine and systematic use of bacterial whole-genome sequencing (WGS) is enhancing the accuracy and resolution of epidemiological investigations carried out by Public Health laboratories and regulatory agencies. Large volumes of publicly available WGS data can be used to study pathogenic populations at a large scale. Recently, a freely available computational platform called ProkEvo was published to enable reproducible, automated, and scalable hierarchical-based population genomic analyses using bacterial WGS data. This implementation of ProkEvo demonstrated the importance of combining standard genotypic mapping of populations with mining of accessory genomic content for ecological inference. In particular, the work highlighted here used ProkEvo-derived outputs for population-scaled hierarchical analyses using the R programming language. The main objective was to provide a practical guide for microbiologists, ecologists, and epidemiologists by showing how to: i) use a phylogeny-guided mapping of hierarchical genotypes; ii) assess frequency distributions of genotypes as a proxy for ecological fitness; iii) determine kinship relationships and genetic diversity using specific genotypic classifications; and iv) map lineage differentiating accessory loci. To enhance reproducibility and portability, R markdown files were used to demonstrate the entire analytical approach. The example dataset contained genomic data from 2,365 isolates of the zoonotic foodborne pathogen Salmonella Newport. Phylogeny-anchored mapping of hierarchical genotypes (Serovar -&#62; BAPS1 -&#62; ST -&#62; cgMLST) revealed the population genetic structure, highlighting sequence types (STs) as the keystone differentiating genotype. Across the three most dominant lineages, ST5 and ST118 shared a common ancestor more recently than with the highly clonal ST45 phylotype. ST-based differences were further highlighted by the distribution of accessory antimicrobial resistance (AMR) loci. Lastly, a phylogeny-anchored visualization was used to combine hierarchical genotypes and AMR content to reveal the kinship structure and lineage-specific genomic signatures. Combined, this analytical approach provides some guidelines for conducting heuristic bacterial population genomic analyses using pan-genomic information.

This analytical computational platform provides practical guidance for microbiologists, ecologists, and epidemiologists interested in bacterial population genomics. Specifically, the work presented here demonstrated how to perform: i) phylogeny-guided mapping of hierarchical genotypes; ii) frequency-based analysis of genotypes; iii) kinship and clonality analyses; iv) identification of lineage differentiating accessory loci.

Estrazione euristica di genotipi gerarchici e loci genomici accessori in popolazioni batteriche

Routine and systematic use of bacterial whole-genome sequencing (WGS) is enhancing the accuracy and resolution of epidemiological investigations carried ...

Ricerca

Genetica

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Neuroscienze

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the prediction of family functions based on several features, such as the presence of sequence motifs or of particular sites for post-translational modification and the expression profile of family members in different conditions. This work describes a detailed protocol for gene family characterization. Here, the procedure is applied to the characterization of the Arabidopsis T&#243;xicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitin ligase family in grapevine. The methods include the genome-wide identification of family members, the characterization of gene localization, structure, and duplication, the analysis of conserved protein motifs, the prediction of protein localization and phosphorylation sites as well as gene expression profiling across the family in different datasets. Such procedure, which could be extended to further analyses depending on experimental purposes, could be applied to any gene family in any plant species for which genomic data are available, and it provides valuable information to identify interesting candidates for functional studies, giving insights into the molecular mechanisms of plant adaptation to their environment.

This article describes the procedure for the identification and characterization of a gene family in grapevine applied to the family of Arabidopsis T&#243;xicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitin ligases.

Flusso di lavoro globale per l'identificazione del genoma e la Meta-analisi di espressione della famiglia genica ATL E3 ubiquitina ligasi a Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...

Biologia

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus on one or more gene families that are significant to the organism and study. In this protocol, we outline bioinformatic steps to generate a phylogeny and to quantify the expression of genes of interest. Phylogenetic trees can give insight into how genes are evolving within and between species as well as reveal orthology. These results can be enhanced using RNA-seq data to compare the expression of these genes in different individuals or tissues. Studies of molecular evolution and expression can reveal modes of evolution and conservation of gene function between species. The characterization of a gene family can serve as a springboard for future studies and can highlight an important gene family in a new genome or transcriptome paper.

The purpose of this protocol is to investigate the evolution and expression of candidate genes using RNA sequencing data.

Una pipeline bioinformatica per lo studio dell'evoluzione molecolare e dell'espressione genica usando RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

Un approccio integrato per l'identificazione delle microproteine e l'analisi delle sequenze

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...

