Questo lavoro è stato supportato da NIH AI099854 e AI126742 a chiave.

1. indurre PFV nell'espressione in e. coli
<ol><li>
Aggiungere 1 μL di plasmide di espressione IN PFV (10 ng / µ l) a 20 μL di e. coli BL21 (DE3) pLysS (aliquota da 20 μL di celle disponibili in commercio è > 2 x 106 CFU/μg plasmide) in una provetta da 1,5 mL. Mescolare delicatamente dal dito toccando o sfogliando il tubo. Incubare in ghiaccio 5 min.
	<ol>
<li>Calore shock per esattamente 30 s in un 42 ˚ c bagno d'acqua e quindi tornare immediatamente in ghiaccio per 2 min.</li>
		<li>Aggiungere 80 µ l di brodo super ottimale di temperatura ambiente con media di repressione (SOC) dei cataboliti. Incubare per 1 h a 37 ° c con 225 giri al minuto (rpm) agitazione.</li>
		<li>Piastra 25 µ l della miscela su un 100 mm x 15 mm di Petri contenente 25 mL di agar di brodo (LB) di Luria (L 1 LB agar: bacto-tryptone di 10 g, 10 g NaCl, 5 g Estratto di lievito, 15 g di agar) e 100 μg/mL ampicillina (100 mg/mL di soluzione madre).</li>
		<li>Il restante 75 μL di cellule trasformate in un secondo piatto identico della piastra. Incubare le piastre con i coperchi giù durante la notte a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperare le piastre di trasformato Escherichia coli. Utilizzare una singola Colonia per inoculare 3 mL di LB (1 L LB: 10 g di bacto-tryptone, 10 g di NaCl, 5 g di lievito estratto) completati con 100 ampicillina μg/mL in una provetta di polipropilene cultura fondo tondo 14-mL. Incubare per ~ 8 h a 37 ° c con agitazione 225 giri/min.
	<ol>
<li>Aggiungere 3 mL di cultura a 50 mL LB completati con 100 μg/mL ampicillina e cloramfenicolo 34 μg/mL (34 mg/mL di soluzione madre) in una beuta da 250 mL. Incubare la coltura durante la notte a 37 ° C con agitazione 225 giri/min.</li>
		<li>Trasferire i 53 mL di coltura LB 1 L, 100 µ g/mL ampicillina e 34 cloramfenicolo μg/mL in un matraccio di Erlenmeyer 4L. Incubare a 37 ° C con agitazione 225 giri/min.</li>
		<li>Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) della cultura periodicamente. Inizialmente, controllare la cultura OD600 ogni h. Come la cultura raggiunge il desiderato OD600, controllare ogni 15 min per non invadere. Far crescere la cultura a un OD600 tra 0,9 e 1.0. Trasferire il pallone in un bagno di ghiaccio e agitare per ridurre la temperatura della cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trasferire 1 mL della coltura in una provetta da 1,5 mL per un'analisi successiva denaturando analisi SDS-PAGE.
	<ol>
<li>Agglomerare le cellule nel tubo da 1,5 mL mediante centrifugazione per 1 minuto in un microfuge a 14.000 x g a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 150 μL Tampone fosfato salino (PBS) di pipettaggio. Il PBS può essere con o senza CaCl2 e MgCl2.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l di tampone di SDS-PAGE: 2x (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, SDS 1,2%, 30% glicerolo, 15% β-mercaptoetanolo (βME), blu di bromofenolo 0,0018%) e mescolare accuratamente da dispensare o vortice. Far bollire per 3 min. Conservare a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere la coltura batterica: una concentrazione finale di 0,25 mM isopropilico-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, soluzione di riserva di 0,25 M) e 50 μM ZnCl2 (soluzione 50 mM). IPTG induce l'espressione del gene PFV IN dal promotore T7 e ZnCl2 viene aggiunto come un supplemento per il corretto ripiegamento di un dominio del dito di zinco terminale amminico in PFV IN. Incubate la cultura a 25 ° C con agitazione immediatamente a 225 giri/min per 4 h. trasferire il pallone in un bagno di ghiaccio. Salvare 1 mL di coltura per analisi SDS-PAGE, seguendo lo stesso protocollo come sopra al punto 1.3.</li>
	<li>
