Name: patterning bioactive proteins or peptides on hydrogel using photochemistry for biological applications
Uploaded: 2017-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
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Questo studio è stato sostenuto principalmente da sovvenzioni dalla American Heart Association scienziato sviluppo concessione (12SDG12050083 alla GD), il National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 alla GD) e della National Science Foundation (CBET-1263455 e CBET-1350240 alla GD).

1. preparazione dei materiali per la sintesi dell'idrogelo <ol><li>preparare soluzioni di riserva di PEGDA, litio fenil-2, 4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) e fibronectina in condizioni sterili e basato su calcoli (tabella 1A).
	<ol><li>Pesare e sciogliere composti in tampone fosfato salino (PBS). In genere, mantenere PEGDA lavorando le concentrazioni di soluzione tra 50 e 200 mg/mL (5-20% peso/volume). Dispensare la soluzione PEGDA attraverso un filtro da 0,22 µm a siringa per la sterilizzazione. 
		Nota: Mantenere le soluzioni PEGDA coperte con un foglio di avvolgimento per proteggerli dalla luce. Preparare una soluzione fresca di PEGDA (consigliato) per ogni esperimento.</li>
		Polvere di <li>ricostituire fibronectina proteina basata sul produttore &#39; s raccomandazione. Mantenere la soluzione di riserva di fibronectina a 1 mg/mL, aliquotare e in aliquote di 60 a 100 µ l e conservarli a-20 ° C fino all'utilizzo. Scongelare le aliquote a 4 ° C per diverse ore o durante la notte prima dell'uso. Se Stock in proteine non viene già fornita in condizioni sterili, utilizzare un filtro per siringa da 0,22 µm per la sterilizzazione. 
		Nota: Fibronectina è utilizzata per il collegamento delle cellule. Altre proteine ECM possono essere sostituito con.</li>
		<li>Pesare LAP per la soluzione di riserva e dissolverlo in PBS; una tipica concentrazione stock è 25 mg/mL. Sonicare se c'è qualche problema con dissoluzione. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 µm per la sterilizzazione. Percorrere il giro con un involucro di stagnola e conservarlo a 4 ° C per fino a parecchi mesi. 
		Nota: LAP è il fotoiniziatore utilizzato per la fotochimica.</li>
	</ol></li> <li>Preparare stampi diapositiva vetro sterile per formazione di idrogel.
	<ol><li>Autoclave un poliestere foglio; uno è necessario per ogni stampo di gel. Immergere due lastre di vetro e tre distanziali in plastica (0,5 mm di spessore) per ogni stampo di gel in etanolo al 70% per almeno 2 ore, ma generalmente di lasciarli in ammollo durante la notte. Ammollo cinque clip legante per ogni stampo di gel in etanolo al 70% per 10 minuti prima dell'uso.</li>
		<li>Posizionare i vetrini, distanziali e raccoglitore Clip su un piccolo foglio sterilizzato nell'autoclave della cappa di cultura cellulare per consentire loro di aria secca per diverse ore.</li>
		<li>Preparazione stampi di idrogel inserendo distanziali in plastica intorno al bordo del vetrino. Posizionare la seconda diapositiva di vetro sulla parte superiore. Fissare i distanziali strettamente uno accanto a altro con clip legante, due su ogni lato lungo e quello in alto. 
		Nota: Se questo non è montato correttamente, la soluzione di gel colerà.</li>
		<li>Superficie-sterilizzare lo stampo con coltura cellulare cappa luce UV per 30 min prima dell'uso. A metà strada attraverso, capovolgere lo stampo per esporre entrambe le superfici.</li>
	</ol></li></ol> 2. Modificare le proteine con un tiolo gratis <ol><li>preparare soluzioni di riserva utilizzando calcoli dal foglio di calcolo per la conversione dell'ammina in tiolo sulle proteine (tabella 1A).
	<ol><li>a fare il tampone di reazione, regolare il PBS a pH 8 e aggiungere 5 mM EDTA. Tampone di reazione della pipetta in un filtro per siringa da 0,22 µm per la sterilizzazione. 
		Nota: EDTA è importante, in quanto protegge i tioli da formando legami bisolfurico. Gruppi tiolici devono rimanere nella loro forma ridotta per la reazione avvenga.</li>
		<li>Pesare 2-Iminotiolano (Traut &#39; s reagente) e dissolverlo in tampone di reazione per una concentrazione di soluzione stock di 2 mg/mL (14 mM). Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 µm a siringa per la sterilizzazione. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C per fino a parecchi mesi. 
		Nota: 2-Iminotiolano è la molecola che reagisce con le ammine gratis esposte al solvente sulle proteine e li converte in tioli liberi.</li>
		<li>Ricostituire la proteina nel tampone di reazione ad una concentrazione compresa tra 0,1 e 1 mg/mL. A meno che precedentemente sterile, pipettare questa soluzione attraverso un filtro da 0,22 µm a siringa per la sterilizzazione. 
		Nota: Questa proteina è il segnale biochimico che verrà essere modellato sulla superficie di idrogel. Inoltre, mentre le concentrazioni di proteina possono variare, concentrazioni più elevate sono ideali per più forte pattern proteico.</li>
