Questo lavoro è stato effettuato con il supporto di una sovvenzione, 5R21HD080684-02, dal National Institute of Child Health and Human Development. L'autore desidera ringraziare Ken Cho per il suo continuo entusiasmo e sostegno. L'autore desidera inoltre ringraziare Bruce Blumberg per uso della sua macchina fotografica, Rebekah Charney, per la lettura critica del manoscritto e Sean McNamara e Marcin Wlizla presso la risorsa nazionale di Xenopus (RRID:SCR_013731), per le preziose conversazioni per quanto riguarda X. tropicalis alimentazione e regimi di cura degli animali.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di uso dell'Università di California, Irvine e istituzionali Animal Care.
1. preparati per il trapianto di PGC
<ol><li>Preparare strumenti di dissezione in anticipo, come descritto in precedenza23. Nota: Coltelli capelli sopracciglio vengono utilizzati per fare delle incisioni con l'assistenza di un ciclo di capelli per stabilizzare l'embrione durante gli interventi chirurgici. Peli delle sopracciglia e capelli cicli sono incollati in pipette Pasteur in vetro borosilicato che prima sono stati disegnati in una fiamma e rotti sulla parte assottigliata (Vedi Figura 1A, punta di freccia) per creare una punta più corta, più ristretto (Figura 1B) per una maggiore destrezza Quando si eseguono interventi chirurgici.</li>
	<li>Generare sgRNAs utilizzando le procedure precedentemente descritte24 . Nota: Brevemente, brevi modelli di DNA codificante per sgRNAs vengono creati utilizzando sovrapposti deoxyoligonucleotides contenente 5' promotori del batteriofago T7, che vengono ricotti e "riempito" di una DNA polimerasi termostabile, privo di errori. Reazioni di sintesi in vitro sgRNA vengono incubate per diverse ore a tutta la notte (a seconda del kit utilizzato). Le reazioni sono dnasi-trattata per rimuovere il modello. I sgRNAs sono purificati mediante le normali tecniche di estrazione e ammonio precipitazioni acetato/isopropanolo fenolo/cloroformio, secondo istruzioni24 del produttore kit.</li>
	<li>Poco prima di eseguire microiniezioni, preparare Cas9-sgRNA complessi di primo denaturante ~ 250 ng di sgRNA in un volume totale di 3 µ l di RNAsi-libera (Dietilpirocarbonato-trattati) H2O a 60-65 ° C per 5 min, seguita da un raffreddamento rapido in ghiaccio per 5 min. Centrifugare il sgRNA per pochi secondi, aggiungere 1 µ l di proteina di Cas9 1 µ g / µ l e incubare per 10 min a 37 ° C per promuovere la formazione del complesso. Nota: al termine dell'incubazione, il tubo può essere tenuto su ghiaccio durante la preparazione degli embrioni per il microinjection.</li>
	<li>Fecondazione in vitro usando i metodi standard, come descritto in precedenza25per ottenere embrioni X. tropicalis . De-gelatina25,26 gli embrioni fertilizzazione post-10 min. Nota: Tempo di fertilizzazione è considerato il tempo dopo la sospensione di sperma viene aggiunto alle uova e il piatto è invaso da 1/9thX Modified Ringers (MMR)26 di Marc. Per X. tropicalis25, a differenza di X. laevis, eseguire il de-gelatine in 1/9 x MMR che contiene 3% cisteina libera base (non il sale HCl), pH regolato a 7,8-8.0, seguito da diversi lavaggi in 1/9 x MMR. Trasferire gli embrioni per un'agarosi (1%)-piatto rivestito contenente 1/9 x MMR a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire immediatamente gli embrioni deve essere iniettato per un piatto di rivestite su agarosio 1% contenente 1 x MMR utilizzando una pipetta Pasteur.</li>
	<li>
Iniettare nella fase 1-cell. Vedere riferimenti26,27 per una descrizione dettagliata dei metodi di microiniezione di Xenopus .
	<ol>
<li>Iniettare ogni embrione in un unico sito nel polo animale, con 4 nL del complesso Cas9-sgRNA (importo finale = 1 ng di Cas9 e ~ 250 pg di sgRNA; si veda la discussione)24. Dopo 10-20 min di iniezione sito guarigione, trasferire gli embrioni per un piatto rivestite su agarosio contenente 1/9 x MMR e incubare a 25 ° C. Anche creare un piatto di pari livello uninjected embrioni che serviranno come destinatari dell'innesto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare piastre di Petri (60 mm) che contengono un ~ 5 mm-spessa strato di agarosio all'1% fatto in 0.3 x MMR, se facendo trapianti in X. tropicalis, o 1 x MMR per X. laevis.
	<ol>
