Quest'opera è stata eseguita presso e supportata da Worcester Polytechnic Institute.

1. preparazione del Nematode crescita medio (NGM) <ol><li>per 1 L di media, unire 20 g di agar, fonte di azoto organico 2,5 g (ad es., bacto-peptone) e 3 g di cloruro di sodio in un pallone da 2 L. Aggiungere 975 mL di acqua sterile.
	<ol><li>Aggiungi in un ancoretta sterile. Se si utilizza un versatore automatico dei supporti, la tubazione di autoclave e la media per 15 min; media dovrebbe essere sterilizzato nell'autoclave per più se viene effettuato un volume più alto.</li>
	</ol></li> <li>Impostare media sulla piastra di mescolare e lasciare per raffreddare.
	<ol><li>Una volta media è calda al tatto in modo asettico (circa 60 ° C) aggiungere 1 mL di 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL di 1 M CaCl 2, 25 mL di KPO 4 e 1 mL di colesterolo di 0,5% in etanolo.</li>
		<li>Versare media (a mano, o di pompa automatica) sotto flusso laminare in 35 x 10 mm Petri sterili. Lasciare per asciugare sotto cappa per 1-2 giorni prima dell'uso. 
		Nota: Piastre devono essere conservate a 4 ° C per evitare la contaminazione.</li>
	</ol></li></ol> 2. Facendo un Worm Pick <ol><li>tagliare un pezzo di filo di alluminio 1,5 cm. Inserire la punta di una pipetta di Pasteur attentamente circa 0,5 cm di questa lunghezza.
	<ol><li>Utilizza un bruciatore di Bunsen o lampada dell'alcool, sciogliere la punta della pipetta di vetro ruotandolo lentamente nella fiamma fino a quando il filo è rispettato in modo sicuro la pipetta, senza compromettere la forma originale della punta della pipetta.</li>
	</ol></li></ol> 3. Preparazione della cultura di e. coli <ol><li>con un'ansa sterile, inoculare singola colonia di e. coli ceppo OP50 in 200 mL di brodo di Luria. Incubare per una notte con agitazione a 37 ° C.</li>
	<li>La coltura liquida è pronta per l'uso il giorno seguente e possono essere conservata a 4 ° C quando non in uso. 
	Nota: Il ceppo di e. coli, OP50, viene utilizzato come una fonte di cibo per elegans del c. Questa cultura può essere utilizzata per fino a diversi mesi se conservato a 4 ° C.</li>
</ol> 4. Essenziale di c. elegans manutenzione <ol><li>seme preparato piatti di agar NGM con e. coli individuando circa 50-100 µ l di preparati OP50 coltura liquida al centro del piatto.</li>
	<li>Piastre di copertura e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per 24 h. Una volta asciutto, posizionare le piastre a 37 ° C durante la notte per una crescita rapida o conservare a temperatura ambiente, se non si desidera una crescita più lenta.</li>
	<li>Aggiungere vermi alla piastra da uno &#34; chunking, &#34; (Vedi protocollo passo 5 &#34; Chunking e Picking worm &#34;), picking vermi individualmente o disporre le uova di verme direttamente sulla piastra (Vedi protocollo passo 6 &#34; uovo preparazione &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking e Picking worm Nota: &#34; Chunking, &#34; si riferisce ad una pratica che è comune nella manutenzione di c. elegans. Si tratta di taglio di una sezione della piastra di agar NGM che contiene worm e trasferendo questo pezzo su un piatto nuovo, trasferendo così anche un gran numero di vermi nel processo. Contaminazione può anche essere tagliato fuori il piatto in questo modo. Quando la raccolta vermi, è importante mantenere l'integrità dell'agar perché vermi possono essere perso in fori nell'agar. Inoltre, è importante consentire il prelievo si raffreddi prima di toccare la piastra per evitare che l'agar di fusione o bruciare i vermi.
<ol><li>Al fine di trasferire rapidamente grandi quantità di vermi sulle nuove piastre, tagliare un pezzo di agar NGM contenente i vermi selezionati utilizzando una spatola. Rimuovere il pezzo tagliato e appoggiarlo sul bordo del prato di OP50 su un piatto nuovo.</li>
	<li>Trasferimento worm singolarmente, come descritto di seguito nel passaggio di protocollo 8.2, &#34; analisi di sopravvivenza, &#34; usando un verme pick. Fiamma il filo nel verme prendere fino a quando è rosso. Rimuoverlo dal fuoco e lasciarla raffreddare per pochi secondi.</li>
	<li>Utilizzando il filo nel prelievo, raschiare delicatamente il prato della cultura OP50 coltivata sulla nuova piastra, che copre il filo nel prelievo.</li>
	<li>La cultura viscosa che copre la punta del filo rende worm bastone fino alla punta del plettro, così delicatamente raccogliere vermi selezionati usando un movimento swiping.</li>
	<li>Una volta selezionati vermi sono raccolte, metterli su un piatto nuovo scorrendo delicatamente coltura agar. Posizionare il filo in fiamma per rimuovere cultura rimanente nel prelievo.</li>
</ol> 6. Preparazione di uova <ol><li>posto circa 20 animali adulti (circa 2-3 giorni dopo la schiusa, quando coltivate a 20 ° C) da prelievo o suddivisione in blocchi come descritto nel protocollo passaggio 5, &#34; Chunking e Picking worm, &#34; su un piatto seminato con 50 µ L di e. coli ceppo, OP50.</li>
	<li>Per raccogliere le uova, inondare la piastra con 10 mL di buffer di M9 dopo 1-2 giorni. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro, turbolenza e agitare delicatamente il contenuto sulla piastra di agar a rilasciare le uova attaccate alla OP50 o animali adulti. Raccogliere tutto il liquido che contiene le uova e gli adulti.</li>
	Tubo di <li>trasferire M9 e OP50 soluzione in un 15 mL conico. Centrifugare la provetta conica da 15 mL a 2.100 x g per 2 min.</li>
	<li>Aspirare circa 9 mL di surnatante senza disturbare il pellet OP50.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 2 mL di acqua sterile, 1 mL di candeggina e 1 mL di NaOH di 0.25 M.</li>
	<li>Mescolare delicatamente capovolgendo fino a quando la maggioranza (circa il 70 per cento) di animali adulti appaiono lisata; in genere, le uova rimangono intatte durante questo trattamento breve candeggina a causa delle loro coperture. Centrifugare la provetta conica a 990 x g per 2 min.</li>
	<li>Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 10 mL di buffer di M9.</li>
	<li>Centrifugare la provetta conica in 990 x g per 2 min. aspirare il surnatante senza pellet inquietante. Risospendere il pellet con 200 µ l di tampone di M9. 
	Nota: Preparazione uovo può richiedere prove multiple. Le uova possono essere distrutte se sono esposti per candeggiare per troppo tempo. Se non si schiudono le uova, o diminuire la concentrazione di candeggina in soluzione o diminuire la durata dell'esposizione alla candeggina.</li>
</ol> 7. Set-up piatto infezione <ol><li>dispensare 3-5 mL di YPD in una provetta sterile e inoculare esso con una singola colonia di Candida albicans con un'ansa sterile.
	<ol><li>Posizionare il tubo su un tamburo rotatorio per circa 16-18 h a 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Etichetta uno 1,5 mL microfuge tubo per contenere i albicans del c. e un altro per contenere OP50. Registrare il peso di ogni provetta vuota.
	<ol><li>Posto 500 µ l del pernottamento albicans del c. cultura nella provetta etichettata albicans del c. e 1.500 µ l della cultura OP50 durante la notte (dal punto 3.1) nella provetta etichettata OP50.</li>
		<li>Centrifuga per 10 min a 16.100 x aspirare il surnatante g. senza pellet inquietante.</li>
		<li>Ri-sospendere ogni pallina con 500 µ l di acqua sterile. Centrifugare per 5 min 16.100 x g.</li>
		<li>Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Registrare il peso finale dei tubi del microfuge.</li>
		<li>Determinare il peso di ogni pallina sottraendo il peso iniziale dei tubi dal peso finale del microfuge.</li>
	</ol></li> <li>Con acqua sterile, risospendere il pellet di albicans del c. a 10 mg/mL e il pellet OP50 a 200 mg/mL. Rendere un'infezione master mix combinando 10 µ l di una soluzione di 50 mg/mL di streptomicina, 2,5 µ l di cultura OP50, 0,5 µ l di albicans del c. cultura e 7 µ l di acqua sterile.
	<ol><li>Per placche di comando, è necessario creare un mix master sostituendo il volume della cultura di albicans del c. con acqua sterile. Seme di 20 µ l di miscela di infezione o soluzione di controllo OP50 sulle piastre centro di NGM utilizzando una micropipetta. 
		Nota: Circa 100 vermi sono necessari per determinare la significatività statistica durante l'analisi. Questo test viene in genere eseguito in triplice copia. Così, un 3.2 x mix infezione nonché un 3.2 x soluzione di controllo è fatto. Queste miscele sono fatte per essere leggermente oltre 3 volte l'originale per garantire che un pieno 20 µ l è seminato in ogni piatto, lasciando spazio per l'errore. Questo mix master è creato perché la faringe del worm è troppo piccola durante le fasi iniziali di larvale (L1-L3) a consumare c. albicans. Per l'esposizione agli agenti farmacologici quali fluconazolo ( Figura 3B), l'agente è stato introdotto per la miscela di infezione. La concentrazione dell'agente è determinata empiricamente. Ad esempio, in Figura 3B, 50 µM Fluconazole è rappresentata, tuttavia 0, 12,5, 25, 50 e 100 µM Fluconazole erano anche testato usando lo stesso protocollo.</li>
	</ol></li></ol> 8. Analisi del fenotipo di regione anale deformato (Dar) e analisi di sopravvivenza <ol><li>Visualize il fenotipo di Dar Nota: Dar meglio viene visualizzato nella fase L3 e oltre. Dar si presenta come una piccola sporgenza della regione anale post del worm ( Figura 2A), che diventa più evidente nel corso del tempo.
	<ol><li>Conferma se un animale ha Dar rapidamente toccando la piastra sul palco del microscopio di dissezione; animali senza Dar volontà spostare all'indietro immediatamente, mentre gli animali con il Dar che verranno sia bisogno ripetuti giri di maschiatura per invertire la loro direzione, o non farlo affatto.</li>
	</ol></li> <li>Analisi di sopravvivenza <ol><li>preparazione completa uovo come precedentemente descritto nel protocollo passaggio 6, &#34; uovo preparazione &#34;. Contare le uova nell'ambito di dissezione e diluire la soluzione di uovo con M9 finché non si ottiene una concentrazione di circa 5-6 uova sane per µ l. Usando una pipetta, dispensare 20 µ l di campione contenente circa 30 uova sul piatto preparato di NGM, nella zona tra la coltura batterica e il lato della piastra (uova e vite senza fine alimentare, OP50, sono in due punti distinti).</li>
		<li>Piastre Incubate a 20 ° C per 48 h. Sotto un microscopio di dissezione, contare il numero di vermi vivi e morti adulti su ogni piatto, così come il numero di vermi con Dar. Registrare la percentuale con Dar.</li>
		<li>Considera un animale morto, se non risponde di essere sfruttato sulla testa di un filo di alluminio o toccando la piastra.</li>
		<li>Ogni altro giorno, trasferire i vermi adulti restanti scegliendo come descritto nel protocollo passaggio 5, &#34; Chunking e Picking worm, &#34; su un piatto di infezione o controllo di nuovo. A questo punto, se necessario, eseguire un'analisi di sopravvivenza di rilevamento del numero di vermi dal vivo, morti e mancante ogni giorno. 
		Nota: Questo test può eseguire per due settimane, cominciando con preparazione di uova. Inoltre, la soluzione di uovo non dovrebbe essere erogata sulla cultura batterica, come la soluzione può contenere tracce di candeggina che può uccidere il OP50. La soluzione dovrebbe essere erogato circa 0,5 cm dal bordo della piastra, come le uova possono restare bloccate tra i lati della piastra e l'agar. Inoltre, a causa della rapida proliferazione di vermi, trasferendo gli adulti sulle nuove piastre è fondamentale per separarli dalla loro progenie.</li>
	</ol></li> <li>Analizzare sopravvivenza <ol><li>analizzare risultati utilizzando software di analisi di sopravvivenza curva (vedere elenco dei materiali).</li>
		Curve di <li>Confronta sopravvivenza utilizzando il metodo Grehan-Breslow-Wilcoxon (supponendo che i dati dai primi tempi di sopravvivenza sono più accurati di epoche successive, peso di conseguenza i dati) così come di strumenti statistici di Logrank 45. 
		Nota: Ad esempio, in Figura 4B -C, la sopravvivenza di vermi trattati con mutante c. albicans è rispetto a quelli trattati con isogeni selvaggio-tipo controlli o complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I metodi per analizzante infezione di c. elegans e sopravvivenza sopra esposizione in vita a albicans del c. che abbiamo descritto possono essere modificati per testare un altro agente patogeno. Colture liquide di un altro batteri o funghi possono essere formate e alimentate al c. elegans in modo simile. Inoltre, possono essere dosate seriale infezioni prima esponendo la larva di un agente patogeno come descritto, e quindi trasferire gli animali su un nuovo piatto contenente un agente patogeno ...

C. elegans è stato utilizzato come organismo modello potente per più di 50 anni. Nel 1960, biologo sudafricano Sydney Brenner ha sperimentato l'uso di c. elegans per studiare lo sviluppo neuronale, aprendo la strada a una lunga stirpe di scienziati per studiare vari aspetti della biologia delle cellule e animali nei nematodi. Questo lignaggio include vincitori del premio Nobel Craig Mello e Andrew Fire per il loro lavoro di RNAi1, Robert Horvitz e John Sulston per il loro lavoro per lo sviluppo dell'organo e apoptosi2,3,4e Martin Chalfie per il suo lavoro sulla proteina fluorescente verde5. Anche se questo organismo di modello è stato tradizionalmente usato per studiare la biologia molecolare e dello sviluppo, negli ultimi 15 anni, i ricercatori hanno cominciato ad usare c. elegans per studiare la biologia di vari agenti patogeni umani, tra cui Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericae Serratia marcescens6,7,8,9,10. Questi studi hanno rivelato che molti dei meccanismi coinvolti nell'interazione umano-patogeno sono conservati in nematodi, ma anche che ci sono alcuni meccanismi di immunità che sono unici per questo modello organismo11,12. In natura, c. elegans incontra una varietà di minacce da ingerito agenti patogeni presenti nel terreno e questo ha fornito una forte pressione selettiva per evolvere e mantenere un sofisticato sistema immunitario innato nel suo lume intestinale. Molti dei geni e meccanismi coinvolti nella protezione del lume intestinale sono orchestrati da elementi altamente conservata che esistono anche in più alti mammiferi11,13. C. elegans rappresenta quindi un ottimo modello per studiare gli agenti patogeni gastrointestinali come Salmonella enterica14, Shigella boydii15o vibrione del colera16.
Qui si evidenzia la notevole versatilità di c. elegans come un host di modello per lo studio di agenti infettivi quali c. albicans. C. elegans come un host di modello consente di screening su vasta scala per la virulenza che è meno costoso e che richiede tempo che un modello del topo, che è comunemente usato per studiare la candidosi42.
In questo studio, mostriamo che questo modello e l'analisi di sopravvivenza manuale può essere utilizzati in modo affidabile per lo studio di host innata gli effettori immunitari importanti per contrastare le infezioni, fattori determinanti di agente patogeno che guidano la virulenza, e composti farmacologici che possono intervenire nella patogenesi. Dissimile da saggi descritti in precedenza, questo metodo fornisce un mezzo per studiare l'esposizione ad un agente patogeno per tutta la durata dell'animale, dalla fase larvale di età adulta, piuttosto che solo nell'età adulta a morte43,44. In sintesi, il nostro c. elegans - modello c. albicans è uno strumento potente e versatile che può essere utilizzato non solo per studiare le basi genetiche che guidano l'infezione e l'immunità, ma anche di identificare nuovi composti per intervento terapeutico.

<table><tbody><tr><td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans strain Bli-3</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller&#039;s)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

Dimostriamo un metodo utilizzando Caenorhabditis elegans come un host di modello per studiare l'interazione microbica. I microbi vengono introdotti attraverso la dieta rendendo l'intestino il luogo primario per la malattia. L'intestino del nematode strutturalmente e funzionalmente imita gli intestini dei mammiferi ed è trasparente che lo rende suscettibile di uno studio al microscopio della colonizzazione. Qui vi mostriamo che gli agenti patogeni possono causare la malattia e la morte. Siamo in grado di identificare microbiche mutanti che mostrano alterata virulenza. Sua risposta innata conservata a stress biotici rende c. elegans un eccellente sistema per sondare le sfaccettature delle interazioni immune innata ospite. Indichiamo che padroni di casa con le mutazioni nel gene raddoppiano ossidasi non può produrre le specie reattive dell'ossigeno e sono in grado di resistere insulto microbico. Noi dimostrare ulteriormente la versatilità del dosaggio sopravvivenza presentato mostrando che può essere utilizzato per studiare gli effetti degli inibitori della crescita microbica. Questo dosaggio può anche essere usato per scoprire i fattori di virulenza fungine come bersagli per lo sviluppo di nuovi agenti antifungini, nonché a fornire l'opportunità di scoprire ulteriori interazioni ospite-microbo. Il design di questo test si presta bene a throughput elevato schermi intero genoma, mentre la possibilità di crioconservare worm per un utilizzo futuro lo rende un modello animale intero conveniente e attraente per studiare.

Un'analisi di patogenesi (Figura 1) usando i albicans del c. e c. elegans precedentemente è stato descritto dal nostro laboratorio17,18 e altri laboratori19,20. Dimostriamo la disponibilità dell'utilizzo di c. elegans per studiare la virulenza di albicans del c. mostrando che le cellule di c. albicans<...

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

Qui, presentiamo il nematode Caenorhabditis elegans come un modello versatile host per studiare l'interazione microbica.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

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Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans, is the fourth most common cause of nosocomial infections which results in ~40% mortality. However, other C. albicans infections are less severe and rarely lethal and include vulvovaginal candidiasis, impacting ~75% of women, as well as oropharyngeal candidiasis, predominantly impacting infants, AIDS patients and cancer patients. While murine models are most frequently used to study C. albicans pathogenesis, these models predominantly assess host survival and are costly, time consuming, and limited in replication. Therefore, several mini-model systems, including Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella, and Caenorhabditis elegans, have been developed to study C. albicans. These mini-models are well-suited for screening mutant libraries or diverse genetic backgrounds of C. albicans. Here we describe two approaches to study C. albicans infection using C. elegans. The first is a fecundity assay which measures host reproduction and monitors survival of individual hosts. The second is a lineage expansion assay which measures how C. albicans infection affects host population growth over multiple generations. Together, these assays provide a simple, cost-effective way to quickly assess C. albicans virulence.

<meta charset="utf8"></head><body>Due test di infezione per studiare i fenotipi di virulenza non letali in C. albicans utilizzando C. elegans

Fungal opportunist pathogens can cause life-threatening as well as minor infections, but non-lethal phenotypes are frequently ignored when studying virulence. Therefore, we developed a nematode model that monitors both the survival and reproduction aspects of host to investigate fungal virulence.

Due test di infezione per studiare i fenotipi di virulenza non letali in C. albicans utilizzando C. elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic ...

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Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Separazione automatica di<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabilmente Colonizzato da un batterio patogeno

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Immunologia e infezioni

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

Valutazione di virulenza e patogenesi dell'infezione da Aeromonas in un modello di Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

Pulizia selettiva dei nematodi caenorhabiditi selvatici per arricchire i batteri del microbioma intestinale

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

Studio dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da microsporidi di Caenorhabditis elegans

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

Ibridazione in situ con fluorescenza dell'RNA (FISH) per visualizzare la colonizzazione microbica e l'infezione nell'intestino di Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Screening ad alta produttività di isolati microbici con impatto sulla salute di Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Biologia

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

Isolamento e caratterizzazione del microbiota naturale del nematode modello Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Due test di infezione per studiare i fenotipi di virulenza non letali in C. albicans utilizzando C. elegans

Due test di infezione per studiare i fenotipi di virulenza non letali in C. albicans utilizzando C. elegans

Separazione automatica di

Valutazione di virulenza e patogenesi dell'infezione da Aeromonas in un modello di Caenorhabditis elegans

Pulizia selettiva dei nematodi caenorhabiditi selvatici per arricchire i batteri del microbioma intestinale

Studio dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da microsporidi di Caenorhabditis elegans

Ibridazione in situ con fluorescenza dell'RNA (FISH) per visualizzare la colonizzazione microbica e l'infezione nell'intestino di Caenorhabditis elegans

Screening ad alta produttività di isolati microbici con impatto sulla salute di Caenorhabditis elegans

Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

Isolamento e caratterizzazione del microbiota naturale del nematode modello Caenorhabditis elegans