Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno di Universiti Putra Malaysia.

Nota: Tutti i reagenti chimici e biochimici per essere utilizzati devono essere di purezza analitica e utilizzato senza ulteriore purificazione. Preparare tutte le soluzioni utilizzando acqua deionizzata sterile. Autoclave tutti i bicchieri prima della sterilizzazione.
Attenzione: Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si eseguono attività di laboratorio, compreso l'uso di controlli (cappa, glovebox) tecnici e dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, camice, pantaloni di lunghezza completa, chiuse scarpe).
1. fabbricazione e caratterizzazione di elettrodo per volta utilizzando PLA-AuNPs
<ol><li>
Preparazione e caratterizzazione di PLA-AuNPs
	<ol>
<li>Aggiungere 10 mL di soluzione di citrato di sodio (38,8 mM) a 100 mL di soluzione di acido cloroaurico acquosa (1 mM) di ebollizione rapidamente e raffreddare fino a temperatura ambiente. Osservare i cambiamenti nel colore nella soluzione preparata AuNPs che inizia come giallo, modifiche a nerastro e infine termina come rosso rubino scuro.</li>
		<li>Posizionare i pellet PLA in uno stampo di acciaio inox per il processo di fusione e li preriscaldare a una temperatura di 190 ° C per 10 min. Segui la procedura di pressatura: metterli sotto una pressione di 2,2 MPa per 1 min come parte della preparazione foglio PLA. Il foglio PLA sarà pronto per l'uso dopo il raffreddamento per circa 3 ore.</li>
		<li>Mescolando energicamente, sciogliere 0,68 mg dei fogli PLA in 5 mL di cloroformio a temperatura ambiente. Mescolare il PLA disciolto con 10 mL di soluzione AuNPs precedentemente preparata e mescolate in modo omogeneo a temperatura ambiente. Le miscele omogenee possono quindi essere denotate come PLA-AuNPs e caratterizzato usando UV-Vis, XRD, TEM e FESEM con EDX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione e caratterizzazione di elettrodi di carbonio serigrafato modificate Nota: Il SPCE utilizzato in questo studio comprende un sistema di tre elettrodi: un elettrodo contatore, un elettrodo di lavoro di carbonio e un elettrodo di riferimento Ag/AgCl.<ol>
<li>Dispensare 25 µ l della soluzione omogenea di PLA-AuNPs sul SPCE e quindi aria asciugare rapidamente per 24 h prima dell'uso.</li>
		<li>Elettrochimicamente caratterizzano gli elettrodi modificati, SPCE/PLA-AuNPs-ferro cianuro del potassio (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) per misurare la superficie attiva, spettroscopia di impedenza elettrochimica, ripetibilità, riproducibilità e stabilità30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sviluppo del biosensore elettrochimico del DNA
<ol><li>
Preparazione della sonda Nota: Le sequenze del DNA complementare e ssDNA sonda sono stati scelti sulla base delle informazioni dal centro nazionale per database Biotechnology Information (NCBI).<ol>
<li>Acquisto di oligonucleotidi sintetici (20-mer ssDNA sonda, DNA complementare 20-mer, 20-mer malassortiti DNA e DNA non-complementare 21-mer) come polvere liofilizzata da laboratori commerciali, basato su sequenze seguenti: chitosani ssDNA sonda: 5 ′ - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 ' DNA complementare: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - DNA non corrispondente uno-base: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - tre basi DNA non corrispondente: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - DNA non complementari: 3 ′ 5 ′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -</li>
		<li>Preparare soluzioni di riserva di tutti gli oligonucleotidi (100 µM) utilizzando una soluzione TE sterile (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), suddivisa in porzioni analitiche. Tenere questo a-4 ° C e quindi apportare le appropriate diluizioni appena prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ottimizzazione di immobilizzazione e ibridazione Nota: Un SPCE modificato con PLA-AuNPs, denotato come SPCE/PLA-AuNPs, è stato utilizzato per questo studio e un metodo di fusione di goccia è stato utilizzato per l'immobilizzazione del DNA e l'ibridazione.<ol>
<li>In primo luogo, immobilizzare 25 µ l di sonda ssDNA chitosani su SPCE/PLA-AuNPs e poi aria la asciugare per 24 ore a temperatura ambiente, dopo di che essa verrà infine indicata come SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Determinare l'ottimizzazione della condizione immobilizzazione utilizzando tre fattori: la concentrazione di ssDNA (che vanno da 0,2 a 1,4 µM), tempo (variabile da 30 a 210 min) e temperatura (che vanno da 25 a 75 ° C).</li>
		<li>Pipettare 25 µ l di DNA complementare sopra alla superficie di SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA di svolgere l'evento di ibridazione dopo di che può essere infine indicata come SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Determinare l'ottimizzazione della condizione ibridazione tramite i due fattori di tempo (da 5 a 30 min) e temperatura (che vanno da 25 a 75 ° C).</li>
		<li>Immergere l'immobilizzato e ibridati elettrodi in µM 20 MB per 30 min. rimuovere il DNA non specifico adsorbito e MB in eccesso mediante lavaggio con 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) e poi risciacquo con acqua deionizzata. Misurare la corrente di picco del MB riduzione usando tecnica DPV. Eseguire la misura di DPV con 0.1 M PBS (pH 7) non contenente nessun indicatore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caratterizzazione del biosensore DNA fabbricato
	<ol>
<li>Immergere il SPCE/PLA-AuNPs in µM 20 MB per 30 min, lavare con 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) e poi risciacquare con acqua deionizzata prima della misura. Seguire una procedura simile per tutte le interazioni tra cui la sonda DNA, DNA complementare, DNA non corrispondente e non complementari campioni di DNA.</li>
		<li>Misurare la riduzione elettrochimica. Nota: Abbiamo misurato DPV utilizzando un Autolab commercialmente manufactured con software di interfaccia. Le misurazioni di DPV della riduzione elettrochimica MB eseguita presso un potenziale che vanno da -0.5 V a 0,25 V, con un passo di potenziale di 0.005 V, ampiezza di modulazione di 0.05 V e una velocità di scansione di 7,73 mVs-1 in 0.1 M PBS (pH 7), non contenente nessun indicatore. La selettività, sensibilità, riproducibilità e stabilità al calore del biosensore DNA fabbricato più ulteriormente sono stati studiati. Risultati riferiti sono stati presentati come media valore misurazioni in tre repliche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. convalida del biosensore fabbricato del DNA utilizzando campioni reali
<ol><li>Preparazione dei ceppi batterici
	<ol>
<li>Selezionare batterici campioni basati sulla loro significativa contaminazione dei frutti di mare31,32 . Nota: V. parahaemoliticus come ceppi di riferimento e 8 altri ceppi batterici (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, polmonite da Klebsiella Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereuse alginolyticus del vibrione) delle epidemie alimentari comuni patogeni sono stati impiegati per la validazione di biosensori elettrochimica del DNA in questo studio.</li>
		<li>Condurre una routine sub-cultura di ceppi batterici su loro rispettivi agar ogni due settimane per mantenere la loro vitalità, consultare la tabella 1 per le condizioni di coltura.</li>
		<li>Mantenere la conservazione a lungo termine dei ceppi batterici nei loro rispettivi brodi crescenti contenente 20% (v/v) glicerolo a-80 ° C come glicerolo protegge i batteri impedendo la formazione di cristalli di ghiaccio che possono danneggiarli durante il processo di congelamento. Successivamente, inoculare un ciclo della cultura di cellula batterica conservati negli stock di glicerolo nei rispettivi brodi. Incubare i brodi secondo le loro rispettive crescita tempo e temperatura quando il bisogno di far rivivere i batteri.</li>
		<li>Determinare la quantità di V. parahaemoliticus celle utilizzando una piastra di diffusione tecnica33, standard e un metodo ben noto per l'enumerazione dei microrganismi derivate da una serie di diluizioni.<ol>
<li>Cultura V. parahaemoliticus in brodo di soia Trypticase (TSB + 3% NaCl) a 37 ° C in una condizione di agitazione 140 giri/min. Quindi, trasferire 1 mL di coltura delle cellule di batteri in 9 mL di TSB + 3% NaCl per ottenere un fattore di diluizione 10-1 .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ripetere questo passaggio nove volte per ottenere una serie completa di fattore di diluizione fino a 10-10 . Successivamente, si sono diffuse 0,1 mL di ciascun fattore di diluizione (a partire da 10-1 a 10-10) sulla piastra di agar selettivo di un Vibrio per Colonia contando, rispettivamente. Incubare le piastre incubate a 37 ° C per 24 h.</li>
		<li>Utilizzare un contatore per contare diverse colonie e poi retro-calcolare (conteggio la quantità CFU/pipettato x fattore di diluizione) per ottenere un'unità formanti colonie per millilitro densità (CFU mL-1). Derivare la concentrazione della Colonia formando unità (CFUs) in sospensioni di cellule di batteri dalla trama di calibrazione di CFU mL-1 assorbanza.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del test PCR
	<ol>
<li>Estrarre DNA genomic seguendo un modificato bollito Lisi procedura34. Primo, streak un batterica individuale ceppo agarizzati e inoculare in media di brodo, seguita da incubazione e alla sua condizione di crescita relativa, un 140 giri/min agitazione condizione.</li>
		<li>Dispensare una cultura di 1 mL di brodo in una provetta da centrifuga micro. Questo Centrifugare a 4830 x g e a 4 ° C per 1 min ottenere pellet. Utilizzare circa 500 µ l di tampone sterile TE per risospensione con il pellet. Tenere la sospensione risultante per 10 min a 98 ± 2 ° C in un blocco di riscaldamento e raffreddare immediatamente a-18 ° C per 10 min lisare le cellule e liberare il DNA.</li>
		<li>Centrifugare il DNA genomico a 4830 x g e a 4 ° C per 3 minuti ottenere una sospensione di chiara e tenere il supernatante a-20 ° C per un ulteriore uso. Utilizzare una misurazione biofotometro con assorbimento UV a lunghezza d'onda di 260 nm (come acidi nucleici assorbire la lunghezza d'onda della luce) e anche ad una lunghezza d'onda di 280 nm (come le proteine assorbe la lunghezza d'onda della luce) per determinare la concentrazione e la purezza dell'Estratto il DNA genomico e quindi identificare tutti i ceppi utilizzando saggi biochimici standard35 e loro verifica tramite 16S rRNA gene sequenziamento36. Infine, denaturare il DNA genomico a 92 ° C per 2 min e raffreddarlo rapidamente in acqua di ghiaccio prima dell'applicazione per il biosensore.</li>
		<li>Confermare ulteriormente la presenza V. parahaemoliticus usando la PCR per il gene toxR di destinazione. Eseguire questa procedura in un termociclatore utilizzando una coppia di primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' e 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Ottimizzare l'amplificazione di PCR in un volume di reazione totale di 25 µ l composto da acqua sterile (15,5 µ l), buffer (5 µ l), primer (1 µ l, 10 µM), miscela del dNTP (1 µ l), mascherina del DNA (2 µ l) e la Taq DNA polimerasi (0,2 µ l, 10 x).</li>
		<li>Mescolare bene i componenti e organizzare l'amplificazione di PCR della sequenza dell'obiettivo in un termociclatore programmato per 30 cicli di amplificazione. Nel nostro studio, ogni ciclo consisteva di tre fasi reazioni i. e., denaturazione iniziale (94 ° C, min 3) seguita da 30 cicli di denaturazione (94 ° C, 1 min), ricottura (63 ° C, min 1,5) ed estensione (72 ° C, min 1,5), seguito dall'estensione finale (72 ° C, min 7).</li>
		<li>Determinare i prodotti amplificati e le loro dimensioni tramite elettroforesi su gel di agarosio 1.5%. Catturare le immagini di gel con un sistema gel-documentazione prodotta commercialmente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dei campioni di cockle
	<ol>
<li>Ottenere campioni freschi. Nota: Il nostro freschi vongole (Anadara granosa) erano ottenuti dal mercato bagnato in Serdang, Selangor e rapidamente portati al laboratorio in una scatola più fredda del ghiaccio per l'analisi. Dividere i campioni in 2 gruppi, vale a dire il gruppo trattato e non trattato, supponendo che le vongole sono state raccolte in modo uniforme dall'inizio della vendemmia fino alla loro immissione in cella frigorifera.</li>
		<li>Pretrattare le vongole nel gruppo curato memorizzandole a-20 ° C per 24 h, seguita dall'esposizione alla luce UV a 20 ° C per 4 h prima dell'estrazione del DNA. Nota: La temperatura di congelamento e l'esposizione UV utilizzato per la controllata gruppo uccide o almeno limita il naturalmente ad accumulare V. parahaemoliticus nelle vongole. Non applicare un regime di pastorizzazione più alto di 70 ° C come l'obiettivo della condizione controllata in questo studio è quello di imitare la situazione reale dei cardi freschi. Nel frattempo, analizzare campioni direttamente al gruppo non trattato senza alcun pre-trattamento, non appena arrivano in laboratorio.</li>
		<li>Sottocultura un ceppo di V. parahaemoliticus ATCC 17802 in TSB (3% NaCl). Determinare il livello di cellule vitali nell'inoculo tramite placcatura di appropriate diluizioni della TSB (3% NaCl) su CA al fine di ottenere un inoculo di 104 CFU mL-1 di V. parahaemoliticus. Lavare ogni cockle in acqua distillata e lo scrub privo di sporco prima di utilizzare pinze sterili in un'unità a flusso laminare per rimuovere i tessuti dalla shell.</li>
		<li>Circa 10 g di campioni di tessuto di cockle di omogeneizzare con un omogeneizzatore in 90 mL di TSB sterile (3% NaCl) per 60 s. Aggiungi una quantità nota di V. parahaemoliticus a 9 mL di brodo campione omogeneizzato per i campioni arricchiti. Utilizzare gli esempi sono come controllo negativo. Stimare i conteggi delle cellule di V. parahaemoliticus a spillo per i campioni di cockle da 0,1 mL dei campioni su CA di placcatura, e successivamente, Pipettare 1 mL di campioni in una microcentrifuga per DNA campione estrazione, da utilizzarsi nel biosensore e analisi di PCR.</li>
		<li>Estrarre il DNA genomico del V. parahaemoliticus dai campioni a spillo e sono seguito modificato bollito Lisi procedura36. Infine, determinare la concentrazione di DNA e la purezza tramite una misurazione di Fotometro bio con assorbimento UV a lunghezza d'onda di 260 nm (come acidi nucleici assorbire la lunghezza d'onda della luce) e anche ad una lunghezza d'onda di 280 nm (come le proteine assorbe la lunghezza d'onda della luce).</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I passaggi critici in un quadro di sviluppo positivo di questo tipo di biosensore elettrochimico sono selezione di elementi di riconoscimento biologico appropriato per il trasduttore (acido nucleico o DNA qui); approccio chimico per la costruzione di strato sensibile del trasduttore; materiale di trasduzione; ottimizzazione di immobilizzazione del DNA ed ibridazione; e convalida del biosensore sviluppato utilizzando campioni reali.
Core per il corretto sviluppo di un biosensore elettrochimico ...

Un importante argomento di dibattito pubblico e scientifico negli ultimi anni, l'intossicazione alimentare è principalmente associata con 3 agenti: microrganismi1, prodotti chimici2e parassiti3. Alimenti contaminati possono causare conseguenze gravi per la salute negli esseri umani, soprattutto nel gruppo di rischio più elevato di quelli con un sistema immunitario debole, anziani, donne incinte, neonati e bambini piccoli4. Con più di 1 milione casi di diarrea acuta che accadono annualmente nei bambini sotto i 5 anni in Africa, Asia e America Latina, l'intossicazione alimentare è una malattia globale principale5,6 e l'organizzazione mondiale della sanità ha stabilito microrganismi come il più importante collaboratore7. Vibrio parahaemolyticus spicca i più ampiamente riconosciuti ceppi virulenti. Solitamente si trova in ambienti costieri, estuari e marino8, è un batterio gram-negativo, che diventa attiva in ambienti sale alti e provoca gravi gastroenteriti umana quando mangiato nella Marina non adeguatamente cotta, maltrattato o cruda prodotti9. Inoltre, condizioni mediche esistenti in alcune persone li rendono inclini a infezioni, setticemia o orecchio infezione derivante da V. parahaemolyticus10della ferita. I fattori di virulenza di V. parahaemoliticus emolisine sono divisi in due tipi che contribuiscono alla patogenesi della malattia: termostabile emolisina diretta (TDH) codificati da geni tdh ed emolisina TDH-correlati codificati da geni di trh11. I marcatori di virulenza (geni tdh e trh) di V. parahaemoliticus si trovano principalmente in campioni clinici piuttosto che in campioni ambientali.
V. parahaemoliticus possiede la capacità di sopravvivere in una vasta gamma di condizioni, rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali12. Il suo meccanismo di proliferazione intensifica il potenziale di rischio aumenta la sua tossicità in parallelo con cellula massa13. Peggio ancora, il cambiamento climatico sta fornendo questi batteri con ampio condizioni per accelerare la loro crescita di popolazione cellulare14. A causa della sua alta frequenza, V. parahaemoliticus deve essere monitorato lungo la catena di approvvigionamento alimentare, in particolare nel commercio e produzione di frutti di mare dal momento che tali prodotti sono dove si trovano in enormi quantità15,16 in tutto il mondo. Attualmente i batteri vengono identificati e isolati utilizzando una gamma di metodi tra cui prove biochimiche, arricchimento e selettivi17, enzima-collegata immunomagnetica sorbente assay (ELISA)18, elettroforesi del gel di impulso-campo (PFGE) 19, test di agglutinazione al lattice e della polimerasi reazione a catena (PCR) test20. Solitamente, questi metodi richiedono personale qualificato, sofisticati strumenti e tecniche laboriose che non forniscono informazioni sulla contaminazione immediatamente. Questo limita fortemente la probabilità di rilevare prontamente contaminazione nociva e applicazioni in loco. Strumenti di rilevazione rapida rimangono una sfida eccezionale.
Biosensoristica sta emergendo come un'opzione di promessa per la rilevazione di patogeni di origine alimentare, perché offre un risparmio di tempo, conveniente, pratico e in tempo reale analisi metodo21,22,23,24 . Tuttavia, anche se ci sono stati molti risultati positivi di rilevazione di analita in campioni arricchiti e soluzione standard utilizzando biosensori, c'è ancora una mancanza di ricerca applicata a campioni reali in miscele acquose o estratti organici25. Recentemente, biosensori elettrochimici tramite rilevazione diretta e/o indiretta dell'acido deossiribonucleico (DNA) hanno ricevuto maggiore attenzione tra gli scienziati, a causa della loro specifica per la rilevazione di complementare di destinazione tramite un evento di ibridazione26 , 27 , 28 , 29. questi approcci unici sono più stabili rispetto ai biosensori basati su enzima, offrendo così una tecnologia promettente per la miniaturizzazione e la commercializzazione. L'obiettivo dello studio segnalato qui è quello di costruire uno strumento veloce che può rilevare V. parahaemoliticus con alta selettività, sensibilità e praticità, basata sulla specificità di sequenza di DNA durante l'ibridazione. Strategie di identificazione comportano la combinazione di polilattico acido-stabilizzato di nanoparticelle d'oro (PLA-AuNPs)30 ed elettrodi di carbonio serigrafato (SPCEs) in presenza di indicatore di ibridazione, blu di metilene (MB). Il potenziale del costrutto rilevamento sviluppati è ulteriormente esplorato utilizzando campioni di batteri DNA cockle lisato e fresco.

<table><tbody><tr><td>Acetic acid</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoethane tetraacetic acid</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Dibasic sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Disodium hydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Gold (III) chloride trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>R&amp;amp;M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate III</td><td>R&amp;amp;M Chemicals</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate anhydrous salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Agar</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Broth</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Eosin methylene blue agar&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq Buffer</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>Loading dye 1kb DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td><td>Merck</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>McConkey Agar</td><td>Merck</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Broth</td><td>Merck</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td>Merck</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar</td><td>Merck</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemoliticus) è un agente patogeno comune di origine alimentare che contribuisce a gran parte dei problemi di salute pubblica a livello globale, significativamente che colpiscono il tasso di morbosità e di mortalità umana. I metodi convenzionali per il rilevamento di V. parahaemoliticus quali metodi basati su cultura, analisi immunologiche e metodi molecolari basati richiedono manipolazione complicate e sono che richiede tempo, noioso e costoso. Recentemente, biosensori hanno dimostrato di essere un promettente e completo metodo di rilevamento con i vantaggi di rilevamento rapido, economicità e praticità. Questa ricerca si concentra sullo sviluppo di un metodo rapido per rilevare V. parahaemoliticus con alta selettività e sensibilità utilizzando i principi di ibridazione del DNA. Nel lavoro, caratterizzazione di nanoparticelle d'oro stabilizzato in acido polilattico sintetizzato (PLA-AuNPs) è stata ottenuta utilizzando la diffrazione dei raggi x (XRD), spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis), microscopia elettronica in trasmissione (TEM), emissione di campo Microscopia elettronica a scansione (FESEM) e la voltammetria ciclica (CV). Inoltre abbiamo effettuato ulteriori test di stabilità, sensibilità e riproducibilità di PLA-AuNPs. Abbiamo trovato che il PLA-AuNPs formata una solida struttura di nanoparticelle stabilizzate in soluzione acquosa. Inoltre abbiamo osservato che la sensibilità migliorata grazie il più piccolo valore di resistenza (Rct) trasferimento carica ed un aumento della superficie attiva (0,41 cm2). Lo sviluppo del nostro biosensore di DNA si basava sulla modificazione di un elettrodo di carbonio serigrafato (SPCE) con PLA-AuNPs e utilizzando il blu di metilene (MB) come l'indicatore redox. Abbiamo valutato gli eventi immobilizzazione e ibridazione mediante voltammetria impulso differenziale (DPV). Abbiamo trovato che non-complementari, complementari e non corrispondenti oligonucleotidi specificamente si distinguevano per il biosensore fabbricato. Inoltre ha mostrato in modo affidabile sensibile rilevamento negli studi di reattività crociata contro vari agenti patogeni di origine alimentare e nell'identificazione di V. parahaemoliticus in vongole fresche.