<li>Creare depressioni ~ 3-4 mm profondità inserendo un 3-x 4 pozzetti muffa (creato dal taglio di una piastra PCR a 96 pozzetti) nell'agarosio fuso quando si versa le piastre (vedere Figura 1 e D). Tenere lo stampo parecchi millimetri sopra il fondo del piatto Petri utilizzando un morsetto fissato ad un anello in fino a quando l'agarosio ha indurito.</li>
		<li>Inoltre, fare una piastra a 24 pozzetti agli embrioni singoli casa rivestendo i pozzetti con un sottile strato di agarosio all'1% fatto in 1/9 x MMR. Nota: Il terreno di coltura aggiunto a questi pozzi è 1/9 x che MMR completati con 50 µ g di gentamicina solfato/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. trapianto di PGC
<ol><li>Quando gli embrioni raggiungono solo Nieuwkoop and Faber28 blastula fase 9 (Figura 2A), ~4.5 h post-fertilizzazione (hpf) per X. tropicalis, rimuoverli dall'incubatrice 25 ° C e consentire loro di stabilizzare a temperatura ambiente per un ulteriore 0,5 h.</li>
	<li>Per iniziare il trapianto a 5 hpf (Figura 2B), utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire un embrione donatore PGC (iniettato con Cas9-sgRNA) per il piatto di agarosio 60 mm contenente depressioni (create nel passaggio 1.7) in 0.3 x MMR (o 1 x MMR se si utilizza X. laevis). Anche trasferire un embrione di pari livello uninjected, destinatario dell'innesto, per questo piatto. Nota: È fondamentale che le identità di ciascuno di questi embrioni non sono confusi.</li>
	<li>Manualmente rimuovere le buste vitellina da ogni embrione usando il forcipe e ruotare entrambi gli embrioni, in modo che i loro pali vegetal sono in vista e accessibile per la chirurgia. Nota: Una descrizione del manuale de-vitellination di embrioni precedentemente è stato descritto26.</li>
	<li>Utilizzando la punta tagliente di un coltello di capelli sopracciglio, fare quattro incisioni poco profonde a forma di un quadrato sul palo vegetal dell'embrione destinatario, all'interno della zona dove si formerà futuri bottiglia cellule che segnano il blastoporo. Rendere le incisioni inserendo la punta del coltello capelli sopracciglio in embrione, appena sotto la superficie e fanno affettare verso l'alto movimenti mentre stabilizzando l'embrione con il ciclo dei capelli. Nota: La figura 2 Mostra vegetal visualizzazioni di un embrione a intervalli di mezz'ora da 4.5-7.0 hpf per mostrare le dimensioni della cella e di fornire una guida per la stima di cui le cellule di bottiglie formeranno (cerchio con tratteggio bianco). L'obiettivo è quello di fare delle incisioni dove la scatola nera tratteggiata è indicata.</li>
	<li>Una volta che i quattro lati della piazza sono delineati dalle incisioni, approfondire ogni incisione con il coltello di capelli sopracciglio usando simili movimenti di taglio per raggiungere una profondità di circa 1/3 a 1/2 della distanza al piano Blastocele.</li>
	<li>Gratis l'espianto di tessuto vegetale dall'embrione destinatario (Figura 3A e B) facendo un'orizzontale (parallela alla superficie vegetale) cut(s) nella regione profonda vegetale. Nota: La dimensione del explant vegetali contenenti PGC è circa 0,4-0.45 mm per lato e 0.25-0.3 mm di profondità. Questo vegetale espianto dell'embrione destinatario non è più necessario e pertanto dovrebbe essere accantonata per essere scartato.</li>
	<li>Lavorare rapidamente, ripetere questa procedura (procedura 2.4-2.6) sull'embrione donatore PGC per creare un frammento di tessuto vegetale dimensioni simili per trapianto. Nota: È importante effettuare questa seconda dissezione con poco ritardo per ridurre al minimo il tempo per l'embrione destinatario guarire la sua ferita aperta.</li>
	<li>Una volta che il tessuto contenente PGC è rimosso dall'embrione donatore, è possibile utilizzare il ciclo di capelli sopracciglio coltello e capelli per spostare questo espianto in posizione nell'apertura creata nell'embrione destinatario. Nota: La superficie interna dell'innesto erogatore deve essere rivolto verso l'interno dell'embrione destinatario. Non è necessario abbinare gli orientamenti degli assi dorso-ventrale e sinistra-destra dell'innesto con l'embrione destinatario.</li>
	<li>Utilizzare il lato lungo dell'albero del coltello capelli sopracciglio, tenuto parallelo alla superficie dell'innesto, premere delicatamente l'innesto nell'apertura la superficie vegetale dell'embrione destinatario.</li>