Trasferire la coltura batterica bottiglie di dimensioni appropriate della centrifuga. Ad esempio, una cultura di 1 L può essere trasferita a quattro bottiglie di polipropilene fondo conico sterile monouso da mL 250. Girare le bottiglie in una centrifuga refrigerata da tavolo a 3000 x g per 20 min a 4 ° c. Scartare i surnatanti versando.
	<ol>
<li>Tutti i pellet da una coltura batterica 1 L in un volume totale di 25 mL (6,25 mL per flacone) PBS freddo (con o senza CaCl2 e MgCl2) Risospendere pipettando. Combinare e trasferire le sospensioni batteriche in una provetta conica da 50 mL. Girare in una centrifuga refrigerata a 3.000 x g per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante di versamento o di pipettaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risospendere il pellet batterico in 10 mL di tampone di risospensione (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl e l'inibitore della proteasi phenylmethylsulfanoxide (PMSF) 500 μM) di pipettaggio. Snap congelare il pellet inserendo il tubo in un pallone Dewar con azoto liquido sufficiente per immergere il tubo da 50 mL. Rimuovere il tubo da azoto liquido con cautela e conservare a-80 ° C. Nota: Pellet batteriche possono essere conservati per diversi mesi a-80 ° C. Non abbiamo visto nessuna perdita di proteina attiva dopo stoccaggio di-80 ° C per due anni.</li>
	<li>
Analizzare i campioni di pre- induzione e post-induzione di 8,3 cm di larghezza, 7,3 cm di altezza, 0,75 mm spessore SDS-PAGE gel con poliacrilammide 6% 1,5 mL accatastamento strato (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6% di acrilammide, 0.1% SDS, 0,1% ammonio persolfato, 0.001% TEMED) e 3,5 mL 10% poliacrilammide risoluzione strato (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10% di acrilammide, 0.1% SDS, 0,1% ammonio persolfato, 0.001% TEMED)12.
	<ol>
<li>Dopo aver versato il gel d'impilamento, inserire un pettine di ben 10. Quando il gel è polimerizzato, montare l'apparecchiatura di pagina e aggiungere sufficienti buffer in esecuzione di SDS-PAGE (25 mM Tris, glicina 192 mM, 0,1% SDS).</li>
		<li>Caricare 10 µ l di ogni campione e 4 μL di standard di proteina precolorati. Eseguire a 16,5 V/cm fino a quando la parte anteriore della tintura raggiunge il fondo del gel, circa 60 min.</li>
		<li>Smontare le lastre di gel e trasferire il gel in una vasca di plastica. Aggiungi Coomassie Brilliant Blue macchiatura soluzione (0,1% R-250 di blu brillante Coomassie, 40% metanolo, acido acetico 10%) per generosamente coprire il gel e macchiare per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione colorante versando e Sostituisci con decolorare soluzione (40% metanolo, 10% acido acetico) fino a quando le bande sono facilmente visibili. Rimuovere la soluzione decolorante versando e sostituire con acqua deionizzata. PFV IN dovrebbe essere facilmente identificati nel campione post-induzione. PFV IN con un tag di hexahistidine ha un peso molecolare di 47374 Da.</li>
		<li>Se non è visibile IN PFV, ripetere l'induzione a partire con una colonia di diversa da una delle piastre trasformazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nickel cromatografia di affinità
<ol><li>Scongelare una batterica precipitato sul ghiaccio. Nota: Questo richiederà molto tempo (circa 2-3 h). Quando la pallina si è sciolto per liquami una cella, aggiungere un ulteriore 500 μM PMSF (soluzione 100 mM).</li>
	<li>Tenere il tubo da 50 mL di batteri dei residui sul ghiaccio. Sottoporre ad ultrasuoni i batteri ad ampiezza di 30% per 30 s (1 s on, 1 s off) a pellet derivato dalla cultura 1L utilizzando un sonicatore con un corno di bio del diametro di 0,5 pollici con un diametro di 0,125 pollici conica microtip, una frequenza di 20 kHz e potenza massima di 400 w.</li>