	</ol></li> <li>Reagire la proteina con 2-Iminotiolano mescolando insieme entrambe le soluzioni stock; utilizzare tabella 1B per calcolare il rapporto di volume corretto. In genere, utilizza un rapporto molare di 8:1 2-Iminotiolano alla proteina. 
	Nota: Per i più grandi proteine o più diluire le concentrazioni, utilizzare un rapporto molare superiore di 2-Iminotiolano. Consultare il produttore &#39; s protocollo 15.</li>
	<li>Incubare la reazione per 1 h a temperatura ambiente. Utilizzare una dissalazione spin micro-colonna per rimuovere il prodotto della proteina chitosani da reagenti restanti, seguendo il produttore &#39; s protocollo 16. 
	Nota: Il limite di esclusione di questa resina è 5 KDa.</li>
	<li>Uso Ellman &#39; s saggio misurare quantitativamente il numero dei tioli liberi per proteina. Seguire il produttore &#39; protocollo di s per il dosaggio 17.</li>
</ol> 3. Formazione di idrogel <ol><li>Crea la soluzione del precursore di gel basata su valori calcolati da tabella 1. Mescolare insieme la PEGDA, fibronectina e volumi LAP. Dispensare la soluzione vigorosamente per garantire una soluzione omogenea, ma evitare la creazione di bolle. Mantenere la soluzione al riparo dalla luce.</li>
	<li>Dispensare la soluzione di gel precursore attentamente tra i due vetrini dello stampo gel. In genere, aggiungere un volume tra 800 e 1.000 µ l allo stampo. Esporre la soluzione di gel nello stampo a luce UV (lunghezza d'onda: 365 nm, potenza: 3-4 mW/cm 2) per 1-2 min formare l'idrogel. 
	Nota: Non esporre l'idrogel a luce UV prolungata, come si limiterà la proteina di superficie patterning funzionalità.</li>
	<li>Togliere la clip legante e rimuovere delicatamente il vetrino superiore applicando pressione di fronte ai distanziali due lato.</li>
	<li>Utilizzare un pugno di dimensioni appropriate biopsia per tagliare fuori i campioni di idrogel. Punch out più idrogeli dal rettangolo di gel per servire come repliche e campioni di controllo.</li>
</ol> 4. Misure di rigidezza di idrogel punch di biopsia <ol><li>Punch out idrogel con un 8 mm di diametro per un reometro di piatti paralleli di 8 mm. Caricare un idrogel campione in reometro (Vedi la Tabella materiali).</li>
	<li>Inferiore la geometria di piatti paralleli che è 8 mm di diametro fino a fare contatto con la superficie del gel. Mantenere una distanza di 0,5 mm per un campione di 0,5 mm di spessore idrogel.</li>
	<li>Spazza tempo eseguire per 5 min a sforzo di 0,1%, 0,1 Hz frequenza e 37 ° C. Media il G &#39; valori attraverso ogni passaggio di tempo. Esecuzione indipendente idrogel per repliche di ogni composizione. 
	Nota: Il G &#39; valori dovrebbero essere stabili attraverso punti di tempo; Se non sono, per cento colare e sweep di frequenza deve essere eseguita per selezionare l'appropriato i valori 14.</li>
</ol> 5. Patterning di proteina <ol><li>preparare il modello desiderato per il photomask utilizzando un programma di computer-aided design (CAD). Stampare il photomask su un foglio trasparente utilizzando una stampante ad alta risoluzione. Immergere il photomask in etanolo al 70% per 10 minuti prima dell'uso. Strato di fotoresist per aria, lasciare asciugare in una cappa di cultura cellulare prima dell'uso.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di proteina chitosani preparata nel passaggio 2 per la superficie dell'idrogel per superficie patterning. Pipettare 1-2 µ l/cm 2 di soluzione proteica chitosani alla superficie di ogni ritaglio gel. 
	Nota: È importante per ridurre al minimo il volume della proteina; aggiungere solo sufficiente a coprire uniformemente tutta la superficie del campione idrogel.</li>
	<li>Posizionare con attenzione il photomask sulla superficie dell'idrogel. Non lasciare bolle d'aria tra la fotomaschera e la superficie di idrogel. Premere delicatamente la maschera per rimuovere tutte le bolle che si formano.</li>
	<li>Esporre l'idrogel a un secondo turno di luce UV (lunghezza d'onda: 365 nm, potenza: 3-4 mW/cm 2) per 30-60 s. 
	Nota: È importante l'esposizione il pattern a abbastanza luce UV per creare un modello forte senza causare la perdita di funzione della proteina.</li>
	<li>Lavare l'idrogel con PBS per rimuovere specie non reagito e posizionare ogni idrogel all'interno della placca ben. Fare attenzione quando si inseriscono i gel in ciascun pozzetto; Assicurarsi che la superficie modellata sia rivolto verso. Lavare il gel in PBS a 4 ° C; i gel sono stabili per almeno due settimane a 4 ° C.</li>
</ol> 6. Preparazione di idrogeli per la semina delle cellule <ol><li>Incubare i gel in sostanza basale per 5-10 min a 37 ° C prima della semina. Per cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs), utilizzare EGM-2 medium senza fattori di crescita. Ridurre al minimo il volume del mezzo aggiunto a ciascun bene per prevenire idrogel galleggianti. Per una piastra a 48 pozzetti, utilizzare un volume di 250 µ l di terreno.</li>
	<li>Spin giù la piastra a 300 x g per 3 min garantire che nel caso degli idrogeli è situati nella parte inferiore del pozzo e non è galleggianti. Eseguire questa operazione immediatamente prima della semina delle cellule.</li>
