Vorremmo riconoscere Elizabeth Sumner per il suo aiuto questo manoscritto di editing. Finanziamento per questo progetto è stato fornito in parte dal Moody Project per la ricerca di ferita di cervello traumatica traslazionale e RO1NS052532 di HLH.

Nota: tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal comitato di uso della University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas e istituzionali Animal Care come diretto dalla istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di Animali da laboratorio (8 ° edizione, nazionale Consiglio di ricerca).
 1. tissue Collection, identificazione di regione e sezionamento <ol><li>soggetto, maschio adulto, ratti Sprague-Dawley, circa sei settimane di vita e 250-300 g, alla lesione sperimentale percussioni fluido, come descritto in Shimamura et al. 4.</li> <li>twenty-four ora dopo sperimentale TBI, umanamente eutanasia gli animali mettendoli in una camera con una concentrazione di isoflurane del 4% fino a quando non anestetizzati. Garantire la morte per decapitazione, asportare i cervelli e congelare immediatamente in ghiaccio secco in polvere. Archivio congelati cervelli in un congelatore a-80 ° C fino al sezionamento.</li>
	<li>Priore a qualsiasi procedura di LCM che include analisi trascrizionale, pulire tutte le superfici con RNAsi eliminando detergente per mitigare il rischio di contaminazione e degradazione del RNA. 
	Nota: Questo servizio di pulizia prevede l'area utilizzata per la colorazione, il cui tessuto è sezionato, criostato e la zona intorno al dispositivo di LCM.</li>
	<li>Recuperare il tessuto cerebrale da deposito e posto in un criostato raffreddato a -20 ° C. Consenti il cervello per equilibrare la temperatura della camera del criostato per ~ 10 min</li>
	<li>Posto sul lato ventrale del cervello su un foglio di garza sopra la fase del criostato. Con una lama di rasoio pulita, privo di RNasi, tagliato fuori la parte posteriore solo rostral al cervelletto (può essere salvato o eliminato) e la porzione appena anteriore al chiasm ottico (och).</li>
	<li>Mettere una piccola quantità di mezzo di taglio ottimale temperatura (OCT) in due cryomolds separati. Posizionare il cervello (contenente la corteccia frontale associazione (FrA) e il "nucleus accumbens core" (AcbC)) nel lato anteriore cryomolds giù. Aggiungere sufficiente OCT terreno per coprire il tessuto.
	<ol><li>Ripetere questo passaggio con il tessuto di cervello contenente l'ippocampo (Hp) e il nucleo soprachiasmatico (SCN).</li>
		<li>Consentire allo OCT a congelare completamente per ~ 20 min a criostato.</li>
	</ol></li> <li>Una volta che il tessuto e medie OCT sono completamente congelati, spremere una piccola quantità di ottobre su una testa di montaggio e premere il cryomolds congelati contenenti il tessuto sulla testa di montaggio. Consentire l'OCT a congelare completamente in modo che lo stampo contenente il tessuto sia fissato saldamente alla testa.</li>
	<li>Fissare l'attacco testa al Monte sezionamento e serrare la vite. Regolare l'angolo di taglio rispetto alla lama di criostato con le leve di regolazione per garantire sezioni sono tagliati in modo uniforme.</li>
	<li>Impostare lo spessore di sezione a 30 µm. Durante il taglio del blocco di tessuto contenente la FrA e AcbC, prima iniziare sezionamento fino alla corteccia cerebrale è apparente e poi inizio raccolta.</li>
	<li>Riferendosi alla 12 Rat Brain Atlas, sezione e raccogliere cervello sezioni inserendo delicatamente diapositive di temperatura in polietilene napthalate (PEN) membrana sopra il tessuto sezionato per la FrA fino la corteccia motoria secondaria (M2 ) viene raggiunta a Bregma 5.16 mm.
	<ol><li>Visivamente accerti l'aderenza a scivolare controllando se tessuto e OCT sono completamente fusa sulla diapositiva. Memorizzare tutti i vetrini con le sezioni di tessuto nel criostato fino a colorazione.</li>
	</ol></li> <li>Continuare sezionamento fino a quando la commessura anteriore (aca) diventa visibile e unisce in una completa commissura sotto i ventricoli laterali ora apparenti (LV) al Bregma 1,80 mm.</li>
	<li>Raccogliere sezioni fino il LVs appaiono per connettersi con l'aca presso Bregma 0,84 mm.</li>
	<li>Una volta di sezionamento per la FrA e AcbC completata, rimuovere il blocco di tessuto montato e sostituire con il blocco contenente HP e SCN.</li>
	<li>Sezione fino a quando il och è appiattito al Bregma-0,480 mm, quando il terzo ventricolo (3V) diventa apparente.</li>
	<li>Raccolta sezioni per il SCN da questo punto fino al Bregma-0,720 mm, quando inizia il decussation Sopraottico (sox). 
	Nota: Potrebbe essere necessario raccogliere ulteriori sezioni di tessuto in tutto il och come il SCN facilmente è passato sopra.</li>
	<li>Per la raccolta di HP, sezione fino a quando le corna della cellula del granello strato circonvoluzione dentata (GrDG) sono visibilmente evidenti a Bregma-3,000 mm.</li>
	<li>Raccolta sezioni fino a quando i sottocampi di CA hippocampal sono fusi nelle sezioni coronale Bregma-4,780 mm. Questo dettaglio permette di collezione completa dell'ippocampo sotto il sito craniotomy e lesioni. 
	Nota: Come dimostrato in precedenti pubblicazioni da questo laboratorio, più cellule lese sarà evidente all'interno di questa gamma ed è appropriato per l'analisi di espressione genica o microRNA.</li>