	<li>Trasferire il campione di cellule in una provetta di freddo ultracentrifuga. Utilizzare in policarbonato bottiglia assembly (diametro 25 mm, 89 mm altezza) compatibile con un rotore ad angolo fisso tipo 60 Ti. Rotori e tubi alternativi possono essere utilizzati se non si ottiene la stessa forza di gravitazione. Spin di 120.000 x g per 60 min a 4 ° C. Ci dovrebbe essere una pallina di ovvia. Il supernatante può avere un colore giallo.</li>
	<li>Trasferire il surnatante da versarsi o pipettare in una provetta conica freddo 50 mL. Nota il volume; Questo volume dovrebbe essere circa il volume di tampone di risospensione utilizzato prima del congelamento di snap. Se il supernatante è viscoso, può essere contaminato da DNA batterico che poteva intasare la colonna di cromatografia. In questo caso, ripetere l'ultracentrifugazione per pellet il DNA batterico.</li>
	<li>
Preparare 500 mL Tampone un (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) e 500 mL Tampone B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, imidazolo 200 mM). Nota: In questo protocollo, mantenere il sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC) proteine veloci, tutti i buffer e il campione a 4 ° C in una camera fredda.<ol>
<li>Filtro sterile buffer A e B, con 0,2 μm filtro monouso. A seconda del sistema FPLC, lavare pompa A e pompa B con tampone A e B di Buffer, rispettivamente. Flusso di tampone al 90% e 10% tampone B attraverso il sistema fino a stabilizzano la conducibilità e letture di UV. La portata massima dipenderà sullo strumento; utilizzare una portata di 5 mL/min con un limite di pressione massima di 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare una colonna FPLC 110mm Diametro 5 mm long, con 1,5 mL di resina carica di nichel (capacità di legame massimo 50 mg/mL, massima pressione di 1 MPa). La colonna può essere preparata il giorno prima purificazione e conservata a 4 ° c.</li>
	<li>Collegare la colonna allo strumento FPLC. Equilibrare la colonna con 20 mL di tampone al 90% e 10% tampone B (imidazolo 20 mM) con una portata di 0,5 mL/min con un limite di pressione di 0,5 MPa. Lo strumento dovrebbe essere raccolta dati in tempo reale di conducibilità e di capacità di assorbimento UV a 280 nm (A280). Si dovrebbero stabilizzare la conducibilità e letture di UV. Se queste letture non sono stabilizzati, continuare a buffer del flusso attraverso la colonna fino a quando non sono stabili.</li>
	<li>
Caricare il campione della proteina (~ 10 mL / pellet) alla colonna ad un flusso di 0,15 mL/min con un limite di pressione di 0,5 MPa. La portata e colonna la pressione rimane la stessa durante la purificazione. Raccogliere il flusso attraverso in una provetta da 50 mL.
	<ol>
<li>Lavare la colonna con 20 mL di tampone al 90% e 10% Buffer B. raccogliere il lavaggio in un tubo da 50 mL. Eluire le proteine con una sfumatura lineare di 20 mL di 10% a 100% tampone B (20mm-imidazolo 200 mM).</li>
		<li>Infine, lavare la colonna con 5 mL 100% tampone B (imidazolo 200 mM). Raccogliere il lavaggio gradiente e finale in frazioni 0,27 mL.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Combinare 15 μL di tampone del campione SDS-PAGE 2 x con 15 μL del flusso attraverso, lavare e le frazioni di picco A280 . Bollire i campioni per 3 min.
	<ol>
<li>Preparare due 10% SDS-PAGE gel come descritto in precedenza nel passaggio 1.6 tranne con ben 15 pettini. Caricare 10 µ l di ogni campione per il gel e 4 μL di standard di proteina precolorati. Eseguire, macchia e analizzare i gel come descritto al punto 1.6.</li>
		<li>Combinare le frazioni che sembrano contenere quasi puro IN PFV basato su ispezione visiva. Misurare il volume di pipettaggio, solitamente 8-10 mL.</li>