	<li>Una volta che l'innesto è stato inserito, è possibile utilizzare un hairloop o l'albero di un coltello di capelli sopracciglio per scivolare delicatamente la "carcassa" dell'embrione donatore su tutta la superficie di agarosio e in una depressione di agarosio. Assicurarsi che la ferita aperta della carcassa è rivolto il liquido di massa. In caso contrario, utilizzare il coltello di capelli sopracciglio per ruotare l'embrione per ottenere questo orientamento.</li>
	<li>Far scorrere l'embrione destinatario, con l'innesto di guarigione nel posto, in una depressione adiacente e similarmente assicurarsi che il tessuto innestato vegetal palo sia rivolto verso il liquido di massa.</li>
	<li>Ripetere questa procedura (procedura 2.1-2.11) utilizzando un altro paio di donatore e destinatari embrioni per creare un'altra coppia di trapianto/carcassa; trasferire questi alle depressioni vuote. Nota: È fondamentale che uno fa notazioni per tenere traccia delle coppie corrispondenti di carcasse e di trapianto-cuscinetto embrioni. Le carcasse di donatore verranno utilizzate come un proxy per l'efficienza di mutagenesi indotta da Cas9-sgRNA nel PGC trapiantato, che non può essere analizzato facilmente fino a quando gli animali di trapianto-cuscinetto raggiungono la maturità sessuale (vedi passo 3.3, sotto e la discussione ).</li>
	<li>Continuare a fare i trapianti gli embrioni fino a Stadio di gastrula circa precoce 10, che è di circa 6,5 hpf in X. tropicalis (Vedi Figura 2E).</li>
</ol>3. post-guarigione cura di embrioni
Nota: Gli innesti guariscono in posto all'interno di ~ 30 min, ed è normale osservare alcuni detriti yolky da lisi cellulare che trasuda dall'embrione (Figura 3).
<ol><li>
Una volta guarito, è possibile utilizzare una pipetta Pasteur per molto delicatamente trasferimento embrioni dalle depressioni per singoli pozzetti di una piastra di 24 pozzetti rivestite su agarosio. L'essudato sarà rimosso (figura 3D) di liquido di miscelazione durante il trasferimento.
	<ol>
<li>Ruotare gli embrioni in modo che vengono inseriti vegetali poli fino, rivolto verso la soluzione di massa. Ancora una volta, posizionare le carcasse del donatore e dell'innesto di destinatari in pozzetti adiacenti per aiutare a tenere traccia delle coppie di embrione; registrare queste informazioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire la piastra 24 pozzetti contenenti embrioni per un incubatore di 25 ° C per la coltura durante la notte. Nota: Il giorno successivo, gli embrioni hanno raggiunto fasi tailbud.</li>
	<li>Spostare i destinatari dell'innesto per pulire piastre di 6 pozzetti rivestite su agarosio contenente x 1/9 che MMR completati con 50 µ g di gentamicina solfato/mL, con 1 embrione per pozzetto. Mantenere un record chiaro delle carcasse di donatore che corrispondono a questi destinatari del trapianto.</li>
	<li>Per valutare l'efficienza di mutagenesi sequenziamento PCR ampliconi5,17,24 o utilizzando altri metodi che si basano su ampliconi PCR (Vedi la discussione), è possibile spostare singole carcasse per provette da 0,2 mL PCR striscia. Rimuovere la maggior parte del mezzo e omogeneizzare in 100 µ l di tampone Lisi24 contenente proteinasi K (PK) da ripetuti altalenante pipettaggio utilizzando una pipetta P200.</li>
	<li>Eseguire embrione Lisi24 a 56 ° C per 6 h a tutta la notte per consentire la digestione PK. Inattivare PK riscaldandolo a 90-95 ° C per 10 min, seguito da un rapido raffreddamento a 4 ° C. Utilizzare lisati senza ulteriori operazioni di disinfezione per le reazioni di PCR per ottenere brevi sequenze amplificate per diretto di sequenziamento Sanger DNA24del seme. Memorizzare i lisati a-20 ° C. Nota: All'interno di diversi giorni, i girini raggiungeranno fasi di alimentazione (circa 45-46 di fase) e possono essere alimentati una sospensione di polvere planctonica (sieri Micron).</li>
	<li>Dopo ~ 1 settimana, con variazioni giornaliere di terreno di coltura per mantenere la pulizia e ridurre al minimo la crescita eccessiva batterica, è necessario spostare girini in piccoli serbatoi in un sistema di ricircolo acquatico con flusso gocciolare. Utilizzare i dati di sequenziamento per segregare i girini con altamente efficiente mutagenized PGC da girini con minore efficienza di mutagenesi. Una volta completata la metamorfosi, spostare le ranocchiette adulto sistema acquatico in laboratorio. Nota: Regimi sviluppati dalla risorsa nazionale di Xenopus (Marine Biology Laboratory, Woods Hole, MA) forniscono una guida per girino alimentazione29 e adulto rana manutenzione30.</li>
</ol>