</ol> 7. Seeding in idrogel di cella <ol><li>uso standard cellula di mammiferi sterile cultura procedure per la semina delle cellule e procedure sperimentali. Rimuovere HUVECs da boccette di coltura del tessuto utilizzando protocolli standard delle cellule distacco. Lavare il piatto di coltura del tessuto con PBS sterile e incubare con tripsina per 3-5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Placare la sospensione delle cellule tripsinizzate con soluzione di neutralizzatore di medie o tripsina in eccesso delle cellule.</li>
	<li>Rotazione verso il basso la sospensione cellulare nella centrifuga a 300 x g per 5 min. con attenzione rimuovere il supernatante e tenere il pellet cellulare.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in basale EGM-2 senza fattori di crescita. Utilizzare un emocitometro per conta cellulare.</li>
	<li>Aggiungere 75.000 cellule/cm 2 per ogni idrogel superficie pipettando lentamente al centro di ogni bene per non disturbare i gel. Posizionare la piastra ben in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C. Per diversi giorni, periodicamente, rimuovere il piatto per osservazione.</li>
</ol> 8. Valutazione di bioattività <ol><li>cultura, Escherichia coli, pernottamento in sospensione in libbra di brodo in una sospensione orbitale a 37 ° C e 200 giri/min. Rotazione verso il basso la cultura di e. coli, decantare e ricostituire il pellet cellulare in volume minimo di PBS. Pesare il lisozima e ricostituire a 1 mg/mL per la soluzione di riserva.</li>
	<li>Pipettare un piccolo volume (25 µ l) di soluzione di riserva di lisozima in microcentrifuga. Aggiungere livelli di variazione di LAP fotoiniziatore (0-12 mM) ed esporre i campioni a 1 min di luce UV. In un gruppo separato, aggiungere la stessa quantità di LAP (2 mM) alla soluzione di lisozima ed esporre i campioni a diversi tempi di luce UV (0-4 min). Sono repliche per ogni trattamento.</li>
	Soluzione di <li>Aggiungi uguale volume di concentrato e. coli per ciascun campione di lisozima per una concentrazione di proteina di lisozima finale di 0,5 mg/mL. Incubare le soluzioni miste per 4 h a temperatura ambiente. 
	Nota: In questo modo tempo per lisozima funzionale lisare la parete cellulare batterica e rilasciare proteine nella soluzione.</li>
	<li>Utilizzare incubato con e. coli per un controllo positivo non trattata di lisozima; considera questo una misurazione bioattivi di 100%. Utilizzare la soluzione di lisozima incubati con PBS da solo come controllo negativo.</li>
	<li>Spin giù i campioni per rimuovere i detriti cellulari e mantenere il supernatante. Eseguire un'analisi di Bradford per quantificare la concentrazione totale di proteina all'interno il surnatante per misurare la quantità di lisato batterico.</li>
	<li>Eseguire un'analisi di Bradford seguendo il produttore &#39; s protocollo 18. Calcolare la piega cambiamento nella concentrazione di proteina rispetto al controllo negativo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-effects+of+matrix+low+elasticity+and+aligned+topography+on+stem+cell+neurogenic+differentiation+and+rapid+neurite+outgrowth.">Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth.</a> Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).</li><li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells.">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).</li><li>Ye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Stiffness+and+Nanoscale+Spatial+Organization+of+Cell-Adhesive+Ligands+Direct+Stem+Cell+Fate.">Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate.</a> Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li><li>Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+tethered+TGF-beta1+with+encapsulated+chondrocytes+in+a+PEG+hydrogel+system+enhances+extracellular+matrix+production.">Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production.</a> J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).</li><li>Salinas, C. N., Anseth, K. 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J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+rheological+characterization+of+hydrogels+for+tissue+engineering+strategies.">A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).</li><li>Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Desalting Columns. GE Life Sciences Available from: <a target="_blank" href="https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf">https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf</a> (2017)</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo fornisce un metodo per la creazione di modelli di proteine bioattive per applicazioni biologiche. Ci sono diverse modifiche che possono essere fatte per adattare questo protocollo per diversi esperimenti. In primo luogo, requisiti di collegamento cella varierà per diversi tipi di cellule. Se inizialmente si osserva un collegamento scadente delle cellule per i gel, aumentando la concentrazione della proteina all'interno della soluzione di precursore ECM è consigliato. Altre proteine ECM possono essere ...

