The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne H&#233;l&#232;ne Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

Gli esperimenti sono conformi alle normativa nazionale ed europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e con i principi sanciti a livello internazionale di sostituzione, riduzione e perfezionamento. 1. Flat-montaggio Xenopus laevis Girini anteriore del tubo neurale Dopo tutto il montaggio ibridazione in situ <ol><li> Ottenere X. laevis embrioni secondo le procedure standard 4 e invecchiare fino a raggiungere neurula palco 26 e più anziani (secondo Nieuwkoop e Faber tavolo di sviluppo 17. </li><li> Fix X. laevis tadpoles incubandoli in una soluzione di 4% paraformaldeide (PFA). Rock and ruotare gli embrioni in un flaconcino di vetro da 2 ml, 1 a 1,5 ore a temperatura ambiente per la fase 26 di mettere in scena 38 embrioni, 2 ore a temperatura ambiente per gli embrioni in fasi successive. ATTENZIONE: PFA è tossico per contatto e un sospetto cancerogeno. Dovrebbe essere manipolato sotto cappa. NOTA: X One laevis nidiata èdi solito fissato in un flaconcino di vetro da 2 ml, ma un grande fiala di vetro può essere utilizzato. </li><li> Lavare gli embrioni nella stessa fiala utilizzando 1x PBS con 0,1% di Tween (PBT), 3 minuti a temperatura ambiente, due volte. NOTA: Se non altrimenti specificato la PBS usato è con o senza calcio e magnesio. </li><li> Disidratare embrioni in 100% di metanolo (MeOH) per almeno 12 ore a RT nello stesso flaconcino. Modificare il MeOH 100% almeno due volte sotto il cofano con una micropipetta plastica. NOTA: Il MeOH assume una colorazione giallastra come lipidi in essa disciolti. Attenzione il MeOH è tossico per inalazione e deve essere manipolato sotto una cappa. </li><li> Reidratare gli embrioni utilizzando la stessa flaconcino attraverso una serie graduata di bagni MeOH: MeOH 75% in PBS MeOH 50% in PBS MeOH 25% in PBS PBS due volte, ogni vasca 5-10 min a RT. Le soluzioni MeOH vengono modificate sotto il cofano con una micropipetta di plastica. </li><li> Usando una pipetta di plastica, trasferire l&#39;embrione deve essere sezionato in una piastra di Petri 60 millimetri riempito al top con PBT. Utilizzando due pinza sottile curarimuovere completamente gli occhi inserendo una pinza sottile tra gli occhi e il tubo neurale, a livello del gambo ottica. Staccare gli occhi dal tubo neurale. Introdurre con attenzione le pinze sotto l&#39;ectoderma sovrastanti il ​​tubo neurale. Con cura, staccare l&#39;ectoderma partendo da dietro la testa e gettarlo. </li><li> Eseguire un ISH doppia o singola con digossigenina-etichettati o sonde fluoresceina come descritto in precedenza 18,19. </li><li> Dopo la ISH trasferire gli embrioni in una nuova 60 mm piatto Petri riempito l&#39;alto con PBT con una pipetta di plastica. </li><li> Utilizzando una pinza sottile staccare con cura il tubo neurale dal resto dell&#39;embrione. In questa fase, il tubo neurale anteriore separa dal tubo posteriore neurale. Staccare con cautela restanti parti del ectoderma sovrastanti il ​​tubo neurale, la notocorda che è vagamente collegato al di sotto del tubo neurale, le vescicole otic e restanti parti del mesoderma. Assicurarsi che il tubo neurale è privo di appendiciin questa fase. NOTA: per evitare di danneggiare il tubo neurale eseguire tutte neurali trasferimento tubo / embrione con una pipetta di trasferimento di plastica o una micropipetta, se necessario, con un taglio punta alla sua estremità. Il diametro della punta fine è adeguata alle dimensioni del tubo neurale. </li><li> Trasferire il tubo neurale sezionato (vedi nota passo 1.9) in una provetta da 1,5 ml piena di glicerolo al 