Evolutionary Relationships

Humans have been attempting to properly classify living things since Aristotle made the first attempt during the 4th century BC. Aristotle&#8217;s system was improved upon during the Renaissance and then, subsequently, by Carolus Linnaeus in the mid 1700&#8217;s. These more formal classification and organization systems grouped species by their physical similarity to one another. For example, all vertebrates have a backbone, but invertebrates do not. Traits like the backbone are called synapomorphies, which are traits that are shared by a group of organisms, presumably because they were derived from a common ancestor. As we will explore, this method has been shown to have limitations and has more recently been amended to include genetic analysis. Still, scientists construct trees called dendrograms to create a visual representation of how species are related to one another and share common ancestors. These dendrograms can aid in our understanding of the evolutionary processes that drive these relationships. Genetic comparisons have added an important tool guiding the analysis of evolutionary relationships.
<h4>Types of Dendrogram</h4>
A type of dendrogram, called a cladogram, depicts the hypothetical genealogical relationships between species with the tips (or leaves) of the tree representing a species and the branches showing how species are related to each other. A slightly more complicated type of tree, called a phylogram, differs from a cladogram in that the branches leading to the species are of different lengths. The length of a branch in this type of tree represents the degree of change between species: the longer the branch, the more time since the species have diverged from a common ancestor. In both types of tree, the common ancestor of a group of species is indicated by a node, which is the point where a series of branches meet. Species that are more closely related to each other (most recently shared a common ancestor) will be located closest to the node. The two species that share a node are called a sister group1.
<h4>Understanding Evolutionary Relationships using Genetic Data</h4>
Historically, cladograms were constructed by comparing the morphology (physical structure) of organisms. This method is still practiced but the techniques have been modernized to include comparison of DNA (deoxyribonucleic acid) sequences between species. Using DNA for building trees has several advantages over relying solely on morphology, including being able to calculate an estimate of how long ago different species shared a common ancestor1. However, using DNA is not always feasible, especially when trees include extinct organisms. DNA is best found in soft tissues, which are not preserved during the fossilization process, and therefore it is uncommon for a DNA sample of an extinct species to be available.
DNA is passed on from parents to their offspring in hereditary units called genes. The nucleotide (A, G, C, and T) sequence of genes found in different species are frequently quite similar, likely due to their having come from a common ancestor. This fact allows researchers to align sequences from different species with one another to build the trees described above. Species with more similarity between their nucleotide sequences will be placed next to each other in a tree, and species with less sequence similarity will be placed further apart from each other.
Bioinformatics are the tools used by biologists to analyze large datasets using a combination of computer science, mathematical modeling, and statistics. One such tool is called BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), which can be used to quickly search the entire genome of any species that is available in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database2. The NCBI database combines several different databases that hold different types of DNA sequence information. The process of a BLAST search includes complex computer algorithms, but basically, BLAST aligns sequences of each nucleotide base from a submitted DNA sequence (known as the query sequence) with sequences in the data base that most closely match it. The DNA sequences that are found will be listed in order of similarity to the sequence in question, and will therefore be from species closely related to the species containing the query gene. This comparison may or may not depict the actual evolutionary relationship between species because genes evolve at different rates. Additionally, genomes sometimes contain more than one instance of a similar sequence.
Comparison of DNA sequences of genes is valuable beyond consideration of evolutionary relationships. Frequently, genes are identified in model organisms, such as the fruit fly, Drosophila melanogaster, or the mouse3. Integral to studying a gene, the function of its product is commonly identified and analyzed. If a researcher is interested in studying that function in a different organism (humans for example), BLAST or other bioinformatic tools can be used to find candidate genes based on their similarities to the genes of known function from model organisms.
Human genes can also be used as the starting point to find homologs in model organisms. In fact, human disease research depends heavily on this. Once a human gene of interest is identified, mice can be genetically manipulated to have the homologous gene disrupted, or &#8220;knocked out,&#8221; creating a model of the human disease that can be studied in order to understand and treat the disease. There are many of these mouse strains currently available. For example, there is a mouse model for human Cystic Fibrosis (CF) called the Cftr knockout mouse and another modeling atherosclerosis, called the Apoe knockout3. 
 