		<li>Misurare A280 delle frazioni combinate con uno spettrofotometro e calcolare la quantità totale di PFV di proteine; il nostro rendimento tipico è ~ 10 mg / L di cultura indotta. Il coefficiente di estinzione di PFV IN con il tag hexahistidine è 59360 cm-1 M-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per rimuovere il tag hexahistidine, supplemento al PFV IN con 10 mM dithiothreitol (DTT, soluzione madre 1 M) e 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (soluzione 0,5 M). Aggiungere 15 μg di proteasi 3C rhinovirus umano (HRV) per mg PFV IN. Incubate a 4 ˚ c durante la notte. Clivaggio riduce il peso molecolare IN PFV da 47374 Da a Da 44394 e può essere verificato dall'analisi di 10% SDS-PAGE.</li>
</ol>3. cromatografia di affinità eparina
<ol><li>
Preparare 250 mL C Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF) e 250 mL Tampone D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, NaCl di 1m). Nota: In questo protocollo, il sistema FPLC, buffer e campione sono tenuti in una cella frigorifera a 4 ˚ c.<ol>
<li>Filtro sterile buffer C e D con 0,2 unità di filtrazione monouso μm. A seconda del sistema FPLC, lavare pompa A e pompa B con Buffer C e D del Buffer, rispettivamente. Flusso di Buffer C l'80% e 20% Buffer D attraverso il sistema fino a stabilizzano la conducibilità e letture di UV. La portata massima dipenderà sullo strumento; Utilizziamo abitualmente una portata di 5 mL/min con un limite di pressione massima di 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare una colonna FPLC lunga, 5 mm diametro 80 mm con 1 mL di resina di sepharose eparina (massima capacità legante 2,0 mg di bovino in resina di antitrombina III / mL; pressione massima 1,4 MPa). La colonna può essere preparata il giorno prima purificazione e conservata a 4 ° C. Collegare la colonna allo strumento FPLC.
	<ol>
<li>Equilibrare la colonna con 20 mL di Buffer C l'80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl) ad una portata di 0,5 mL/min con un limite di pressione di 1 MPa. Lo strumento dovrebbe essere raccolta dati in tempo reale di conducibilità e di capacità di assorbimento UV a 280 nm (A280). Si dovrebbero stabilizzare la conducibilità e letture di UV. Se queste letture non sono stabilizzati, continuare a buffer del flusso attraverso la colonna fino a quando non sono stabili.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ridurre la concentrazione di NaCl del campione PFV IN a 200 mM con l'aggiunta di 1,5 volumi C. Buffer Ad esempio, aggiungere 15 mL di Buffer C 10ml PFV in. Il nostro volume totale è in genere ~ 25 mL.</li>
	<li>
Il campione diluito IN PFV alla colonna di sepharose eparina a 0,5 mL/min di portata con pressione massima di carico limite 1,0 MPa. La portata e colonna la pressione rimane la stessa durante la purificazione. Raccogliere il flusso attraverso in una provetta conica da 50 mL.
	<ol>
<li>Lavare la colonna con 20 mL di Buffer C l'80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl), raccogliendo il lavaggio in una provetta conica da 50 mL. Eluire la colonna con una sfumatura lineare di 30 mL di 20% a 100% D Buffer (200 mM a 1 M NaCl).</li>
		<li>Lavare la colonna con 5 mL di 100% Buffer D. raccogliere il gradiente e lavaggio finale in frazioni di 0,37 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare il carico, il flusso attraverso, lavare e frazioni dell'8% SDS-PAGE come descritto in 2.9. PFV IN seguito clivaggio del tag hexahistidine ha un peso molecolare di 44394 Da e il coefficiente di estinzione rimane 59360 cm-1 M-1 senza il tag hexahistidine. Memorizzare tutte le frazioni a 4 ˚ c fino al completamento di un'analisi di nucleasi.</li>
</ol>4. analisi di nucleasi
<ol><li>
Identificare le frazioni di sepharose eparina che sembrano contenere quasi puro PFV poll. combinare 3 μL di frazione di eparina e 50 ng di 3 kb plasmide supercoiled DNA nella reazione del buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) con un volume finale di 15 μL. Incubare a 37 ° c per 90 min Include un controllo negativo con nessun PFV IN.
	<ol>