50% diluito in PBS. Attendere i tubi neurali sono caduti al fondo della soluzione di glicerolo, di solito O / N a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione di glicerolo al 50% / PBS usando una micropipetta P1000 e aggiungere nello stesso tubo 1,5 ml di una soluzione di 90% glicerolo / PBS usando una micropipetta P1000. Attendere i tubi neurali cadono sul fondo della soluzione 90% glicerolo / PBS, solitamente O / N a 4 ° C. NOTA: per l&#39;archiviazione a lungo termine, di utilizzare il 90% di glicerolo / PBS più antibiotici per prevenire lo sviluppo di batteri. </li><li> Trasferire i tubi neurali su una lastra di vetro o un vetrino da microscopio con una pipetta di plastica trasferimento. </li><li> Dissetta i tubi neurali lungo la dorsale e ventrale linee mediane utilizzando aghi di tungsteno. Durante questo passo i tubi neurali sono mantenute in 90% glicerolo / PBS. </li><li> Montare le due lati del tubo neurale in 90% glicerolo / PBS utilizzando anelli di rinforzo coperto con vetrino coprioggetti. </li><li> Fissare i coprioggetti con vernici e tenere a 4 ° C. </li></ol> 2. Cap Animal Espianti induzione utilizzando biglie scambio di anioni resina <ol><li> Trasferire 100 ml di perle di resina a scambio anionico in una provetta da 2 ml con una micropipetta P1000. Lavare le perline almeno cinque volte consecutive con acqua distillata sterile. Lasciare le perline per sedimentare sul fondo del tubo e sostituire l&#39;acqua distillata sterile utilizzando una micropipetta P1000. Non toccare le perline. </li><li> Lasciare le perline ammollo O / N in una provetta 2 ml riempita con acqua distillata sterile con Bovine Serum Albumin (BSA) (10 mg / ml) a 4 ° C. </li><li> Due ore prima di raccogliere l&#39;ACS, luogo la metà delle perline in un nuovo 1,5 mltubo con una micropipetta P1000. Sostituire l&#39;acqua distillata sterile con 500 ml di mezzo contenente la molecola da testare per il suo potenziale induttivo, o noti per indurre un destino specifico. Mantenere l&#39;altra metà delle perline, in quanto saranno utilizzati come controllo negativo. </li><li> Incubare le perle a 4 ° C per almeno 2 ore. </li><li> Eseguire tutte le fasi successive allo stereomicroscopio ed eseguire tutti i trasferimenti di CA con una micropipetta. </li><li> Trasferire blastula o embrioni molto precoci gastrula in PBS con calcio e magnesio integrato con 0,2% di BSA con una pipetta di trasferimento di plastica. NOTA: Gli embrioni in via di sviluppo in C portata blastula e gastrula fasi 12 ° in 20-24 ore. </li><li> Rimuovere membrana vitellina dell&#39;embrione con pinze come descritto in precedenza 20. Fissare l&#39;embrione con una pinza. Pizzicare la membrana vitellina con il lato delle pinze altri. Tenendo la membrana, lentamente staccarlo l&#39;embrione. Eseguire questa procedura sul ventrale (vegetale) lato dell&#39;embrione. Non danneggiare il lato animale dell&#39;embrione. </li><li> Isolare piccoli AC come descritto in precedenza 21. Il polo animale è parte pigmentata dell&#39;embrione. Utilizzando una pinza sottile tagliato un piccolo quadrato di tessuto dal polo animale. Il tessuto AC contiene solo le cellule ectodermiche. Assicurarsi che il tessuto è di spessore uniforme. In caso contrario, rimuovere la AC dall&#39;analisi. </li><li> Mettete ogni AC in Terasaki piastre a pozzetti multipli a 0.5x modificate di Barth Saline (MBS) 4. Posizionare il AC nel pozzo con il lato pigmentata dell&#39;animale, a contatto con il fondo rotondo del pozzo. NOTA: pipette di rivestimento con una soluzione di BSA 0,1% impedisce l&#39;adesione di piccoli pezzi di tessuto adesivo alla plastica. </li><li> Mettere una sferetta su ogni tappo con