</ol> 2. Protocollo di colorazione <ol><li>Priore alla macchiatura, lavare tutte le stoviglie e l'area di colorazione in una cappa chimica con detergente RNasi-eliminando. Questa preparazione riduce il rischio di degradazione del RNA dovuto contaminazione.</li>
	<li>Preparare tutti i reagenti di colorazione e soluzioni a nucleasi acqua gratis.</li>
	<li>Prendere un rack di diapositive memorizzate nel criostato e posto nella cappa. Vetrini per scaldarle per 30 s. posto in colorazione soluzioni (preparati con acqua gratuita nucleasi) come segue: 75% EtOH per 1 min, nucleasi gratis acqua per 1 min, viola di cresyl 1% per 1 min, nucleasi acqua gratuita per 30 s, nucleasi acqua gratuita per 30 s , 95% EtOH per 30 s, 100% EtOH per 30 s, xilene per 3 min e xilene per 3 min.</li>
	<li>Consentire il rack asciugare all'aria per non più di 10 min a temperatura ambiente nella cappa. In alternativa, posizionare rack in un essiccatore sotto vuoto RNAsi-libera per l'asciugatura più veloce. Una volta essiccato, procedere immediatamente al LCM.</li>
</ol> 3. Stereotactic Atlas guidato Laser Capture Microdissection con il sistema di LCM <ol><li>prima di iniziare qualsiasi procedura di LCM per analisi di RNA, pulire l'area di raccolta e la zona intorno al dispositivo con RNAsi-eliminando detergente e 100% EtOH.</li>
	<li>Flip l'interruttore di alimentazione sul laser IR generando unità prima di accendere il microscopio base e consentire al sistema di inizializzare prima software viene avviato dal desktop. 
	Nota: Se non è stata completata in questo ordine, il software non riconosce il microscopio.</li>
	<li>Una volta che il software ha avviato ed eseguito attraverso i passi durante l'inizializzazione, premere il &#34; attuale fase &#34; pulsante del software &#34; Installazione pannello. &#34; il palco modulare si sposterà nella posizione dove LCM Macro tappi e diapositive possono essere caricati e scaricati.</li>
	<li>Porre i vetrini di membrana di penna nei supporti (fino a tre alla volta) con l'estremità smerigliata rivolta verso destra. 
	Nota: Se inserito nel supporto per l'orientamento errato, il software potrebbe non essere in grado di riconoscere correttamente l'area desiderata di taglio di IR o UV.</li>
	<li>Clic la &#34; Mem &#34; checkbox nella &#34; Cap e Area di movimentazione diapositiva &#34; accanto alla rispettiva diapositiva (cioè, A, B o C). Questo passaggio indica se la diapositiva è una lastra di vetro di membrana. Quindi fare clic sulla diapositiva desiderata per essere catturato prima.</li>
	<li>Per rendere la fotocamera prendere un'immagine affiancata per la posizione del tessuto e l'orientamento per i posizionamenti di tappo, selezionare &#34; immagine &#34; sulla barra degli strumenti e selezionare &#34; Acquire panoramica. &#34; 
	Nota: Se l'utente abbia familiarità con il tessuto viene raccolto, questo passaggio può essere omesso utilizzando la pallina di scorrimento manuale per posizionare la &#34; regione centro &#34; per la raccolta.</li>
	<li>Posizionare il cursore sopra l'area immagine affiancata (o posizione relativa senza immagini affiancate), fare clic destro e selezionare &#34; tappo posto alla regione centro. &#34; il software verrà automaticamente posto un tappo sopra la posizione selezionata.</li>
	<li>Selezionare un percorso. 
	Nota: Per assicurarsi che il laser IR è correttamente allineato e preleverà solo alcune aree dove i punti sono disposti dal software deve trovarsi prima di procedere.
	<ol>
		<li>Spostarsi in un'area nell'ambito della PAC dove nessun tessuto è presente. Fare clic su &#34; ho &#34; alla &#34; riquadro strumenti Microdissect &#34; e selezionare il &#34; IR Locate &#34; scheda. Nel riquadro del fuoco una IR scatto di prova per valutare quale sta sparando con il laser IR e la dimensione dello spot.</li>
		<li>Con il cursore, fate clic destro nel mezzo IR spot e selezionare &#34; trova IR Spot. &#34; 
		Nota: Dimensione e l'intensità del fascio IR può essere modificati modificando manualmente il &#34; potenza, diametro o durata &#34; sotto ogni identificatore di formato di punto o spostando la scala di scorrimento nella parte inferiore della finestra di dialogo. Alcuni scatti di prova potrebbero essere necessario essere licenziato per garantire la corretta dimensione di punto. Il laser IR deve essere ri-trovano ogni volta la posizione della PAC modifiche o diapositive sono commutati.</li>
		<li>UV per taglio, individuare il laser UV selezionando la &#34; UV Locate &#34; scheda nella finestra di dialogo. 
		Nota: Perché il laser UV e il laser IR si muovono all'unisono, non c'è nessuna necessità di continuamente ri-localizzare il laser UV ogni volta che viene modificata la posizione.</li>
	</ol></li> <li>Scegli la &#34; disegno a mano libera &#34; opzione nella &#34; selezionare riquadro strumenti &#34;. Utilizzando uno stilo di touchscreen, disegnare intorno al perimetro della regione di interesse facendo in modo di non perdere il contatto tra il touchscreen e la testa di stilo. Assicurarsi di collegare l'inizio e punti finali insieme. 
	Nota: Macchie IR saranno stabilite automaticamente attraverso il software, ma l'utente può scegliere di stabilire ulteriori punti per garantire il tessuto viene rispettato il tappo dopo aver eseguito il taglio UV.</li>