<h4>References:</h4>
<ol class="references">
	<li>Annenberg Learner. Online Textbook: Unit 3 Evolution and Phylogenetics. Rediscovering Biology. [Online] 2017. [Cited: August 23, 2018.] https://www.learner.org/courses/biology/textbook/compev/compev_3.html.</li>
	<li>National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. [Online] https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.</li>
	<li>National Human Genome Research Institute. Background on Mouse as a Model Organism. National Human Genome Research Institute. [Online] December 2002. [Cited: August 23, 2018.] <a href="https://www.genome.gov/10005834/background-on-mouse-as-a-model-organism/" target="__blank">https://www.genome.gov/10005834/background-on-mouse-as-a-model-organism/</a>.</li>
</ol>

Evolutionary Relationships: Using BLAST to Test Evolutionary Hypotheses - Concept

Relazioni evolutive

Humans have been attempting to properly classify living things since Aristotle made the first attempt during the 4th century BC. Aristotle&#8217;s system ...

Didattica

JoVE Lab Manual

Evoluzione

Evolutionary Relationships through Genome Comparisons

Genome comparison is one of the excellent ways to interpret the evolutionary relationships between organisms. The basic principle of genome comparison is that if two species share a common feature, it is likely encoded by the DNA sequence conserved between both species. The advent of genome sequencing technologies in the late 20th century enabled scientists to understand the concept of conservation of domains between species and helped them to deduce evolutionary relationships across diverse organisms.
Genome comparison can reveal three levels of evolutionary relationships. The first level provides deep insight into sequences and protein domains that are conserved across diverse groups of organisms, such as humans and fishes. The second level increases the resolution further to identify the unique DNA elements present in the closely related species, such as humans and chimpanzees. The third level with even higher data resolution distinguishes the genetic differences within a species, such as different variants and subtypes of an organism. This high-level resolution may identify mutations particular to individual microbial strains or clusters of infected cases, helping to track the disease outbreaks.
<h4>DNA sequencing tools</h4>
Several methods can be used to obtain the DNA sequence data required to deduce evolutionary relationships. Among them, whole-genome sequencing or WGS is a widely used technique. It provides high-resolution data extremely helpful to analyze mutations and conserved sequences among several organisms. It can also identify the cause of genetic disorders by comparing the DNA sequence of affected individuals to those of other unaffected subjects.
<h4>Data analysis tools</h4>
The data obtained by WGS or similar sequencing methods is analyzed by appropriate software tools to deduce evolutionary relationships. Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) is one of the most widely used software tools. The programs present in the MEGA, such as assembly sequence alignment, building evolutionary trees, estimating genetic distances, and computation of evolutionary time trees, allow the users to curate and interpret the raw data obtained from sequencing techniques.

Relazioni evolutive attraverso confronti del genoma

Genome comparison is one of the excellent ways to interpret the evolutionary relationships between organisms. The basic principle of genome comparison is ...

Biologia Molecolare

Unità 2

Genomi ed evoluzione

TERMINI E CONCETTI CHIAVE

Genomic DNA in Eukaryotes

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. To fit their genomes into a cell, eukaryotic DNA is packaged extraordinarily tightly inside the nucleus. To achieve this, DNA is tightly wound around proteins called histones, which are packaged into nucleosomes that are joined by linker DNA and coil into chromatin fibers. Additional fibrous proteins further compact the chromatin, which is recognizable as chromosomes during certain phases of cell division.

<h4>The Human Genome Measured in Meters</h4>

Most cells in the human body contain about 6 billion base pairs of DNA packaged into 23 pairs of chromosomes. It is hard to imagine exactly how much DNA these numbers represent, and therefore it is difficult to grasp how densely packed DNA must be to fit into a cell. We can gain some insight by expressing the genome in terms of length. If we were to arrange the DNA of a single diploid cell into a straight line, it would be about two meters long!

Note that humans do not have unusually large genomes. Many fish, amphibians, and flowering plants have much larger genomes than humans. For example, the haploid genome of the Japanese flowering plant Paris japonica contains about 50 times more DNA than the human haploid genome. These figures emphasize the astonishing work that histones and other chromatin remodeling proteins must do to package DNA.

Compaction of GenomIc DNA in Eukaryotes

DNA genomico negli eucarioti

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. To fit their genomes into a cell, eukaryotic DNA is packaged extraordinarily tightly inside the ...