un P20 micropipetta. Se necessario, utilizzare pinze per posizionare accuratamente il tallone al centro del tappo. NOTA: quando imbevuta di un mezzo condizionato, le perle sono colorati in rosa. Selezionare il maggior numero di coperline lored. </li><li> Incubare a temperatura ambiente (da 18 a 22 ° C) per 6 ore senza spostare la piastra Terasaki pozzetti. Il tallone attacca alla corrente alternata in meno di 2 ore. </li><li> Posizionare la piastra pozzetti Terasaki sulla cima di documenti imbevuto di acqua. Coprire la piastra con un contenitore di plastica. NOTA: Questo &#39;camera di umidita&#39; impedisce l&#39;evaporazione prematura dei pozzetti. </li><li> Cultura l&#39;ACS a 0,5x MBS o 3/4 NAM (vedere il punto 4.1) nella camera umida, a 15-20 ° C fino a quando gli embrioni di pari livello hanno raggiunto la fase giusta per testare l&#39;effetto del fattore. </li><li> Fissare la AC per 1 ora in preparati al momento 4% PFA. Disidratare il ACs in 100% MeOH come precedentemente descritto (Passo 1.4). </li></ol> 3. Cap Animal Dissociazione cellulare e riaggregazione Prima Innesto in Xenopus laevis neurula <ol><li> Piatti petri Coat (60 mm) o 12 pozzetti piastre con 3% agarosio in acqua sterile o in PBS senza calcio e magnesio. Aggiungi abbastanza agarosio per coprire la bottom della capsula di Petri e il bene. Pre-riscaldare le piastre a RT (18-22 ° C). Facoltativamente, memorizzate le piastre per due giorni a 4 ° C per evitare la disidratazione. </li><li> Preparare senza calcio salina di Holtfreter (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 4.6 mM HEPES, 0,1% di BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)), e soluzione salina di Holtfreter (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mm HEPES, 0,1% BSA pH 7.6) 5. NOTA: la soluzione di CaCl 2 non può essere autoclavata. </li><li> Riempire il agarosio rivestite bene verso l&#39;alto con soluzione salina priva di calcio di Holtfreter. </li><li> Preparare blastula o embrioni molto precoci gastrula per isolare i loro ACs come descritto in precedenza (punti 2,5-2,7). </li><li> Isolare almeno 15 o fino a 30, 21 piccolo ACs. Utilizzando una pinza sottile tagliato un piccolo quadrato di tessuto dal polo animale. Il tessuto AC contiene solo celle ectodermiche ed è quindi di spessore uniforme. In caso contrario, rimuovere la AC dall&#39;analisi. NOTA: Il polo animale è il Embryparte pigmentata di o. </li><li> Trasferire l&#39;ACS in un agarosio rivestite ben riempito al top con soluzione fisiologica di Holtfreter senza calcio. Posizionare l&#39;ACS con il loro lato pigmentata rivolto verso l&#39;alto. NOTA: Il processo di dissociazione inizia rapidamente in soluzione salina di Holtfreter senza calcio. </li><li> Attendere qualche minuto per le cellule per iniziare dissociare. Osservare questo attraverso disaggregazione dei tessuti. Utilizzando una pinza sottile, separare lo strato pigmentato dal resto della AC e gettarli con un P20 micropipetta. Completa processo di dissociazione cella indica la separazione delle cellule tra loro. NOTA: Uno o due strati pigmentati possono essere lasciati alla espianto ri-aggregati per aiutare la visualizzazione durante l&#39;innesto. </li><li> Centrare le cellule utilizzando movimenti circolari della piastra. Usando una micropipetta p1000 rimuovere accuratamente quanto mezzo possibile. Fare attenzione a non toccare le cellule. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione fisiologica di Holtfreter con calcio al pozzo. Trasferire l&#39;ACS dissociatein una provetta da 1,5 ml. NOTA: 2 ml tubi non possono essere utilizzati a causa della loro fondo rotondo. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione, 5 min ad una velocità massima di 2.000 giri al minuto per una centrifuga da banco (500 xg). Rimuovere con attenzione il surnatante con una micropipetta P1000. </li><li> Aggiungi alle cellule dissociate 20 ml di soluzione fisiologica di Holtfreter con il calcio (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4.6 mM HEPES, 0,1% di BSA (A-7888 Sigma pH 7,6) 5. </li><li> Mantenere il dissociato ACs, da 3 a 6 ore a temperatura ambiente (18-22 ° C). NOTA: È tempo necessario per le cellule di ri-aggregazione. La riaggregazione è visibile come le cellule formano una pallina sul fondo della provetta. </li><li> Staccare con cautela l&#39;espianto dal fondo della provetta con l&#39;aggiunta di 1 ml di 0,5x MBS o da 1 ml di 3/4 NAM (vedi punto 4.1). Trasferire l&#39;espianto in un piatto non-rivestita con una pipetta di plastica trasferimento. </li><li> Fase espianti che utilizzano i loro fratelli di controllo. Per uso a lungo termine cultura antibiotici: kanamycin (50 ug / ml), ampicillina (50 ug / ml) e gentamicina (50 mg / ml). </li></ol> 4. Accrescimento di animali Caps Espianti nella placca neurale di X. laevis Embrione <ol><li> Preparare 3/4 NAM (110 mM NaCl, KCl 2 mm, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 NaHCO mm 3, 0.2x PBS, 50 mg / ml di gentamicina). Non tenere per più di 1 settimana per la dissezione e conservare a 4 ° C. NAM più vecchio può essere utilizzato per la preparazione di piatti dissezione agarosio rivestite (sotto). </li><li> Piatti cappotto di Petri (60 mm), con il 3% agarosio in 3/4 NAM in cui piccoli fori sono stati realizzati utilizzando uno stampo in silicone, o la copertura di una racchetta da ping-pong. NOTA: L&#39;agarosio copre il fondo della capsula di Petri. Lasciare un po &#39;di spazio in modo che la capsula di Petri da riempire con 3/4 NAM. In alternativa, fare piatti dissezione con i non-essiccazione modellazione creta. All&#39;interno l&#39;argilla, spremere gli embrioni leggermente durante la procedura di dissezione. Scavare piccoli fori nellaagarosio usando pinze arrotondate Questo &#39;piatto dissezione&#39; aiuta a tenere gli embrioni durante la procedura di dissezione. </li><li> Raccogliere strumenti di dissezione: pipette di plastica, un &#39;coltello sopracciglio&#39; (realizzato con i capelli sopracciglio inclusi in paraffina sulla punta di una pipetta Pasteur di vetro) 22, due pinze dissezione fine, P1000 micropipetta e suggerimenti, un stereosmicroscope con ingrandimento 8-40X, una fonte di luce brillante con guide in fibra ottica. Tenere tutti gli strumenti di dissezione pulito; dopo ogni esperimento, sciacquare due volte con acqua distillata, una volta con 100% di etanolo e lasciare asciugare. Conservare lontano da polvere e, se necessario, gli strumenti di dissezione in autoclave metallo. </li><li> Lasciate che la ri-aggregato AC (protocollo 3), e loro fratelli dissociato e X. embrioni laevis sviluppano fino a raggiungere stadio 13 (neurula) secondo Nieuwkoop e Faber tavolo di sviluppo 17. Per il trapianto all&#39;interno della fase piastra neurale 13 per mettere in scena 15 embrioni vengono utilizzati. </li><li> Effettuare tuttofasi successive allo stereomicroscopio. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento di plastica, di trasferire gli embrioni in PBS con calcio e magnesio integrato con 0,2% di BSA. Rimuovere membrana vitellina dell&#39;embrione come descritto in precedenza 20. Fissare l&#39;embrione con una pinza. Pizzicare la membrana vitellina con il lato delle pinze altri. Tenendo saldamente la membrana, lentamente staccarlo l&#39;embrione. NOTA: Effettuare questa procedura sul ventrale (vegetale) lato dell&#39;embrione. Non danneggiare gli embrioni piastra neurale. Se gli embrioni sono stati danneggiati durante la rimozione fase di membrana vitellina, di trasferire gli embrioni in una capsula di Petri 60 millimetri contenente 3/4 NAM con un trasferimento pipetta di plastica e attendere 15 minuti, un tempo sufficiente per il processo di guarigione a verificarsi. </li><li> Compila il piatto dissezione verso l&#39;alto con fresco 3/4 NAM. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento di plastica, di trasferire gli embrioni senza la loro membrana vitellina nel piatto dissezione. Mettere gli embrioni lato dorsale fino ini pozzi. Durante il processo di trasferimento non consentono l&#39;embrione di entrare in contatto con l&#39;interfaccia aria-liquido dal X. laevis sono lisati dalla tensione superficiale. </li><li> Trasferire il espianto AC da innestare nel piatto dissezione con una pipetta di trasferimento di plastica o una micropipetta P1000. Una volta che la pipetta è all&#39;interno del liquido, consentire gli espianti di affondare lentamente per gravità, o spingere molto delicatamente. </li><li> Mantenere gli embrioni con pinza arrotondati. Con il coltello sopracciglio fare un&#39;incisione nella piastra neurale in cui si intende innestare pezzo del vostro espianto. NOTA: Nella fase 14 la piegatura anteriore della piastra neurale può essere utilizzato come punto di riferimento, segna il territorio diencefalo (Figura 4). </li><li> Tagliare un piccolo pezzo di neuroepitelio, con pinze arrotondate e un coltello sopracciglio. Tagliare un piccolo pezzo di espianto con il coltello sopracciglio. NOTA: Il pezzo di espianto dovrebbe essere circa la stessa dimensione e forma come la zona ablato neuroepitelio. </li&gt; <li> Posizionare il pezzo di espianto nell&#39;incisione neuroepitelio utilizzando il coltello sopracciglio e una pinza sottile. Assicurarsi che l&#39;espianto si attacca rapidamente per l&#39;embrione. </li><li> In alternativa, inserire un pezzo di vetro coprioggetto sul embrione innestato di mantenere l&#39;innesto in posizione. Per fare questo, tagliare un bel vetrino di vetro in pezzi molto piccoli con pinze grossolani. Assicurarsi che la dimensione è di circa 1,5 mm 2. Immergere i pezzi in una capsula di Petri contenente 3/4 NAM o PBS con pinze. Scegliere un pezzo di vetro più grande della embrione per evitare di danneggiarlo. L&#39;embrione sarà un po &#39;appiattito. </li><li> Attendere almeno 30 minuti senza muoversi, o spostare solo il piatto dissezione delicatamente. Lasciate che l&#39;embrione recuperare per 30 minuti a 2 ore e rimuovere delicatamente il vetrino, se necessario. Pipetta con attenzione gli embrioni innestati in un piatto pulito pieno di 3/4 NAM, utilizzando la pipetta plastica. NOTA: Innestata embrioni tendono a sviluppare batteri o funghi contaminazione. A lungo termine culture utilizzare antibiotici: kanamicina (50 ug / ml), ampicillina (50 ug / ml) e gentamicina (50 mg / ml). </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+the+Vitelline+Membrane+from+Xenopus+laevis+Embryos.">Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Cap+Isolation+from+Xenopus+laevis.">Animal Cap Isolation from Xenopus laevis.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Early+Steps+in+the+Development+of+the+Forebrain.">Review: Early Steps in the Development of the Forebrain.</a> Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+neural+plate:+new+roles+for+apoptosis+and+for+one+of+its+main+effectors+caspase-3.">Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3.</a> Genesis. 53, 203-224 (2015).</li><li>Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+early+Xenopus+embryo.">Patterning the early Xenopus embryo.