	<li>Collezione per FrA, eseguire un'acquisizione laser lordo del tessuto corticale fino a quando la corteccia M2 appare al Bregma 5.16 mm. 
	Nota: Questo dettaglio può essere modificato tale che vengono raccolti solo specifiche porzioni di Fra' o tipi cellulari specifici.</li>
	<li>Per AcbC raccolta, acquisizione laser un'area vicino in prossimità di aca. 
	Il nucleo e la shell del AcbC svolgono diverse funzioni e sono fisiologicamente unici. Pertanto è importante seguire l'Atlante del cervello più vicino possibile. Si raccomanda di raccogliere da no ulteriore passato bregma 0,84 mm, come i due sottoregioni diventano troppo strettamente associati con l'altro.</li>
	<li>Per Hp collezione, laser capture CA 1, 2 e 3 sottocampi hippocampal Bregma 3.00 mm e impiegando il GrDG completamente formata come un punto di riferimento fisico per l'identificazione morfologica. 
	Nota: Ai fini di questo studio, non raccogliere passato Bregma-4,780 mm, che può essere delimitata visivamente come punto quando i sottocampi di Hp sono fuse e punto ventralmente. Questa zona è stato scelto come più feriti i neuroni possono essere scoperti direttamente sotto il sito di lesione 6.</li>
	<li>Per la raccolta di SCN, in primo luogo identificare visivamente i nuclei densamente imballati che sedersi dorsale per il och e poi raccolgono.</li>
	<li>Dopo la raccolta delle regioni (sopra elencati), spostare LCM Macro tappi per la &#34; posizione QC &#34; e controllare e verificare che l'aderenza completa del tessuto garantendo visivamente UV tagliare il tessuto è attaccato alla membrana. Posizionare rapidamente il tappo ontoan RNAsi-libera provetta di reazione di murato sottile del 0,5 mL contenente 100 µ l di tampone di lisi delle cellule.</li>
	<li>Campioni di vortex brevemente per garantire lisi completa e conservare a-80 ° C. A questo punto, LCM può essere messo in pausa e campioni conservati fino a quando non utilizzato per l'analisi genomica a valle 6.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Per gli studi molecolari del cervello dei mammiferi, LCM è diventata una tecnica essenziale. Questo articolo dimostra che usando la combinazione dei laser taglio IR e UV nel sistema LCM può catturare cambiamenti genomici in qualsiasi regione del cervello dei mammiferi. Queste regioni comprendono quelli identificabili con macchie di LCM-compatibile convenzionali, come la viola di cresyl o ematossilina ed eosina. La velocità del processo di laser-acquisizione e capacità di effettuare LCM su più spessa 30 µm sezioni su penna membrana diapositive permette di ottenere non solo una quantità sufficiente di campioni di cellule, ma anche per isolare il RNA dai campioni di LCM di qualità adatta per tutti i tipi di utilizzatori a valle analisi genomica; Queste analisi comprendono microarrays16, PCR matrici17e quantitativa PCR in tempo reale18.
I nostri dati forniscono una spiegazione razionale per gli studi che utilizzano il tessuto di LCM. Troviamo che miR-15b è upregulated nell'ippocampo e corteccia (Figura 4) ma downregulated nel nucleus accumbens e possono essere biologicamente rilevanti per la comprensione degli effetti differenziali di TBI nel cervello. Uno studio precedente suggerito che aumenti di vulnerabilita ' neuronale corticale alla ferita da sovraespressione di diversi Mirna che regolano negativamente il pro-sopravvivenza dei geni, quali Bcl-219. Destinazione scansione analisi spettacoli Bcl-2 è anche regolata da miR-15b; così, i nostri dati suggeriscono una spiegazione meccanicistica per perché regioni specifiche del cervello (cioè, FCx) possono essere selettivamente vulnerabili a TBI. È importante ricordare la maggior parte dei geni sono regolati da Mirna multiple e correlare cambiamenti in qualsiasi uno miRNA ad un gene specifico obiettivo è difficile. Inoltre, questi dati indicano che alcuni cambiamenti nell'espressione genica e microRNA possono essere usati come biomarcatori di danno di cervello di regione-specific. Infatti, stiamo attualmente utilizzando questi dati negli studi di neuroprotective come nuovi composti con proprietà Antidepressive differenzialmente possono influenzare espressione genica e microRNA in regioni del cervello collegata a disturbi neuropsichiatrici. Una limitazione del nostro studio è che durante i passaggi più procedimenti di preparazione di diapositiva per LCM, può diventare compromessa l'integrità del RNA. Questo protocollo descrive le misure necessarie per ridurre il rischio di degradazione del RNA. Un'altra limitazione è la dimensione del campione relativamente piccolo usata per il calcolo statistico. In futuro gli studi, aumentando la dimensione del campione dovrebbero diminuire gli effetti delle variazioni di espressione genica e miRNA tra singoli animali.
Il beneficio di LCM è realizzato negli studi di genomici traslazionali utilizzando modelli animali di malattie umane e tessuti malati20,21,22,,23. Senza la capacità di catturare le popolazioni delle cellule specifiche, i profili trascrizionali di regioni differenti del cervello sarebbe un mix inconoscibile e indecifrabile di molti tipi delle cellule. Utilizzando metodi di LCM negli studi di lesione cerebrale ha portato a attuali sforzi per delineare biomarcatori specifici di regione del cervello e capire come essi correlare con biomarcatori di TBI in circolazione.