Ci sono molti stimoli che influenzano il comportamento delle cellule. In generale, tecniche di coltura tipica cellula si basano su fattori solubili di suscitare risposte cellulari; Tuttavia, ci sono limitazioni di questo approccio. Questi metodi sono in grado di visualizzare con precisione tutti i motivi di segnalazione comunemente trovati in vivo. Tali meccanismi di segnalazione includono sequestrati fattori di crescita, segnalazione della cellula-cellula e spazialmente specifici segnali biochimici. Inoltre, rigidità del substrato può giocare un ruolo importante nel differenziamento delle cellule staminali e comportamento cellulare e non è facilmente manipolata utilizzando comuni pratiche coltura cellulare1,2. Biomateriale approcci offrono una nuova piattaforma per cominciare ad esplorare questi meccanismi di segnalazione. In particolare, idrogeli sono candidati eccellenti per ottimizzazione substrato rigidità3,4, immobilizzante proteine e peptidi5,6e la creazione di modelli spazialmente specifici7, 8.
Idrogeli sono comunemente usati come impalcature in ingegneria tissutale a causa loro commonalities biofisica e biochimica con la matrice extracellulare (ECM)9,10. Polimeri naturali sono scelte comuni per ponteggi, in quanto sono biocompatibili e si trovano in molti tessuti del corpo. La limitazione dell'utilizzo di polimeri naturali come substrati è che mancano moiety chimica facilmente manipolabile per bioconjugation. D'altra parte, idrogel sintetico, in quanto tale come PEG, sono eccellenti piattaforme per prodotti chimici mirati per11,12. Inoltre, idrogeli PEG non suscitare una risposta cellulare e pertanto vengono utilizzati come backbone di inerte per la creazione di strutture bioattive.
Per creare idrogeli bioattivi, fotopolimerizzazione sia del tiolo-ene scegliere chimica reazioni sono impiegate. Questi FOTOREAZIONI richiedono un fotoiniziatore e una sorgente di luce UV. Quando fotoiniziatori vengono introdotti ai raggi UV, obbligazioni rompono per formare i radicali. Tesi i radicali sono necessari per avviare la reazione ma possono influire negativamente sulle proteine bioattività12,13. Di conseguenza, è fondamentale ottimizzare fotoiniziatore e tempi di esposizione UV per mantenere la bioattività di proteina.
In questo metodo, idrogeli sono sintetizzati attraverso acrilato-acrilato catena crescita fotopolimerizzazione. PEG-Diacrilato (PEGDA) monomeri reagiscono con a vicenda per formare reti di polimero ramificato responsabile della struttura dell'idrogel. La concentrazione dei monomeri PEGDA all'interno della soluzione di precursore di gel controllerà la rigidità del substrato. Dovuto la piccola dimensione dell'idrogel dei pori, proteine ECM come fibronectina possono essere facilmente incorporate all'interno di idrogel ai fini del collegamento delle cellule. Infine, questi idrogeli possono essere a superficie-fantasia con peptidi bioattivi o proteine via tiolo-ene clicca chimica reazioni. Qui, acrilati non reagiti gratuiti all'interno del sistema di idrogel reagirà con tioli gratuiti situati sulla proteina o peptide quando esposto a luce UV. Dopo le proteine o peptidi sono immobilizzati sulla superficie dell'idrogelo, l'idrogel possono essere memorizzati a 4 ° C per diverse settimane senza perdere la bioattività. Questo offre convenienza, flessibile pianificazione sperimentale e la possibilità di collaborazione tra i laboratori. Nel complesso, questa piattaforma permette di controllo biochimico biomeccanico e spaziale, indipendente uno da altro, per l'opportunità di influenzare il comportamento cellulare.