Processi cellulari

Ciclo e divisione cellulare

Eukaryotic Evolution

The endosymbiont theory is the most widely accepted theory of eukaryotic evolution; however, its progression is still somewhat debated. According to the nucleus-first hypothesis, the ancestral prokaryote first evolved a membrane to enclose DNA and form the nucleus. Conversely, the mitochondria-first hypothesis suggests that the nucleus was formed after endosymbiosis of mitochondria.
Contrary to the endosymbiont theory, the eukaryote-first hypothesis proposes that the simpler prokaryotic and archaeal life forms evolved from the already existing complex eukaryotic cells.
Evidence for Endosymbiont Theory 
Evidence for the endosymbiont theory comes from the many similarities that the eukaryotic organelles, like mitochondria and chloroplast, share with prokaryotic cells. Like the prokaryotic cells, mitochondria and chloroplasts contain circular, double-stranded genomes devoid of histones. These organelles also divide by the process of fission, similar to bacterial cell division, rather than by mitosis. Of the two membranes that surround them, the inner membranes resemble the bacterial plasma membrane in lipid and protein composition. Finally, the structure of genes, genetic code, and translational machinery (such as ribosomes) in these organelles are more similar to the prokaryotic machinery than eukaryotic.
LECA - Last Eukaryotic Common Ancestor
All eukaryotes are believed to have evolved from the Last Eukaryotic Common Ancestor or LECA about 1100 to 2300 million years ago. It is thought that LECA had already acquired endosymbionts like mitochondria and chloroplast by this stage. The new organelles made these ancestral cells more efficient and powerful, which allowed them to evolve novel characteristics such as multicellularity and cellular specialization. Their large cell size and internal compartmentalization also allowed their genomes to increase in size during the course of evolution. However, only a small portion of this genome encoded proteins; the major portion was non-coding DNA mostly involved in regulatory processes. The ability to turn genes on and off when required was key to cell specialization and responding to environmental changes. Phylogenetic and comparative genomic studies show five to six eukaryotic supergroups that evolved from LECA and later diverged into the plethora of life forms we see today.

Evoluzione eucariotica

The endosymbiont theory is the most widely accepted theory of eukaryotic evolution; however, its progression is still somewhat debated. According to the ...

Cell Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

Gene Evolution - Fast or Slow?

The genomes of eukaryotes are punctuated by long stretches of sequence which do not code for proteins or RNAs. Although some of these regions do contain crucial regulatory sequences, the vast majority of this DNA serves no known function. Typically, these regions of the genome are the ones in which the fastest change, in evolutionary terms, is observed, because there is typically little to no selection pressure acting on these regions to preserve their sequences.
In contrast, regions which code for a protein might experience high selection pressure, because any changes in their sequence are likely to result in a protein which is less capable of performing its function optimally. However, occasionally a mutation in one of these regions will result in a beneficial outcome that contributes to the overall fitness of the organism, and such mutations often persist and may even become fixed in populations. When comparing the frequency of these mutation events to the relatively regular changes seen in non-coding sequences, this is exceedingly rare, and so in general coding regions are considered as evolving slowly.
It is also true that there is a measurable amount of variation in the levels of sequence conservation within coding sequences, and this is seen across all organisms. For instance, take the example of a receptor protein. Such proteins typically have different regions that may perform functions such as ligand binding, or intracellular signaling, or membrane integration. In this case, a mutation in the region that is involved in ligand binding may produce a protein that is less efficient at binding the ligand. Therefore, selection pressure would likely be high on the particular nucleotides coding for this part of the protein. However, in the section of the protein which spans the membrane, there may be less effect seen if an amino acid substitution occurs, and therefore lower levels of selection pressure. Under these conditions, we might see that two regions of the same protein-coding gene might have different rates of evolution.
Sequencing Genes or Genomic Regions to Build Phylogenies
This variation in the speed of genome evolution over different regions can be studied to answer questions about evolutionary relationships. Genes and gene regions can be selected and sequenced over groups of individuals to answer questions as narrow as &#8220;are these populations potentially different species?&#8221; or as broad as &#8220;how do these phyla place into the tree of life?&#8221;. For the former, selecting a gene that has a relatively lightly conserved region would help to identify population-level differences. Conversely, to answer questions over groups as diverse as phyla, a highly conserved gene region may provide enough homology to produce a phylogeny of such groups. Commonly used regions for molecular phylogenetic analyses such as these include ribosomal rRNA genes (such as 16s rRNA, 18s rRNA, or 28s rRNA), or genomic regions known as ITS (Internal Transcribed Spacers, I or II) which sit between the ribosomal rRNA subunit genes.

Gene Evolution and Sequencing Genomic Regions to Build Phylogenies

Evoluzione genetica - veloce o lenta?

The genomes of eukaryotes are punctuated by long stretches of sequence which do not code for proteins or RNAs. Although some of these regions do contain ...