<li>Fermare la reazione con proteinasi K di 1 mg/mL (20 mg/mL di soluzione madre) e 0,5% SDS (10% soluzione di riserva). Incubare a 37 ° C per 1 h. campioni possono essere conservati a-20 ° C per un'analisi successiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare un gel 125 mL di 1% in peso per volume (p/v) agarose in tampone di x TAE 1 (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) con 0.1 µ g/mL etidio bromuro (10 mg/mL di soluzione madre)13. Sciogliere la soluzione di agarosio e versate ad un vassoio di colata di gel 15 x 10 cm. Inserire un pettine di ben 15 con ampia, pozzi di spessore 0,75 mm 5 mm. Pozzi sottile resa migliore risoluzione di banda rispetto ai pozzi spessore 1,5 mm. Lasciare che il gel a solidificare a temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Immergere il gel in 1 x TAE con 0,1 µ g/mL di bromuro di etidio. Aggiungere 3,5 μL di 6x loading dye (50% glicerolo, 0,15% Orange G tintura) per le reazioni di dosaggio di nucleasi. Caricare l'intero volume al gel. Esegua il gel a tensione costante, 10 volt per centimetro (100 V) a temperatura ambiente per 1 ora o fino a quando la parte anteriore della tintura di Orange G raggiunge la fine del gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immediatamente l'immagine del gel dell'agarosi con uno scanner fluorescente impostato per rilevare il bromuro di etidio. DNA lineare deve essere eseguito con taglia indicata 3 kb, DNA supercoiled dovrebbe più veloce (~ 2 kb), e rilassato cerchio DNA va più lento (~3.5 kb).
	<ol>
<li>Utilizzando software di analisi di immagine, calcolare il volume di pixel del plasmide supercoiled, lineare e rilassante cerchio in ogni corsia. Chiamare la somma del pixel volumi per queste tre forme di DNA "DNA totale" valore e utilizzano per calcolare la percentuale dei cerchi lineare e rilassati. Ad esempio, il volume di pixel dei cerchi rilassati è diviso per il valore del pixel del DNA totale in quanto Vicolo, moltiplicare questo numero per 100 per determinare una percentuale. Le frazioni che contengono contaminante nucleasi visualizzano una percentuale più elevata dei cerchi lineare e rilassati rispetto al controllo negativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combinare le frazioni di sepharose eparina che non vengono visualizzati attività della nucleasi contaminanti. Dializzare in 10 mm 6-8 kDa peso molecolare in taglio tubi dialisi (MWCO) a 4 ° C durante la notte contro 1 L di 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% glicerolo.</li>
	<li>Recuperare il campione di PFV IN nucleasi-free da tubi di dialisi. A280 di misurare e calcolare la concentrazione finale di proteine. Aliquotare e snap congelamento in azoto liquido. Conservare le aliquote a-80 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases.">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration.">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li><li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+reaction+pathway+and+critical+intermediates.">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li><li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells.">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li><li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase.">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li><li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration.">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Proteine ricombinanti che interagiscono con il DNA, come proteine, spazzini di ossigeno per le applicazioni di microscopia di singola molecola, o retrovirali integrases, di riparazione del DNA dovrebbero essere liberi di contaminanti batterici nucleasi2,3. Questi contaminanti possono confondere l'interpretazione dei risultati durante saggi biochimici o singola molecola alla rinfusa.
Abbiamo trovato che una nucleasi batterica frequentem...