Il cervello dei mammiferi è notevolmente complesso ed eterogeneo con centinaia di migliaia di tipi delle cellule1. Infatti, gli studi umani hanno dimostrato che in regioni come la corteccia frontale, strutturali e funzionali differenze nella materia bianca e grigia si riflettono nelle distinte e divergenti profili trascrizionali2. Eterogeneità di cervello è stato dei principali ostacoli per interpretare i dati di espressione genica e nel campo del trauma cranico. Questa ambiguità negli studi preclinici ha successivamente portato a centinaia di studi clinici non riuscite dei trattamenti per lesioni di cervello3.
Utilizziamo metodi laser capture microdissection (LCM) per studiare la ferita di cervello traumatica (TBI)-indotto disregolazione genica in ratto cervello4, concentrandosi sull'ippocampo, una regione del cervello che è essenziale per l'apprendimento e la memoria5. La capacità di cattura del laser e analizzare l'espressione genica sia morire che sopravvivere neuroni ci dà una maggiore comprensione del ruolo della variabilità stocastica nell'espressione genica nella determinazione del risultato (sopravvivenza neuronale) dopo TBI6. Tecniche di LCM si sono anche dimostrati utili per esplorare gli effetti di TBI a neuroni ippocampali quando si confrontano giovani e invecchiamento topi ratti o7 8.
In studi recenti, abbiamo esaminato altre regioni del cervello del ratto negativamente influenzato da TBI, con un focus sulle aree in ratti ed in pazienti TBI umani che sono associati con funzione esecutiva (cioè corteccia frontale9) e comorbidità TBI; Queste comorbidità includono depressione (cioè nucleo accumbens10) e disturbi del ritmo circadiano (di nucleo suprachiasmatic11). In studi precedenti, Huusko e Pitkanen12 e Drexel et al. 13 utilizzato LCM per esaminare l'espressione genica nel talamo e ipotalamo. Il nostro studio si basa su queste osservazioni precedenti e comprende quattro altre regioni del cervello. Per studiare i cambiamenti di regione-specific molecolari indotti dopo TBI, era necessario ottenere la competenza nell'individuare e ottenere tipi di cellule in queste regioni utilizzando un sistema di LCM. I laser di taglio UV e infrarossi (IR) consentono microdissection precisa di regioni cerebrali desiderata. Qui, descriviamo come utilizziamo questo sistema di LCM, guidato da coordinate stereotassiche nel ratto cervello Atlante14, per identificare e laser cattura quattro regioni del cervello del ratto differenzialmente sono interessati dal metodo di lesione sperimentale del cervello fluido-percussioni 4.

<table><tbody><tr><td>Arcturus Laser Capture Microdissection System</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Membrane Glass Slides&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xylene (Histological grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td><td>UTMB Pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro- Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Gene Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Taqman microRNA Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 96 System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stereotactic atlas-guided laser capture microdissection of brain regions affected by traumatic injury

La possibilità di isolare le regioni specifiche del cervello di interesse può essere impedita in tecniche di dissociazione del tessuto che non conservano la loro distribuzione spaziale. Tali tecniche inclinare anche potenzialmente analisi dell'espressione genica, perché il processo stesso può alterare i modelli di espressione in singole celle. Qui descriviamo un metodo di laser capture microdissection (LCM) per raccogliere in modo selettivo regioni specifiche del cervello colpite dalla ferita di cervello traumatica (TBI) utilizzando un Nissl modificate (viola di cresyl) che macchia protocollo e la Guida di un Atlante del cervello del ratto. LCM fornisce l'accesso a regioni del cervello nelle loro posizioni nativi e la possibilità di utilizzare reperi anatomici per l'identificazione di ogni regione specifica. A tal fine, LCM è stato utilizzato in precedenza per esaminare l'espressione di specifici geni di regione del cervello in TBI. Questo protocollo permette l'esame delle alterazioni indotte da TBI nell'espressione genica e microRNA in aree cerebrali distinte all'interno dello stesso animale. I principi del presente protocollo possono essere modificati e applicati a una vasta gamma di studi che esaminano l'espressione genomica in altre malattie e/o modelli animali.