</a> Development. 133, 1205-1217 (2006).</li><li>Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+vertebrate+forebrain:+the+prosomeric+model.">The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model.</a> Science. 266, 578-580 (1994).</li><li>Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+gene+expression+domains+and+the+evolving+prosomeric+model.">Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model.</a> Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).</li><li>Martinez-Ferre, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regionalization+of+the+diencephalon.">Molecular regionalization of the diencephalon.</a> Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).</li><li>Scholpp, S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Building+a+bridal+chamber:+development+of+the+thalamus.">Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus.</a> Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).</li><li>Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xotch,+the+Xenopus+homolog+of+Drosophila+notch.">Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch.</a> Science. 249, 1438-1441 (1990).</li><li>Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+signals,+gradient+formation+and+regional+specificity+in+neural+induction.">Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction.</a> Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).</li><li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction:+old+problem,+new+findings,+yet+more+questions.">Neural induction: old problem, new findings, yet more questions.</a> Development. 132, 2007-2021 (2005).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barhl2+limits+growth+of+the+diencephalic+primordium+through+Caspase3+inhibition+of+beta-catenin+activation.">Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+and+Reaggregation+of+Xenopus+laevis+Animal+Caps.">Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+research:+metamorphosed+by+genetics+and+genomics.">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li><li>Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+logic+of+gene+regulatory+networks+in+early+vertebrate+forebrain+patterning.">The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning.</a> Mech Dev. 130, 95-111 (2013).</li><li>Pani, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+deuterostome+origins+of+vertebrate+brain+signalling+centres.">Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres.</a> Nature. 483, 289-294 (2012).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+bilaterian+central+nervous+systems:+a+single+origin?.">Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?.</a> Evodevo. 4, 27 (2013).</li><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease models &amp; mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).</li><li>Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+gap+from+frog+research+to+human+therapy:+a+tale+of+neural+differentiation+in+Xenopus+animal+caps+and+human+pluripotent+cells.">Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells.</a> Development, growth &amp; differentiation. 50, s47-s55 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Sviluppo neurale è orchestrata da una complessa interazione tra programmi di sviluppo cellulari e segnali dai tessuti circostanti (Recensito a 3,31,32). Qui si descrive un set di protocolli che possono essere utilizzati in X. laevis embrioni per esplorare fattori estrinseci ed intrinseci coinvolti nella determinazione destino neurale e la morfogenesi neuronale in vitro e in vivo. Questi protocolli possono essere usati come tali X. embrioni tropicalis, tut...