Gli studi biochimici e singola molecola delle interazioni della proteina con DNA richiedono proteine ricombinanti eccezionalmente pure. Contaminando nucleasi da batteri possa oscurare i risultati di queste analisi. Una nucleasi contaminante è stata trovata in preparazioni a base di proteine ricombinanti ossigeno scavenger protocatecuato-3,4-diossigenasi (PCD) e prototipo virus schiumoso (PFV) integrasi (IN) isolato da Escherichia coli (Escherichia coli)1 , 2 , 3.
Integrazione retrovirale saggi si basano sulla conversione del DNA supercoiled ai prodotti intaccati o lineare come una misura di attività4. Durante l'infezione cellulare IN unisce le due estremità di un cDNA virale per l'host della cromatina5. Ogni estremità unendo la reazione è chiamato filo trasferimento. Saggi di ricombinante IN attività possono aderire due oligomeri del DNA che imita il cDNA virale termina ad un target di DNA in un'integrazione concertata reazione4,5,6,7,8. In alternativa IN ricombinante possono aderire solo un'estremità del DNA in un non-fisiologicamente rilevanti metà sito integrazione reazione9,10. Quando il DNA del plasmide supercoiled è la destinazione di integrazione, i prodotti sono concordate linearizzato DNA e mezza sito integrazione prodotti sono cerchi rilassati. Questi prodotti di reazione sono individuati dalla loro mobilità relativa nel corso di elettroforesi su gel di agarosio1. Se il ricombinante IN ha una nucleasi contaminante, ci saranno spurie cerchi rilassati o un plasmide linearizzato possibilmente confondendo i risultati sperimentali. Oligomeri del DNA virali possono essere etichettati fluorescente per identificare i prodotti di integrazione, al contrario di prodotti nuclease conclusivamente. Tuttavia, IN notevolmente favorisce target DNA supercoiled; qualsiasi perdita del plasmide supercoiled a cerchi rilassati o DNA lineare di contaminante nucleasi potrebbe inclinare risultati e interpretazione di dati11. Quindi è assolutamente necessario rimuovere nucleasi batteriche da retrovirali nelle preparazioni.
PFV IN ha una diversa affinità per l'eparina sepharose rispetto alla nucleasi batterica1. PFV IN e le nucleasi possono essere separati da un'eluizione di pendenza lineare da eparina sepharose. Le nucleasi non è rilevata prontamente da un'assorbanza di ultravioletti (UV) a 280 nm picco o di elettroforesi di analitica sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). Invece, la nucleasi viene rilevata da un'analisi di attività della nucleasi che impiegano la conversione di un plasmide supercoiled a cerchi rilassati o prodotti lineari. Ogni frazione seguendo cromatografia sepharose eparina è testato per attività della nucleasi. PFV IN e il contaminante nucleasi non hanno alcuna differenza nell'affinità per resina anionica Mono-Q. C'è una piccola differenza di affinità per resina del catione Mono-S. Tuttavia, la risoluzione di Mono-S di nucleasi batterica e PFV IN non consentirebbe efficiente separazione delle proteine. In definitiva, la purificazione di affinità di eparina sepharose offre la migliore separazione di nucleasi batterica da PFV IN e ha il vantaggio di volume di carico illimitato.
Test per attività della nucleasi di contaminanti possono essere adattati ad altre proteine. La proteina di interesse probabilmente avrà caratteristiche di affinità alternativi rispetto IN PFV; la differenza nelle caratteristiche della proteina di interesse e il contaminante di nucleasi di associazione deve essere determinata empiricamente. Questa metodologia per l'identificazione di contaminazione nucleasi può essere adattata a altre resine tra cui Mono-S catione o resine a scambio anionico Mono-Q. Affinità e scambio ionico resine possono offrire un metodo affidabile per isolare una proteina ricombinante di interesse da parte di contaminanti nucleasi senza limiti sul volume della proteina durante la cromatografia.