<ol>
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L'autore non ha nulla di divulgare.

Questo rapporto fornisce un protocollo dettagliato per il trapianto del tessuto vegetale contenente PGC. trapianto di PGC viene utilizzato in combinazione con tecnologie di editing genomico (ad es., CRISPR/Cas9) per modificare la linea germinale di un animale mentre mantenendo quasi tutti i suoi tessuti somatici come geneticamente wild-type. Per la rincorsa per avere successo, ci sono un numero di fattori critici da considerare prima di eseguire trapianti performanti.
Per garantire la...

Come genotipo Codifichi il fenotipo è stata una domanda importante nella biologia dato che la riscoperta delle leggi di Mendel. Una comprensione dei ruoli dei geni, la loro regolazione e interazioni all'interno di reti geniche e le funzioni delle promesse di prodotti codificati per fornire strumenti per scoprire nuova biologia e miglioramento degli Stati di malattia. Per oltre mezzo secolo1, la Rana artigliata africana, Xenopus, è stato un modello di punta per gli studi su una vasta gamma di argomenti in biologia di base e la biomedicina, compreso il controllo genetico dello sviluppo. Storicamente, la maggior parte della ricerca su Xenopus ha utilizzato la rana allotetraploide, X. laevis, ma più recentemente, a causa della sua diploidia, X. tropicalis è stato sviluppato come un modello genetico di anfibio. Sequenze di genoma completo sono stati assemblati da entrambi Xenopus specie2,3. La "comunità di rana" è ora a un punto di svolta dove tecnologia modifica base genoma permette lo studio della funzione genica, praticamente a volontà. Programmabile CRISPR/Cas9 endonucleasi hanno reso la mutagenesi di geni altamente efficiente, con mutazione biallelica possibile nella maggior parte delle cellule di animali4,5,6,7, 8,9,10,11. Questi studi, sottolineati dalla Bhattacharya et al. 12 e Shigeta et al. 13, hanno dimostrato che la funzione di molti geni possa essere studiata mediante mutagenesi in animali di mosaico0 F. Questo approccio ha molti vantaggi; Tuttavia, gli embrioni Cas9-sgRNA-microiniettati visualizzano spesso fenotipi variabili a causa di incompleta perdita di funzione (LOF). Più significativamente, la generazione di linee mutanti è estremamente vantaggiosa per alcune applicazioni — in particolare quando lo studio di geni che hanno un contributo di mRNA materno. Materna mRNA e proteine e le loro influenze su epigenetica, persistono per un periodo prolungato nell'embriogenesi14,15,16, rendendo i primi contributi inerenti allo sviluppo di molti geni refrattario alle analisi0 F. Pertanto, sono necessari altri approcci LOF.
Quando si cerca di creare linee mutanti, il percorso per ottenere embrioni LOF omozigotici ha diversi ostacoli. Mutagenesi in primo luogo, efficiente per produrre mutazioni bialleliche può essere svantaggiosa perché perdita delle funzioni dei geni essenziali esito negativo per sopravvivere alla maturità sessuale, interferendo con la produzione di una linea vitale. Una soluzione comune è la titolazione attenta della quantità di Cas9-sgRNA consegnato. Qui, l'obiettivo è raggiungere un equilibrio tra la riduzione di mortalità anche massimizzando l'efficienza di mutagenesi di germline. Un secondo problema nasce dallo schema standard di allevamento, dove analisi fenotipiche vengono posticipate fino alla generazione2 F. Utilizzando l'approccio standard, sessualmente maturi animali0 F che trasmettono mutante alleli attraverso la linea germinale sono esogamico per produrre F1 "eterozigoti", che poi sono cresciute alla maturità sessuale. Due heterozygotes di1 F sono poi incrociate per produrre embrioni mutanti di F2 a una frequenza di Mendelian prevista del 25%. Due generazioni di allevamento sono quindi necessari per l'analisi dei fenotipi mutanti. Animali mutanti potrebbero essere omozigoti o eterozigoti composti (cioè, progenie contenente due alleli differenti del mutante, che dipende i genotipi di animali parentali utilizzati per il re di1 F).
Questi ostacoli possono essere superati da confinare programmabile mutagenesi nucleasi-mediata delle cellule di germe, che è alla base di un nuovo metodo denominato rincorsa17. Rincorsa ha due componenti principali: (1) la microiniezione di mRNA Cas insieme sgRNA o nucleasi-sgRNA complessi (o, in linea di principio, TALENs o zinco nucleasi a dita) allo stadio unicellulare da mutagenizzare efficientemente genoma embrionale, seguito da (2) il trapianto di PGC negli embrioni di pari livello wildtype, dove sono stati rimossi il PGC endogeno. Quando entrambi i passaggi sono la sostituzione di germline efficiente, completo con le cellule germinali mutante può essere ottenuta. Blackler dimostrata nei primi anni 1960 che Xenopus PGC potrebbe essere trapiantati tra embrioni alla neurula ritardato e presto tailbud fasi18,19. Per salto, approccio di Blackler modifica eseguendo i trapianti blastula fase17, quando PGC sono localizzati nel palo vegetal del embrione20,21. Il trapianto prima gastrulazione ha due vantaggi principali. In primo luogo, l'attecchimento di trapianti e il successivo sviluppo normale è stato trovato per essere più efficiente quando il trapianto viene effettuato nella fase di blastula (osservazioni non pubblicate). In secondo luogo, eseguendo trapianti blastula-fase poco dopo trascrizione zygotic è iniziata, si può evitare la letalità derivanti dal gene inerente allo sviluppo mutazioni che interrompono la gastrulazione o che altrimenti portano a neurulae fine non valido. PGC trapianto-cuscinetto ("scavalcati") gli embrioni sono cresciuti alla maturità sessuale, e intercrosses tra questi animali0 F hanno dimostrato che, in molti casi, il 100% della prole F1 Visualizza il fenotipo LOF (la maggior parte essendo composto eterozigoti), che indica di germline completa sostituzione con le mutazioni mirate.
Si prevede che la rincorsa accelererà approcci genetici in Xenopus. Anche scavalcando fornisce un'alternativa al metodo "ospitare trasferimento"22 per l'analisi LOF di geni effetto materno (osservazioni non pubblicate). Nella pubblicazione corrente, una descrizione dettagliata del metodo, concentrandosi soprattutto sul trapianto di PGC, è presentata in X. tropicalis (con modifiche minori per X. laevis). Il trapianto di PGC è dimostrato qui per facilitare un più rapido trasferimento di questa tecnologia ad altri laboratori lavorando con Xenopus. I principi di questo metodo dovrebbero essere successo in altri anfibi (ad es., urodeli), e le modifiche di organismo-specific nella metodologia dovrebbero consentire per applicazione a molti altri animali in cui è possibile mutagenesi efficiente e PGC sono prontamente transplantable.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20 or 11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Eyebrow hair knife</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>KG581</td><td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td></tr><tr><td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom ordered</td><td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion/ThermoFisher</td><td>AM1334</td><td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td></tr><tr><td>Phenol, Tris buffered</td><td></td><td></td><td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td></td><td></td><td>High quality chloroform from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>High quality ethanol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td><td>PNA Bio, Inc.</td><td>CP01</td><td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>10X Marc&#039;s Modified Ringers solution</td><td></td><td></td><td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td></tr><tr><td>60 X15 mm Petri plates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Falcon</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>C7352-100G</td><td>Free base, not HCl salt</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03 115 828 001</td><td>Typically ~20mg/ml from Roche</td></tr><tr><td>sera Micron</td><td>sera</td><td></td><td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td></tr></tbody></table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