<table><tbody><tr><td>PEG-diacrylate (PEGDA)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-3400</td><td>Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used.</td></tr><tr><td>Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td><td></td><td></td><td>Synthesized in lab</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Photomask</td><td>FineLine Imaging</td><td>n/a</td><td>Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI.</td></tr><tr><td>Binder Clips</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compact UV Light Source (365nm)</td><td>UVP</td><td>UVP-21</td><td>Other UV light sources can be used, calibration of power is required.</td></tr><tr><td>2-iminothiolane (Pierce Traut&amp;rsquo;s Reagent)</td><td>Thermo Sci.</td><td>26101</td><td></td></tr><tr><td>Ellman&amp;rsquo;s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)</td><td>Thermo Sci.</td><td>22582</td><td></td></tr><tr><td>human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td></td><td>passage number between 6- 10</td></tr><tr><td>EGM-2 Media</td><td>Lonza</td><td>CC31-56, CC-3162</td><td>EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin EDTA</td><td>Life Tech</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizer</td><td>Life Tech</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Various Venders</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Sci. Bright-line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>0.22&amp;micro;m filter</td><td>Cell Treat</td><td>229743</td><td></td></tr><tr><td>1mL Syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Microscope Slides</td><td>Fisher Sci.</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spacers</td><td>Various Venders</td><td></td><td>0.5mm thickness</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>BICCA</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>Bio-shield</td><td>Bio-shield</td><td>19-150-0010</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desalting Resin - Sephadex G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>95016-754</td><td></td></tr><tr><td>Microspin Columns</td><td>Thermo Sci.</td><td>PI69725</td><td></td></tr><tr><td>AR-G2 rehometer</td><td>TA Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