<table><tbody><tr><td>BL21/DE3 Rosetta E. coli</td><td>EMD Millipore</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>EMD biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 3C protease&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

La proteina di integrasi (IN) del virus schiumoso del prototipo di retrovirus (PFV) è un enzima di modello per studiare il meccanismo di integrazione retrovirale. Rispetto IN da altri retrovirus, PFV IN è più solubile e più suscettibili di manipolazione sperimentale. Inoltre, è sensibile a inibitori dell'IN clinicamente rilevanti virus di immunodeficenza umana (HIV-1), suggerendo che il meccanismo catalitico di PFV IN è simile a che di HIV-1 pollici pollici catalizza l'Unione covalente di virale DNA complementare (cDNA) per destinazione DNA in un processo chiamato trasferimento strand. Questa reazione di trasferimento del filo introduce Nick al DNA dell'obiettivo. Analisi dei prodotti di reazione di integrazione possono essere confuso dalla presenza di nucleasi quel nick allo stesso modo del DNA. Una nucleasi batterica è stata indicata per co-purificare con ricombinante IN PFV espressa in Escherichia coli (Escherichia coli). Qui descriviamo un metodo per isolare PFV IN dalla nucleasi contaminante dalla cromatografia di affinità di eparina. Le frazioni sono facilmente schermate per contaminazione di nucleasi con un plasmide supercoiled e l'elettroforesi del gel dell'agarosi. PFV IN e i contaminante nucleasi display alternativo affinità per eparina sepharose permettendo una preparazione nucleasi-free of recombinant PFV IN adatto per analisi biochimiche o singola molecola di massa di integrazione.