Il sistema nervoso vertebrato emerge dalla piastra neurale come uno strato omogeneo di cellule neuroepiteliali. Comprendere come sono indotte programmi di sviluppo, codificati, e stabilito durante la regionalizzazione della piastra neurale è, allo stato attuale, un obiettivo importante nella biologia dello sviluppo. Rispetto ad altri sistemi, il sperimentalmente suscettibili di Xenopus embrioni è un modello di riferimento per analizzare i primi passi di sviluppo neurale 1,2. E &#39;facile ottenere un gran numero di embrioni, e sviluppo esterno dà accesso ai primi passi della neurulazione 3. Molti strumenti sono a disposizione per manipolare sperimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) lo sviluppo embrionale. Micro-iniezione di mRNA o Morpholinos (MO), tra MO inducibile, insieme agli strumenti biochimiche e farmacologiche, permette di guadagno di funzione (GOF) e perdita di funzione (OL) e determinata alterazione delle vie di segnalazione 4,5 controllato. Il blastocoel tetto ectoderma, situato attorno al polo animale di un blastula, o gastrula embrione molto precoce, e denominato &#39;Cap Animal&#39; (AC), è una fonte di cellule pluripotenti che può essere programmato da manipolazione genica prima espianti preparazione. In questo manoscritto sono protocolli dettagliati per usare X. espianti laevis AC per testare in vitro e in vivo dei meccanismi molecolari e dei processi cellulari di sviluppo neurale sottostante. Una tecnica è presentata, permettendo l&#39;osservazione multa di modelli di espressione genica in un tubo neurale girino Xenopus, un passo preliminare per l&#39;identificazione di segnali determinazione destino. Considerando che l&#39;osservazione di tessuti piatto montato è comunemente usato nello studio di embrioni di pollo 6, non è stato correttamente descritto in Xenopus. La manipolazione dell&#39;espressione genica mediante iniezione di mRNA sintetico o MO nei blastomeri di 2 o 4 embrioni stadio cella permette la programmazione di ACespianti 4. Per esempio l&#39;inibizione della proteina morfogenetica (BMP) percorso dalla espressione del movimento anti-BMP fattore Noggin, dà un&#39;identità neurale per celle AC 3. Il protocollo è dettagliata per eseguire esposizione locale e comandato a tempo di espianti AC ai segnali estrinseci tramite contatto diretto con una perlina di resina scambiatrice di anioni. Finalmente una tecnica è descritta per testare le caratteristiche di sviluppo delle progenitori neurali in vivo per il trapianto di espianti miste preparate da cellule distinte programmato dissociate e ri-associati. L&#39;embrione rana è un potente modello per lo studio precoce sviluppo neurale dei vertebrati. Combinando la manipolazione dell&#39;espressione genica di espianto colture in vitro fornisce importanti informazioni per lo studio di neuroepitelio regionalizzazione, la proliferazione e morfogenesi 7-12. La programmazione di espianti AC consentito lo sviluppo di un cuore funzionale ex vivo 13,14. L&#39;usodi espianto innesto 15 ha portato all&#39;individuazione dello switch trascrizionale minimo indurre il programma di differenziazione cresta neurale 16. Il limitans zona per intrathalamica (ZLI) è un centro di segnalazione che secerne sonic hedgehog (Shh) per controllare la crescita e la regionalizzazione del prosencefalo caudale. Quando continuamente esposto a Shh, le cellule neuroepiteliali coexpressing il fattore geni tre trascrizione - Barh-like homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (Otx2) e Iroquois-3 (irx3) - acquistano due caratteristiche del vano ZLI: la competenza a esprimere shh, e la capacità di separare dalle cellule anteriore piastra neurale. Come un sistema modello, l&#39;induzione di un destino ZLI in cellule neuroepiteliali verrà presentato 8. Questi protocolli mirano a fornire semplici, a basso costo, e strumenti efficienti per i biologi dello sviluppo e altri ricercatori per esplorare il mec fondamentalehanisms di comportamenti chiave delle cellule neurali. Tali protocolli sono molto versatili e permettono la ricerca di una vasta gamma di segnali neurali determinazione estrinseci ed intrinseci. Esso consente a lungo termine in analisi in vivo di impegno lignaggio neurale, interazioni induttive e comportamenti delle cellule.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;20909.290</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>anion exchange resin beads</td><td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>For culture of animal cappH 7.6</td></tr><tr><td>Gentamycine&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&amp;nbsp;</td><td>antibiotic</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&amp;nbsp;for bead preparation</td></tr></tbody></table>

stem cell-like xenopus embryonic explants to study early neural developmental features in vitro and in vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Sulla base di considerazioni morfologiche in specie diverse, manipolazioni embriologici, e il pattern di espressione di geni regolatori, un modello concettuale che sostiene la piastra neurale è diviso in segmenti trasversali e longitudinali che definiscono una griglia sviluppo generare campi histogenic distinte. Nel placca neurale, la primordi del prosencefalo, mesencefalo, rombencefalo e del midollo spinale sono tutti già stabilito lungo l&#39;asse antero-posteriore (AP) durante la ga...

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Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

7.9K Views.  Institut Curie. In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. 

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Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Neuroscienze

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Culture Explant neurali di<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biologia

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

Proteomica della spettrometria di massa guidata da livrea cellulare nell'embrione in via di sviluppo (rana)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Chimica

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Generazione di espianti di blastoderma naïve da embrioni di zebrafish

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

La valutazione primaria neurogenesi in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrioni Utilizzando Immunocolorazione

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Espianti blastomero al test per l&#39;Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Cellule staminali simil-

Riepilogo

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