Lo schema presentato nella Figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro complessivo di Atlante guidato LCM di regioni specifiche del cervello e le potenziali applicazioni di analisi a valle. Questo studio si è concentrato su quattro regioni del cervello pertinenti alla patofisiologia TBI e allo sviluppo di comorbilità: FrA, AcbC, SCN e Hp. Una limitazione presente in LCM di regioni specifiche del cervello è che localizzazioni anatomiche sono spesso oscurate da una mancanza di confini definiti, come si può vedere in Figura 2 (A, D, G, J). L'uso di un Atlante del cervello per guidare il sezionamento e acquisizione di specifiche regioni del laser riduce la possibilità di contaminazione del campione con regioni del cervello diverso da quello di destinazione. Quando la cura è presa per seguire i punti di riferimento del tessuto, sia durante il sezionamento e dopo la colorazione di Nissl, tecnologia di LCM è in grado di fornire un mezzo altamente coerenza per l'acquisizione di discrete popolazioni di cellule, i nuclei o regioni15. Gli obiettivi a lungo termine di questi studi sono di identificare geni e microRNA che potenzialmente possono fungere da surrogato, biomarcatori non invasivi regione specifici della ferita di cervello. Il primo passo in questa pipeline di sviluppo di biomarcatore è la caratterizzazione delle modifiche trascrizionali tessuto-specifica dopo TBI sperimentale. Questi dati quindi possono essere correlati con i cambiamenti indotti da lesione in biofluidi di circolazione.
Le procedure presentate sono state ottimizzate per ridurre i rischi di degradazione di RNA al fine di consentire l'analisi del RNA tramite trascrizione inversa di RNA totale di LCM prima PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR). RNA totale (comprese le piccole e grandi specie di RNA) è stato isolato utilizzando un metodo di isolamento basati su colonna sul tessuto che è stato catturato a laser da diverse regioni del cervello. Per valutare l'integrità del RNA, la qualità e quantità dopo procedure di isolamento, campioni del RNA erano brevemente denaturati a 70 ° C ed eseguire su un analizzatore di RNA. Misure qualitative incluso analizzando le ampiezze di picco delle bande rRNA 18s e 28s (Figura 3), che può essere rappresentante di degrado globale e utilizzando il "RNA integrità numero" (RIN). Se utilizza tecniche di RNAsi-libera attenta, RNA isolato dai campioni di LCM in genere risultati in RINs che vanno da 6-8. Un RIN inferiore può implicare la scarsa qualità di RNA e potenzialmente può diminuire la precisione dell'analisi di espressione genica e microRNA. Al contrario, un RIN superiore può migliorare la fiducia nella validità dei risultati ottenuti dall'analisi di RNA.
RT-qPCR è stato effettuato usando set di primer/sonda per singoli geni e microRNA (Figura 4). Circa 1 ng di RNA totale è stato retrotrascritto in cDNA e pre-amplificate prima qPCR è stata eseguita secondo il protocollo del produttore. Geni correlati alla lesione valutati in questo studio includevano BCL2 associati X, regolatore di apoptosi (Bax), B-cellula CLL/linfoma 2 (Bcl-2), caspasi 3, Apoptosis-Related cisteina peptidasi (Casp3) , Brain Derived Neurotrophic Factor (Bdnf) e CAMP Responsive Element Binding Protein 1 (Creb). MiR-15b è stato scelto perché è stato dimostrato essere alterato dopo TBI sperimentale in singoli neuroni morenti. Anche sperimentalmente ha convalidato e bioinformatically predetto geni bersaglio con funzioni di pro-sopravvivenza (dati non pubblicati). Piega-modifica normalizzata coefficienti sono stati calcolati dal metodo ΔΔCt confrontando i livelli di espressione genica e microRNA in TBI animali e controlli ingenuo, con normalizzazione di un gene endogeno (Gapdh) o piccolo RNA (U6), rispettivamente. Un cambiamento di piega superiore a 1 indica un upregulation complessivo in quel gene o microRNA, e al contrario, una piega inferiore a 1 indica un downregulation cambiare. Analisi statistica ha mostrato cambiamenti significativi nell'espressione genica tra controllo TBI e ingenuo (p ≤ 0,05) che dipendevano la regione del cervello. Nessun cambiamento significativo nell'espressione di miR-15b sono stato rilevato tra il controllo TBI e ingenuo, ma c'erano tendenze verso l'espressione più alta e più bassa in un modo dipendente dalla regione di cervello. Questi dati suggeriscono che l'ulteriore ottimizzazione è necessario per valutare i cambiamenti nell'espressione dei microRNA. È anche possibile che la dimensione del campione era troppo piccola per ottenere la significatività statistica, in parte a causa della variabilità intrinseca nell'espressione. Gli studi futuri includeranno animali falsità-azionati per garantire quel gene e cambiamenti di espressione di microRNA sono attribuiti a TBI e non a causa della preparazione chirurgica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
Figura 1. Flusso di lavoro di LCM Atlas-guida per l'analisi genomica a valle. (A-F) Procedure da animale preparazione all'analisi qPCR a valle: (A) adulto, maschi ratti Sprague Dawley (~ 6 settimane di età e peso 300 g) sono anestetizzati, sottoposti a percussione fluida TBI e umanamente eutanasizzati 24 h dopo la lesione. (B) sezioni di serie (30 µm) dei cervelli congelati freschi sono basate sulle coordinate delle regioni specifiche del cervello (FrA, AcbC, Hp, SCN) da Paxinos e di Watson The Rat Brain atlas. (C) sezioni sono fisse, macchiato di Nissl (1% Cresyl Violet), disidratati ed essiccato all'aria. (D). LCM eseguita su identificato regioni del cervello con un sistema di LCM. (E) LCM Macro tappi trasferito su un tubo di 0,5 mL RNAsi-libera con 100 μL di tampone di lisi cellulare e conservati a-80 ° c fino a isolamento del RNA per l'analisi genomica a valle. RNA può allora essere retrotrascritto per l'analisi di RT-qPCR gene o microRNA esaminare l'espressione differenziale di target molecolari dopo TBI e/o tra regioni del cervello di interesse (F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
Figura 2. LCM di TBI colpite regioni del cervello. Funzioni del sistema di LCM laser immagini rappresentative delle sezioni di tessuto raccolti dal lato ipsilateral del sito di lesione con IR e UV (A-I). Tessuto è stato sezionato un criostato (30 µm) e raccolti sulla penna membrana diapositive. Sezioni sono state poi fissi e Nissl-macchiato con la viola di cresyl (1%) e disidratato per identificare regioni specifiche del cervello basate su punti di riferimento anatomici a cui fa riferimento Paxinos e di Watson The Rat Brain Atlas. (A-C) Un'area della corteccia frontale associazione (FrA) (D-F) componenti degli strati piramidali CA1, CA2 e CA3 dell'ippocampo (Hp) situato vicino le corna completamente formate dello strato del granello di circonvoluzione dentata (GrDG). (G-I) Un'area del nucleo accumbens coRe (AcbC) prossimale e rostral al commissure anteriore (aca). (J-K) Nucleo soprachiasmatico (SCN) rostrale al chiasm Sopraottico (och). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
Figura 3. Rappresentante scansioni di qualità RNA. Rappresentante elettroferogrammi e gel associate immagini di RNA derivato da LCM raccolti del tessuto (A-D). Elettroferogrammi e gel associato immagini mostrano RNA intatto sulla comparsa di picchi di rRNA 18s e 28s e bande di gel di base. Questo RNA è adatto per tutte le applicazioni a valle, tra cui genomica e proteomica analisi. Corteccia di associazione frontale (A) (FrA) RNA. RIN 6.1. (B) ippocampo (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) nucleo accumbens del nucleo (AcbC) RNA. RIN 7.3. (D) Suprachiasmatic (SCN) nucleo RNA. RIN 7,6. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
Nella figura 4. Analisi a valle del Gene di regione-specifico del cervello e di espressione dei MicroRNA tramite RT-qPCR. RT-qPCR individuali per geni di interesse (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) e microRNA d'interesse (miR-15b) è stato effettuato su regioni del cervello laser catturato dopo TBI (Hp e AcbC n = 5, FrA n = 4) e confrontato agli animali di ingenuo illeso (n = 4). Analisi di geni correlati alla patogenesi TBI è stata eseguita per Hp, AcbC, FCx. dati viene presentato come un rapporto di cambiamento piega normalizzato rispetto alle regioni del cervello di ingenuo controllo (test t spaiato con correzione ± di Welch SEM; * p ≤ 0.05) (A). Espressione differenziale di miR-15b in differenti regioni del cervello si presenta come piega normalizzato modifiche rispetto al controllo ingenuo (± SEM) (B). Dati da SCN (n = 2) non inclusa. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Descriviamo l'uso di laser capture microdissection per ottenere campioni di popolazioni distinte delle cellule dalle regioni differenti del cervello per l'analisi del gene e microRNA. Questa tecnica permette lo studio di effetti differenziali del trauma cranico in regioni specifiche del cervello del ratto.