Ricombinante IN PFV è spesso contaminato con una nucleasi batterica1. Le analisi biochimiche integrazione dipendono la quantificazione della conversione del DNA del plasmide supercoiled cerchi rilassati e prodotti lineari. La presenza di una contaminante nucleasi potrebbe portare a spuria quantificazione di queste analisi. Espressione di PFV IN con un tag hexahistidine è indotta in e. coli (Figura 1) e prima purificati mediante cromatografia di affinità di...

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Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Proteina di integrasi del virus schiumoso prototipo ricombinante è spesso contaminata con una nucleasi batterica durante la purificazione. Questo metodo identifica contaminazione nucleasi e lo rimuove dalla preparazione finale dell'enzima.

Rilevamento e rimozione di nucleasi contaminazione durante la purificazione del prototipo ricombinanti Virus schiumoso integrasi

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.0K Views.  The Ohio State University College of Medicine. Proteina di integrasi del virus schiumoso prototipo ricombinante è spesso contaminata con una nucleasi batterica durante la purificazione. Questo metodo identifica contaminazione nucleasi e lo rimuove dalla preparazione finale dell'enzima.

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Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

Multi-target Parallel Processing Approccio per Gene-to-struttura Determinazione della polimerasi Influenza PB2 subunità

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biologia

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens have made strides in exploring this, they often limit their scope to known genomic elements and may introduce non-specific effects. This underscores the urgent need for novel functional genomics tools that enable a deeper, unbiased understanding of genome functionality. This protocol introduces the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for identifying lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library. InSET facilitates the capture of genome-wide lentiviral integration sites, with next-generation sequencing used to detect and quantify flanking sequences. InSET's design enables the analysis of integration site abundance variations in phenotypic screens on a large scale, establishing it as a robust tool for forward genetics and for identifying functional genomic elements. A key benefit of InSET is its capacity to reveal previously unidentified genomic elements, including novel functional exons of both protein-coding and non-coding RNAs, independent of prior annotation. Overall, InSET holds significant value in studying the intricate complexity of the human genome and transcriptome, where many genomic elements await functional characterization.

Insertional mutagenesis is an essential tool in forward genetics for identifying functional genomic elements. Here, we describe the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for detecting lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library.

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

Genetica

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Purificazione di DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

Assemblaggio e purificazione del prototipo Virus schiumoso Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally replicates through an episomal DNA intermediate; however, integration of HBV DNA fragments into the host genome has been observed, even though this form is not necessary for viral replication. The exact purpose, timing, and mechanism(s) by which HBV DNA integration occurs is not yet clear, but recent data show that it occurs very early after infection. Here, the in vitro generation and detection of HBV DNA integrations are described in detail. Our protocol specifically amplifies single copies of virus-cell DNA integrations and allows both absolute quantification and single-base pair resolution of the junction sequence. This technique has been applied to various HBV-susceptible cell types (including primary human hepatocytes), to various HBV mutants, and in conjunction with various drug exposures. We foresee this technique becoming a key assay to determine the underlying molecular mechanisms of this clinically relevant phenomenon.

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

We describe here the in vitro generation of HBV DNA via a Hepatitis B virus infection system and the highly sensitive detection of its (1&#8211;2 copies) integration using inverse nested PCR.

Rilevamento di copia basso numero di DNA virale integrato formato da In Vitro l'infezione di epatite B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Purificazione di vettori AAV mediante cromatografia di affinità con eparina a passaggio singolo

Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. However, the commonly used methods to purify AAVs make use of cesium chloride or iodixanol density gradient ultracentrifugation. Despite their advantages, these methods are time-consuming, have limited scalability, and often result in vectors with low purity. To overcome these constraints, researchers are turning their attention to chromatography techniques. Here, we present an optimized heparin-based affinity chromatography protocol that serves as a universal capture step for the purification of AAVs.
This method relies on the intrinsic affinity of AAV serotype 2 (AAV2) for heparan sulfate proteoglycans. Specifically, the protocol entails the co-transfection of plasmids encoding the desired AAV capsid proteins with those of AAV2, yielding mosaic AAV vectors that combine the properties of both parental serotypes. Briefly, after the lysis of producer cells, a mixture containing AAV particles is directly purified following an optimized single-step heparin affinity chromatography protocol using a standard fast protein liquid chromatography (FPLC) system. Purified AAV particles are subsequently concentrated and subjected to comprehensive characterization in terms of purity and biological activity. This protocol offers a simplified and scalable approach that can be performed without the need for ultracentrifugation and gradients, yielding clean and high viral titers.

Autore in primo piano: Metodo migliorato per la produzione e la purificazione di vettori virali adeno-associati

This manuscript describes a detailed protocol for the generation and purification of adeno-associated viral vectors using an optimized heparin-based affinity chromatography method. It presents a simple, scalable, and cost-effective approach, eliminating the need for ultracentrifugation. The resulting vectors exhibit high purity and biological activity, proving their value in preclinical studies.

Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. ...

Rilevamento e rimozione di nucleasi contaminazione durante la purificazione del prototipo ricombinanti Virus schiumoso integrasi

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Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Multi-target Parallel Processing Approccio per Gene-to-struttura Determinazione della polimerasi Influenza PB2 subunità

Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane

Purificazione di DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate

Assemblaggio e purificazione del prototipo Virus schiumoso Intasomes

Rilevamento di copia basso numero di DNA virale integrato formato da In Vitro l'infezione di epatite B

Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico

Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico