Quest'opera è stata eseguita presso e supportata da Worcester Polytechnic Institute.

1. preparazione del Nematode crescita medio (NGM) <ol><li>per 1 L di media, unire 20 g di agar, fonte di azoto organico 2,5 g (ad es., bacto-peptone) e 3 g di cloruro di sodio in un pallone da 2 L. Aggiungere 975 mL di acqua sterile.
	<ol><li>Aggiungi in un ancoretta sterile. Se si utilizza un versatore automatico dei supporti, la tubazione di autoclave e la media per 15 min; media dovrebbe essere sterilizzato nell'autoclave per più se viene effettuato un volume più alto.</li>
	</ol></li> <li>Impostare media sulla piastra di mescolare e lasciare per raffreddare.
	<ol><li>Una volta media è calda al tatto in modo asettico (circa 60 ° C) aggiungere 1 mL di 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL di 1 M CaCl 2, 25 mL di KPO 4 e 1 mL di colesterolo di 0,5% in etanolo.</li>
		<li>Versare media (a mano, o di pompa automatica) sotto flusso laminare in 35 x 10 mm Petri sterili. Lasciare per asciugare sotto cappa per 1-2 giorni prima dell'uso. 
		Nota: Piastre devono essere conservate a 4 ° C per evitare la contaminazione.</li>
	</ol></li></ol> 2. Facendo un Worm Pick <ol><li>tagliare un pezzo di filo di alluminio 1,5 cm. Inserire la punta di una pipetta di Pasteur attentamente circa 0,5 cm di questa lunghezza.
	<ol><li>Utilizza un bruciatore di Bunsen o lampada dell'alcool, sciogliere la punta della pipetta di vetro ruotandolo lentamente nella fiamma fino a quando il filo è rispettato in modo sicuro la pipetta, senza compromettere la forma originale della punta della pipetta.</li>
	</ol></li></ol> 3. Preparazione della cultura di e. coli <ol><li>con un'ansa sterile, inoculare singola colonia di e. coli ceppo OP50 in 200 mL di brodo di Luria. Incubare per una notte con agitazione a 37 ° C.</li>
	<li>La coltura liquida è pronta per l'uso il giorno seguente e possono essere conservata a 4 ° C quando non in uso. 
	Nota: Il ceppo di e. coli, OP50, viene utilizzato come una fonte di cibo per elegans del c. Questa cultura può essere utilizzata per fino a diversi mesi se conservato a 4 ° C.</li>
</ol> 4. Essenziale di c. elegans manutenzione <ol><li>seme preparato piatti di agar NGM con e. coli individuando circa 50-100 µ l di preparati OP50 coltura liquida al centro del piatto.</li>
	<li>Piastre di copertura e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per 24 h. Una volta asciutto, posizionare le piastre a 37 ° C durante la notte per una crescita rapida o conservare a temperatura ambiente, se non si desidera una crescita più lenta.</li>
	<li>Aggiungere vermi alla piastra da uno &#34; chunking, &#34; (Vedi protocollo passo 5 &#34; Chunking e Picking worm &#34;), picking vermi individualmente o disporre le uova di verme direttamente sulla piastra (Vedi protocollo passo 6 &#34; uovo preparazione &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking e Picking worm Nota: &#34; Chunking, &#34; si riferisce ad una pratica che è comune nella manutenzione di c. elegans. Si tratta di taglio di una sezione della piastra di agar NGM che contiene worm e trasferendo questo pezzo su un piatto nuovo, trasferendo così anche un gran numero di vermi nel processo. Contaminazione può anche essere tagliato fuori il piatto in questo modo. Quando la raccolta vermi, è importante mantenere l'integrità dell'agar perché vermi possono essere perso in fori nell'agar. Inoltre, è importante consentire il prelievo si raffreddi prima di toccare la piastra per evitare che l'agar di fusione o bruciare i vermi.
<ol><li>Al fine di trasferire rapidamente grandi quantità di vermi sulle nuove piastre, tagliare un pezzo di agar NGM contenente i vermi selezionati utilizzando una spatola. Rimuovere il pezzo tagliato e appoggiarlo sul bordo del prato di OP50 su un piatto nuovo.</li>
	<li>Trasferimento worm singolarmente, come descritto di seguito nel passaggio di protocollo 8.2, &#34; analisi di sopravvivenza, &#34; usando un verme pick. Fiamma il filo nel verme prendere fino a quando è rosso. Rimuoverlo dal fuoco e lasciarla raffreddare per pochi secondi.</li>
	<li>Utilizzando il filo nel prelievo, raschiare delicatamente il prato della cultura OP50 coltivata sulla nuova piastra, che copre il filo nel prelievo.</li>
	<li>La cultura viscosa che copre la punta del filo rende worm bastone fino alla punta del plettro, così delicatamente raccogliere vermi selezionati usando un movimento swiping.</li>
	<li>Una volta selezionati vermi sono raccolte, metterli su un piatto nuovo scorrendo delicatamente coltura agar. Posizionare il filo in fiamma per rimuovere cultura rimanente nel prelievo.</li>
</ol> 6. Preparazione di uova <ol><li>posto circa 20 animali adulti (circa 2-3 giorni dopo la schiusa, quando coltivate a 20 ° C) da prelievo o suddivisione in blocchi come descritto nel protocollo passaggio 5, &#34; Chunking e Picking worm, &#34; su un piatto seminato con 50 µ L di e. coli ceppo, OP50.</li>
	<li>Per raccogliere le uova, inondare la piastra con 10 mL di buffer di M9 dopo 1-2 giorni. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro, turbolenza e agitare delicatamente il contenuto sulla piastra di agar a rilasciare le uova attaccate alla OP50 o animali adulti. Raccogliere tutto il liquido che contiene le uova e gli adulti.</li>
	Tubo di <li>trasferire M9 e OP50 soluzione in un 15 mL conico. Centrifugare la provetta conica da 15 mL a 2.100 x g per 2 min.</li>
	<li>Aspirare circa 9 mL di surnatante senza disturbare il pellet OP50.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 2 mL di acqua sterile, 1 mL di candeggina e 1 mL di NaOH di 0.25 M.</li>
	<li>Mescolare delicatamente capovolgendo fino a quando la maggioranza (circa il 70 per cento) di animali adulti appaiono lisata; in genere, le uova rimangono intatte durante questo trattamento breve candeggina a causa delle loro coperture. Centrifugare la provetta conica a 990 x g per 2 min.</li>
	<li>Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 10 mL di buffer di M9.</li>
	<li>Centrifugare la provetta conica in 990 x g per 2 min. aspirare il surnatante senza pellet inquietante. Risospendere il pellet con 200 µ l di tampone di M9. 