Atlas-guida stereotassica del Laser Capture Microdissection di regioni del cervello colpite da lesione traumatica

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

stereotactic-atlas-guided-laser-capture-microdissection-brain-regions

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.1K Views.  University of Texas Medical Branch. Descriviamo l'uso di laser capture microdissection per ottenere campioni di popolazioni distinte delle cellule dalle regioni differenti del cervello per l'analisi del gene e microRNA. Questa tecnica permette lo studio di effetti differenziali del trauma cranico in regioni specifiche del cervello del ratto.

Video: Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Ricerca

Neuroscienze

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell populations. To characterize proteome-level variation and tumor heterogeneity at scale, high-throughput methods are needed to selectively isolate discrete cellular populations in solid tumor malignancies. This protocol describes a high-throughput workflow, enabled by artificial intelligence (AI), that segments images of hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained, thin tissue sections into pathology-confirmed regions of interest for selective harvest of histology-resolved cell populations using laser microdissection (LMD). This strategy includes a novel algorithm enabling the transfer of regions denoting cell populations of interest, annotated using digital image software, directly to laser microscopes, thus enabling more facile collections. Successful implementation of this workflow was performed, demonstrating the utility of this harmonized method to selectively harvest tumor cell populations from the TME for quantitative, multiplexed proteomic analysis by high-resolution mass spectrometry. This strategy fully integrates with routine histopathology review, leveraging digital image analysis to support enrichment of cellular populations of interest and is fully generalizable, enabling harmonized harvests of cell populations from the TME for multiomic analyses.

This protocol describes a high-throughput workflow for artificial intelligence-driven segmentation of pathology-confirmed regions of interest from stained, thin tissue section images for enrichment of histology-resolved cell populations using laser microdissection. This strategy includes a novel algorithm enabling the transfer of demarcations denoting cell populations of interest directly to laser microscopes.

Microdissezione laser industrializzata guidata dall'intelligenza artificiale per l'analisi proteomica microscalata del microambiente tumorale

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Ricerca sul cancro

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Acuta cerebrale Trauma nei topi Seguito By longitudinale a due fotoni di imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Medicina

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Controllata corticale modello Impact per trauma cranico

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser nanochirurgia di cerebellari Assoni<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

Un metodo basati su Micro-CT per la caratterizzazione di lesioni e posizionamento elettrodi nel cervello degli animali piccoli

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) occlusion of the middle cerebral artery (MCA) using a catheter. This generally accepted technique, however, has some limitations, thereby limiting its extensive use. Stroke induction by this method is often characterized by high variability in the localization and size of the ischemic area, periodical occurrences of hemorrhage, and high death rates. Also, the successful completion of any of the transient or permanent procedures requires expertise and often lasts for about 30 minutes. In this protocol, a laser irradiation technique is presented that can serve as an alternative method for inducing and studying brain injury in rodent models.
When compared to rats in the control and MCAO groups, the brain injury by laser induction showed reduced variability in body temperature, infarct volume, brain edema, intracranial hemorrhage, and mortality. Furthermore, the use of a laser-induced injury caused damage to the brain tissues only in the motor cortex unlike in the MCAO experiments where destruction of both the motor cortex and striatal tissues is observed.
Findings from this investigation suggest that laser irradiation could serve as an alternative and effective technique for inducing brain injury in the motor cortex. The method also shortens the time for completing the procedure and does not require expert handlers.