Formazione di AuNPs è stato rivelato attraverso il cambiamento di colore della soluzione acquosa con citrato di sodio presente. Ciò ha causato il colore da modificare da giallo chiaro a un colore rosso rubino intenso. La generazione di PLA-AuNPs è stata confermata dagli spettri UV-vis (Figura 1) dove la crescita del picco surface plasmon resonance (SPR) è stata trovata a circa 540 nm. La formazione e l'esistenza di PLA-AuNPs è stato indicato alle gamme d...

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Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare

Un protocollo per lo sviluppo di un biosensore elettrochimico di DNA che comprende un elettrodo di carbonio nanoparticelle-modificato, serigrafata, acido-stabilizzato, oro polilattico per rilevare il vibrione paraemolitico è presentato.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Views.  Universiti Putra Malaysia. Un protocollo per lo sviluppo di un biosensore elettrochimico di DNA che comprende un elettrodo di carbonio nanoparticelle-modificato, serigrafata, acido-stabilizzato, oro polilattico per rilevare il vibrione paraemolitico è presentato.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Ricerca

Bioingegneria

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Immunologia e infezioni

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Rilevamento ottico di<em&gt; E. coli</em&gt; Batteri di mesoporosi Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME (Enzyme Linked Immuno magnetica elettrochimici) metodo di rilevazione micotossine

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Biologia

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

Agenti patogeni di origine alimentare Screening utilizzando Magneto-fluorescente nanosensore: Rilevazione rapida di e. Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Piattaforma di microfluidica digitale basata su Electrowetting per l'analisi automatizzata di Immunosorbent legata all'enzima

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.

We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.

Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Electrochemical Biosensing

Electrochemical biosensors detect the binding of a target molecule by sensing an oxidation-reduction event. These sensors paved the way for modern biosensing after the invention of the glucose biosensor. This video will introduce electrochemical biosensing, show the workings of the glucose biosensor, and discuss how electrochemical biosensors are used in cancer detection.

Glucose Biosensor: an Electrochemical Biosensor

Biorilevamento elettrochimico

Electrochemical biosensors detect the binding of a target molecule by sensing an oxidation-reduction event.  These sensors paved the way for modern ...

Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine e piccole molecole

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Rilevamento ottico di

Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

ELIME (Enzyme Linked Immuno magnetica elettrochimici) metodo di rilevazione micotossine

Agenti patogeni di origine alimentare Screening utilizzando Magneto-fluorescente nanosensore: Rilevazione rapida di e. Coli O157: H7

Piattaforma di microfluidica digitale basata su Electrowetting per l'analisi automatizzata di Immunosorbent legata all'enzima

Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test

Biorilevamento elettrochimico

Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare

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Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine e piccole molecole