	Nota: Preparazione uovo può richiedere prove multiple. Le uova possono essere distrutte se sono esposti per candeggiare per troppo tempo. Se non si schiudono le uova, o diminuire la concentrazione di candeggina in soluzione o diminuire la durata dell'esposizione alla candeggina.</li>
</ol> 7. Set-up piatto infezione <ol><li>dispensare 3-5 mL di YPD in una provetta sterile e inoculare esso con una singola colonia di Candida albicans con un'ansa sterile.
	<ol><li>Posizionare il tubo su un tamburo rotatorio per circa 16-18 h a 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Etichetta uno 1,5 mL microfuge tubo per contenere i albicans del c. e un altro per contenere OP50. Registrare il peso di ogni provetta vuota.
	<ol><li>Posto 500 µ l del pernottamento albicans del c. cultura nella provetta etichettata albicans del c. e 1.500 µ l della cultura OP50 durante la notte (dal punto 3.1) nella provetta etichettata OP50.</li>
		<li>Centrifuga per 10 min a 16.100 x aspirare il surnatante g. senza pellet inquietante.</li>
		<li>Ri-sospendere ogni pallina con 500 µ l di acqua sterile. Centrifugare per 5 min 16.100 x g.</li>
		<li>Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Registrare il peso finale dei tubi del microfuge.</li>
		<li>Determinare il peso di ogni pallina sottraendo il peso iniziale dei tubi dal peso finale del microfuge.</li>
	</ol></li> <li>Con acqua sterile, risospendere il pellet di albicans del c. a 10 mg/mL e il pellet OP50 a 200 mg/mL. Rendere un'infezione master mix combinando 10 µ l di una soluzione di 50 mg/mL di streptomicina, 2,5 µ l di cultura OP50, 0,5 µ l di albicans del c. cultura e 7 µ l di acqua sterile.
	<ol><li>Per placche di comando, è necessario creare un mix master sostituendo il volume della cultura di albicans del c. con acqua sterile. Seme di 20 µ l di miscela di infezione o soluzione di controllo OP50 sulle piastre centro di NGM utilizzando una micropipetta. 
		Nota: Circa 100 vermi sono necessari per determinare la significatività statistica durante l'analisi. Questo test viene in genere eseguito in triplice copia. Così, un 3.2 x mix infezione nonché un 3.2 x soluzione di controllo è fatto. Queste miscele sono fatte per essere leggermente oltre 3 volte l'originale per garantire che un pieno 20 µ l è seminato in ogni piatto, lasciando spazio per l'errore. Questo mix master è creato perché la faringe del worm è troppo piccola durante le fasi iniziali di larvale (L1-L3) a consumare c. albicans. Per l'esposizione agli agenti farmacologici quali fluconazolo ( Figura 3B), l'agente è stato introdotto per la miscela di infezione. La concentrazione dell'agente è determinata empiricamente. Ad esempio, in Figura 3B, 50 µM Fluconazole è rappresentata, tuttavia 0, 12,5, 25, 50 e 100 µM Fluconazole erano anche testato usando lo stesso protocollo.</li>
	</ol></li></ol> 8. Analisi del fenotipo di regione anale deformato (Dar) e analisi di sopravvivenza <ol><li>Visualize il fenotipo di Dar Nota: Dar meglio viene visualizzato nella fase L3 e oltre. Dar si presenta come una piccola sporgenza della regione anale post del worm ( Figura 2A), che diventa più evidente nel corso del tempo.
	<ol><li>Conferma se un animale ha Dar rapidamente toccando la piastra sul palco del microscopio di dissezione; animali senza Dar volontà spostare all'indietro immediatamente, mentre gli animali con il Dar che verranno sia bisogno ripetuti giri di maschiatura per invertire la loro direzione, o non farlo affatto.</li>
	</ol></li> <li>Analisi di sopravvivenza <ol><li>preparazione completa uovo come precedentemente descritto nel protocollo passaggio 6, &#34; uovo preparazione &#34;. Contare le uova nell'ambito di dissezione e diluire la soluzione di uovo con M9 finché non si ottiene una concentrazione di circa 5-6 uova sane per µ l. Usando una pipetta, dispensare 20 µ l di campione contenente circa 30 uova sul piatto preparato di NGM, nella zona tra la coltura batterica e il lato della piastra (uova e vite senza fine alimentare, OP50, sono in due punti distinti).</li>
		<li>Piastre Incubate a 20 ° C per 48 h. Sotto un microscopio di dissezione, contare il numero di vermi vivi e morti adulti su ogni piatto, così come il numero di vermi con Dar. Registrare la percentuale con Dar.</li>
		<li>Considera un animale morto, se non risponde di essere sfruttato sulla testa di un filo di alluminio o toccando la piastra.</li>
		<li>Ogni altro giorno, trasferire i vermi adulti restanti scegliendo come descritto nel protocollo passaggio 5, &#34; Chunking e Picking worm, &#34; su un piatto di infezione o controllo di nuovo. A questo punto, se necessario, eseguire un'analisi di sopravvivenza di rilevamento del numero di vermi dal vivo, morti e mancante ogni giorno. 
		Nota: Questo test può eseguire per due settimane, cominciando con preparazione di uova. Inoltre, la soluzione di uovo non dovrebbe essere erogata sulla cultura batterica, come la soluzione può contenere tracce di candeggina che può uccidere il OP50. La soluzione dovrebbe essere erogato circa 0,5 cm dal bordo della piastra, come le uova possono restare bloccate tra i lati della piastra e l'agar. Inoltre, a causa della rapida proliferazione di vermi, trasferendo gli adulti sulle nuove piastre è fondamentale per separarli dalla loro progenie.</li>
	</ol></li> <li>Analizzare sopravvivenza <ol><li>analizzare risultati utilizzando software di analisi di sopravvivenza curva (vedere elenco dei materiali).</li>
		Curve di <li>Confronta sopravvivenza utilizzando il metodo Grehan-Breslow-Wilcoxon (supponendo che i dati dai primi tempi di sopravvivenza sono più accurati di epoche successive, peso di conseguenza i dati) così come di strumenti statistici di Logrank 45. 
		Nota: Ad esempio, in Figura 4B -C, la sopravvivenza di vermi trattati con mutante c. albicans è rispetto a quelli trattati con isogeni selvaggio-tipo controlli o complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I metodi per analizzante infezione di c. elegans e sopravvivenza sopra esposizione in vita a albicans del c. che abbiamo descritto possono essere modificati per testare un altro agente patogeno. Colture liquide di un altro batteri o funghi possono essere formate e alimentate al c. elegans in modo simile. Inoltre, possono essere dosate seriale infezioni prima esponendo la larva di un agente patogeno come descritto, e quindi trasferire gli animali su un nuovo piatto contenente un agente patogeno ...

C. elegans è stato utilizzato come organismo modello potente per più di 50 anni. Nel 1960, biologo sudafricano Sydney Brenner ha sperimentato l'uso di c. elegans per studiare lo sviluppo neuronale, aprendo la strada a una lunga stirpe di scienziati per studiare vari aspetti della biologia delle cellule e animali nei nematodi. Questo lignaggio include vincitori del premio Nobel Craig Mello e Andrew Fire per il loro lavoro di RNAi1, Robert Horvitz e John Sulston per il loro lavoro per lo sviluppo dell'organo e apoptosi2,3,4e Martin Chalfie per il suo lavoro sulla proteina fluorescente verde5. Anche se questo organismo di modello è stato tradizionalmente usato per studiare la biologia molecolare e dello sviluppo, negli ultimi 15 anni, i ricercatori hanno cominciato ad usare c. elegans per studiare la biologia di vari agenti patogeni umani, tra cui Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericae Serratia marcescens6,7,8,9,10. Questi studi hanno rivelato che molti dei meccanismi coinvolti nell'interazione umano-patogeno sono conservati in nematodi, ma anche che ci sono alcuni meccanismi di immunità che sono unici per questo modello organismo11,12. In natura, c. elegans incontra una varietà di minacce da ingerito agenti patogeni presenti nel terreno e questo ha fornito una forte pressione selettiva per evolvere e mantenere un sofisticato sistema immunitario innato nel suo lume intestinale. Molti dei geni e meccanismi coinvolti nella protezione del lume intestinale sono orchestrati da elementi altamente conservata che esistono anche in più alti mammiferi11,13. C. elegans rappresenta quindi un ottimo modello per studiare gli agenti patogeni gastrointestinali come Salmonella enterica14, Shigella boydii15o vibrione del colera16.
Qui si evidenzia la notevole versatilità di c. elegans come un host di modello per lo studio di agenti infettivi quali c. albicans. C. elegans come un host di modello consente di screening su vasta scala per la virulenza che è meno costoso e che richiede tempo che un modello del topo, che è comunemente usato per studiare la candidosi42.
In questo studio, mostriamo che questo modello e l'analisi di sopravvivenza manuale può essere utilizzati in modo affidabile per lo studio di host innata gli effettori immunitari importanti per contrastare le infezioni, fattori determinanti di agente patogeno che guidano la virulenza, e composti farmacologici che possono intervenire nella patogenesi. Dissimile da saggi descritti in precedenza, questo metodo fornisce un mezzo per studiare l'esposizione ad un agente patogeno per tutta la durata dell'animale, dalla fase larvale di età adulta, piuttosto che solo nell'età adulta a morte43,44. In sintesi, il nostro c. elegans - modello c. albicans è uno strumento potente e versatile che può essere utilizzato non solo per studiare le basi genetiche che guidano l'infezione e l'immunità, ma anche di identificare nuovi composti per intervento terapeutico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>20-248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M32P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td>
			<td>Axiovision Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Peptone</td>
			<td>Fisher BioReagants</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Bli-3</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>Bli-3(e767) CB767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP51-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td>
			<td>FIsherBrand</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Nikon Instrument Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller&#39;s)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>11-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. albicans SC5314</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SC5314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

Dimostriamo un metodo utilizzando Caenorhabditis elegans come un host di modello per studiare l'interazione microbica. I microbi vengono introdotti attraverso la dieta rendendo l'intestino il luogo primario per la malattia. L'intestino del nematode strutturalmente e funzionalmente imita gli intestini dei mammiferi ed è trasparente che lo rende suscettibile di uno studio al microscopio della colonizzazione. Qui vi mostriamo che gli agenti patogeni possono causare la malattia e la morte. Siamo in grado di identificare microbiche mutanti che mostrano alterata virulenza. Sua risposta innata conservata a stress biotici rende c. elegans un eccellente sistema per sondare le sfaccettature delle interazioni immune innata ospite. Indichiamo che padroni di casa con le mutazioni nel gene raddoppiano ossidasi non può produrre le specie reattive dell'ossigeno e sono in grado di resistere insulto microbico. Noi dimostrare ulteriormente la versatilità del dosaggio sopravvivenza presentato mostrando che può essere utilizzato per studiare gli effetti degli inibitori della crescita microbica. Questo dosaggio può anche essere usato per scoprire i fattori di virulenza fungine come bersagli per lo sviluppo di nuovi agenti antifungini, nonché a fornire l'opportunità di scoprire ulteriori interazioni ospite-microbo. Il design di questo test si presta bene a throughput elevato schermi intero genoma, mentre la possibilità di crioconservare worm per un utilizzo futuro lo rende un modello animale intero conveniente e attraente per studiare.