patterning bioactive proteins or peptides on hydrogel using photochemistry for biological applications

Ci sono molti stimoli biologici che possono influenzare la differenziazione delle cellule staminali e comportamento delle cellule. Cellulari generali cultura approcci si basano su fattori solubili all'interno del mezzo per controllare il comportamento delle cellule. Tuttavia, aggiunte solubile non possono simulare alcuni motivi, come fattori di crescita associati a matrice di segnalazione, segnalazione della cellula-cellula e spaziale segnali biochimici, che sono comuni influenze sulle cellule. Inoltre, le proprietà biofisiche della matrice, come ad esempio la rigidità del substrato, svolgono i ruoli importanti nel destino della cellula, che non è facilmente manipolata utilizzando pratiche di coltura convenzionale della cella. In questo metodo, descriviamo un protocollo semplice per fornire proteine bioattive modellati su idrogel sintetico in polietilene glicole (spina) utilizzando fotochimica. Questa piattaforma permette il controllo indipendente della rigidità del substrato e spaziale segnali biochimici. Questi idrogeli possono realizzare una vasta gamma di valori di rigidità fisiologicamente rilevanti. Inoltre, le superfici di questi idrogeli possono essere photopatterned con peptidi bioattivi o proteine via tiolo-ene clicca chimica reazioni. Questi metodi sono stati ottimizzati per conservare la funzione della proteina dopo immobilizzazione superficiale. Si tratta di un protocollo versatile che può essere applicato a qualsiasi proteina o peptide di interesse per creare una varietà di modelli. Infine, cellule seminate sulle superfici di questi idrogeli bioattivi possono essere monitorate nel tempo come rispondono ai segnali nello spazio specifici.

Il protocollo per creare modelli bioattivi sulla superficie di idrogeli di PEG è illustrato nella Figura 1. Un foglio di calcolo è stato sviluppato per calcolare il volume e la concentrazione per ogni soluzione di riserva (tabella 1A). Proteine per essere immobilizzati sulla superficie dell'idrogel vengono modificate con 2-Iminotiolano (Figura 1B). Questa reazione viene eseguita utilizzando i v...

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Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

In questo metodo, usiamo fotopolimerizzazione e tecniche di chimica clicca per creare modelli di proteina o peptide sulla superficie di idrogeli di polietilenglicole (PEG), fornendo immobilizzata bioattivi segnali per lo studio delle risposte cellulari in vitro .

Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K Views.  Rensselaer Polytechnic Institute. In questo metodo, usiamo fotopolimerizzazione e tecniche di chimica clicca per creare modelli di proteina o peptide sulla superficie di idrogeli di polietilenglicole (PEG), fornendo immobilizzata bioattivi segnali per lo studio delle risposte cellulari in vitro .

Video: Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Ricerca

Bioingegneria

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large variety of PEG molecular weights and configurations (arm number, arm length, and branching pattern) affords researchers tight control over resulting hydrogel structures and properties, including Young&#8217;s modulus and mesh size. This video will illustrate a rapid, efficient, solvent-free, microwave-assisted method to methacrylate PEG precursors into poly(ethylene glycol) dimethacrylate (PEGDM). This synthetic method provides much-needed starting materials for applications in drug delivery and regenerative medicine. The demonstrated method is superior to traditional methacrylation methods as it is significantly faster and simpler, as well as more economical and environmentally friendly, using smaller amounts of reagents and solvents. We will also demonstrate an adaptation of this technique for on-resin methacrylamide functionalization of peptides. This on-resin method allows the N-terminus of peptides to be functionalized with methacrylamide groups prior to deprotection and cleavage from resin. This allows for selective addition of methacrylamide groups to the N-termini of the peptides while amino acids with reactive side groups (e.g.&#160;primary amine of lysine, primary alcohol of serine, secondary alcohols of threonine, and phenol of tyrosine) remain protected, preventing functionalization at multiple sites. This article will detail common analytical methods (proton Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (;H-NMR) and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight mass spectrometry (MALDI-ToF)) to assess the efficiency of the functionalizations. Common pitfalls and suggested troubleshooting methods will be addressed, as will modifications of the technique which can be used to further tune macromer functionality and resulting hydrogel physical and chemical properties. Use of synthesized products for the formation of hydrogels for drug delivery and cell-material interaction studies will be demonstrated, with particular attention paid to modifying hydrogel composition to affect mesh size, controlling hydrogel stiffness and drug release.