La creazione di linee mutanti di editing genomico sta accelerando l'analisi genetica in molti organismi. Metodi CRISPR/Cas9 sono stati adattati per uso in Rana artigliata africana, Xenopus, un organismo di modello di vecchia data per la ricerca biomedica. Sistemi di allevamento tradizionali per la creazione di linee mutanti omozigoti con mutagenesi CRISPR/Cas9-mirate hanno diversi passaggi che richiede tempo e laboriosi. Per facilitare la creazione di embrioni mutanti, in particolare per superare gli ostacoli associati buttando giù geni che sono essenziali per l'embriogenesi, è stato sviluppato un nuovo metodo chiamato rincorsa. Questa tecnica sfrutta la robustezza degli embrioni di Xenopus di "taglia e incolla" Metodi embriologiche. Rincorsa utilizza il trasferimento di cellule primordiali germinali (PGC) da embrioni donati mutagenizzato efficientemente in fratelli germani PGC-ablazione wildtype. Questo metodo permette l'efficiente mutazione di geni essenziali creando animali chimerici con cellule somatiche wildtype che trasportano una mutante di germline. Quando due animali di0 F che trasportano "leapfrog trapianti" (cioè, mutante cellule germinali) sono incrociate, producono composti o omozigoti, eterozigoti, null F1 embrioni, risparmiando così un tempo di generazione completo per ottenere dati fenotipici. Rincorsa fornisce anche un nuovo approccio per l'analisi dei geni di effetto materno, che sono refrattari ad analisi fenotipica di F0 dopo mutagenesi CRISPR/Cas9. Questo manoscritto descrive in dettaglio il metodo di rincorsa, con speciale enfasi su come effettuare con successo il trapianto di PGC.