Un'analisi di patogenesi (Figura 1) usando i albicans del c. e c. elegans precedentemente è stato descritto dal nostro laboratorio17,18 e altri laboratori19,20. Dimostriamo la disponibilità dell'utilizzo di c. elegans per studiare la virulenza di albicans del c. mostrando che le cellule di c. albicans<...

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

Qui, presentiamo il nematode Caenorhabditis elegans come un modello versatile host per studiare l'interazione microbica.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

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Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

La manipolazione genetica del patogeno per le piante<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Per studiare Fungal Biology and Plant Microbo Interazioni

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Coniugazione saggi di accoppiamento per l&#39;analisi specifica per sequenza di proteine ​​di trasferimento relativi coniugazione batterica

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipolazione di Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

Il metodo Set di Replica: Un approccio High-throughput per quantitativamente misura Caenorhabditis elegans durata della vita

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Cultura e dosaggio delle popolazioni di caenorhabditis elegans a grande scala

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

Riepilogo

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Capitoli in questo video

La manipolazione genetica del patogeno per le piante

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in

Coniugazione saggi di accoppiamento per l'analisi specifica per sequenza di proteine di trasferimento relativi coniugazione batterica

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

Manipolazione di Ploidy in Caenorhabditis elegans

Il metodo Set di Replica: Un approccio High-throughput per quantitativamente misura Caenorhabditis elegans durata della vita

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido

Cultura e dosaggio delle popolazioni di caenorhabditis elegans a grande scala

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