The protocol presented here shows a technique to create a rodent model of brain injury. The method described here uses laser irradiation and targets motor cortex.

Lesione cerebrale indotta dal laser nella Corteccia Motoria dei Ratti

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, microvascular proliferation, mesenchymal transformation and necrosis characterize the histological heterogeneity of high-grade gliomas. Our laboratory has demonstrated that the presence of high densities of mesenchymal cells, named oncostreams, correlate with tumor malignancy. We have developed a unique approach to understand the mechanisms that underlie glioma&#39;s growth and invasion. Here, we describe a comprehensive protocol that utilizes laser capture microdissection (LMD) and RNA sequencing to analyze differential mRNA expression of intra-tumoral heterogeneous multicellular structures (i.e., mesenchymal areas or areas of tumor invasion). This method maintains good tissue histology and RNA integrity. Perfusion, freezing, embedding, sectioning, and staining were optimized to preserve morphology and obtain high-quality laser microdissection samples. The results indicate that perfusion of glioma bearing mice using 30% sucrose provides good morphology and RNA quality. In addition, staining tumor sections with 4% Cresyl violet and 0.5% eosin results in good nuclear and cellular staining, while preserving RNA integrity. The method described is sensitive and highly reproducible and it can be utilized to study tumor morphology in various tumor models. In summary, we describe a complete method to perform LMD that preserves morphology and RNA quality for sequencing to study the molecular features of heterogeneous multicellular structures within solid tumors.

Laser microdissection (LMD) is a sensitive and highly reproducible technique that can be used to uncover pathways that mediate glioma heterogeneity and invasion. Here, we describe an optimized protocol to isolate discrete areas from glioma tissue using laser LMD followed by transcriptomic analysis.

Microdissezione di cattura laser delle sottoregioni del Glioma per la caratterizzazione spaziale e molecolare dell'eterogeneità intratutuale, dell'Oncoflusso e dell'invasione

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Injection of Hydrogel Biomaterial Scaffolds to The Brain After Stroke

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes and are defined as the sudden blockage of a vessel supplying blood to the brain. Within minutes of the blockage, cells begin to die and result in irreparable tissue damage. Current therapeutic treatments focus on clot removal or lysis to allow for the reperfusion and prevent more severe brain damage. Although transient brain plasticity may salvage some of the damaged tissue over time, significant fractions of patients are left with neurological deficits that will never resolve. There is a lack of therapeutic options to treat neurological deficits caused by stroke, emphasizing the need to develop new strategies to treat this growing patient population. Injectable biomaterials are currently being designed to enhance brain plasticity and improve endogenous repair through the delivery of active agents or stem cells. One method to test these approaches is to utilize a rodent stroke model, inject the biomaterial into the stroke core, and assess repair. Knowing the precise location of the stroke core is imperative for the accurate treatment after stroke, therefore, a stroke model that results in a predictable stroke location is preferable to avoid the need for imaging prior to injection. The following protocol will cover how to induce a photothrombotic stroke, how to inject a hydrogel in a controlled and precise manner, and how to extract and cryosection the brain while keeping the biomaterial intact. In addition, we will highlight how these same hydrogel materials can be used for the co-delivery of stem cells. This protocol can be generalized to the use of other injectable biomaterials into the stroke core.

Stroke is a global issue with minimal treatment options and no current clinical therapy for regenerating the lost brain tissue. Here we describe methods for creating precise photothrombotic stroke in the motor cortex of rodents and subsequent injection of hydrogel biomaterials to study their effects on tissue regeneration after stroke.

Iniezione di scaffold di idrogel Biomateriale al cervello dopo l'ictus

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes ...

Biologia

Cryopreserved Tissue Section Fixation and Staining: A Procedure to Process Frozen Brain Tissue Sections for Laser Microdissection

Source: Comba, A. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60939/laser-capture-microdissection-glioma-subregions-for-spatial-molecular">Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video presents the fixation and staining method to process frozen mouse brain tumor tissue. The processed tissue helps differentiate and obtain a specific population of cells during subsequent laser capture microdissection.

Fissazione e colorazione di sezioni di tessuto crioconservate: una procedura per elaborare sezioni di tessuto cerebrale congelate per la microdissezione laser

Source: Comba, A. et al. Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, ...