A seguito di trapianto, la determinazione qualitativa dell'efficacia di mutagenesi CRISPR/Cas9 deve essere eseguita prima di spendere lo sforzo in zootecnia per crescere e mantenere gli animali alla maturità sessuale. Poiché gli animali che trasportano leapfrog trapianti sono somaticamente wildtype e germinale è di difficile accesso per misure dirette, salvando le carcasse degli embrioni donati diventa importante. L'analisi del DNA dalle carcasse funge da proxy per il limite di mutagen...

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Geni essenziali per la sopravvivenza pongono ostacoli tecnici per la creazione di linee mutanti. Rincorsa aggira la letalità combinando genoma editing con trapianto di cellule germinali primordiali per creare animali portatori di mutazioni di germline. Rincorsa consente anche la generazione efficiente di omozigoti mutanti nella generazione1 F. Qui, il passo di trapianto è dimostrato.

Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K Views.  University of California, Irvine. Geni essenziali per la sopravvivenza pongono ostacoli tecnici per la creazione di linee mutanti. Rincorsa aggira la letalità combinando genoma editing con trapianto di cellule germinali primordiali per creare animali portatori di mutazioni di germline. Rincorsa consente anche la generazione efficiente di omozigoti mutanti nella generazione1 F. Qui, il passo di trapianto è dimostrato.

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipolazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturazione di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovociti, seguito da Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, per studiare lo sviluppo embrionale

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Clonazione funzionale utilizzando un<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Genetica

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

Generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso l'innesto embrionale

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biologia

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Produzione di transgenici Xenopus laevis Integrazione mediata da enzima di restrizione e trapianto nucleare

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

Applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

Riepilogo

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Manipolazione e

Cellule staminali simil-

Clonazione funzionale utilizzando un