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

This video will illustrate a rapid, efficient method to methacrylate poly(ethylene glycol), enabling chain polymerizations and hydrogel synthesis. It will demonstrate how to similarly introduce methacrylamide functionalities into peptides, detail common analytical methods to assess functionalization efficiency, provide suggestions for troubleshooting and advanced modifications, and demonstrate typical hydrogel characterization techniques.

Forno a microonde assistita Funzionalizzazione di poli (etilene glicole) e On-resina Peptidi per l&#39;uso a polimerizzazione a catena ed idrogel Formazione

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Chimica

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Preparazione di idrossi-PAAM idrogel per dissociare gli effetti di meccanotrasduzione Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe a novel protocol employing the TiO2 photocatalysis to locally alter cell affinity of the substrate surface. For this experiment, a thin TiO2 film was sputter-coated on a glass coverslip, and the TiO2 surface was subsequently modified with an organosilane monolayer derived from octadecyltrichlorosilane (OTS), which inhibits cell adhesion. The sample was immersed in a cell culture medium, and focused UV light was irradiated to an octagonal region. When a neuronal cell line PC12 cells were plated on the sample, cells adhered only on the UV-irradiated area. We further show that this surface modification can also be performed in situ, i.e., even when cells are growing on the substrate. Proper modification of the surface required an extracellular matrix protein collagen to be present in the medium at the time of UV irradiation. The technique presented here can potentially be employed in patterning multiple cell types for constructing coculture systems or to arbitrarily manipulate cells under culture.

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.

Photopatterning proteine ​​e cellule in acquosa ambiente utilizzando TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Fotocatalisi

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

La sintesi di RGD-funzionalizzati idrogeli come strumento per applicazioni terapeutiche

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single cell resolution. Current state-of-the-art single cell micropatterning techniques involve soft lithography and micro-contact printing, which is a powerful technology, but requires trained engineering skills and certain facility support in microfabrication. These limitations require a more accessible technique. Here, we describe a simple alternative lithography-free method: stencil-based single cell patterning. We provide step-by-step procedures including stencil design, polyacrylamide hydrogel fabrication, stencil-based protein incorporation, and cell plating and culture. This simple method can be used to pattern an array of as many as 2,000 cells. We demonstrate the patterning of cardiomyocytes derived from single human induced pluripotent stem cells (hiPSC) with distinct cell shapes, from a 1:1 square to a 7:1 adult cardiomyocyte-like rectangle. This stencil-based single cell patterning is lithography-free, technically robust, convenient, inexpensive, and most importantly accessible to those with a limited bioengineering background.

This protocol introduces a lithography-free micropatterning method that is simple and accessible to those with a limited bioengineering background. This method utilizes customized laser-cut stencils to micropattern extracellular matrix proteins in a shape of interest for modulating cell morphologies. The procedure for micropatterning is demonstrated using induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes.

Micropatterning a cella singola semplice senza litografia con stencil laser-cut

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Biologia dello sviluppo

<meta charset="utf8"></head><body> Idrogel peptidici: metodi per la gelificazione ecocompatibile di ECF-5

Preparation of Mechanically Stable Self-Assembled Peptides Hydrogels

Peptide hydrogels are highly hydrophilic, three-dimensional network gels formed by the self-assembly of nanofibers or polymers, creating water-locking networks. Their morphology closely resembles that of the extracellular matrix, allowing them to exhibit both the biological functions of peptides and responsive gelation properties. These unique characteristics have led to their extensive application in tissue engineering, three-dimensional cell culture, cancer therapy, regenerative medicine, and other biomedical fields. This article describes three methods for preparing ECF-5 peptide hydrogels using self-assembling peptides with environmentally responsive gelation processes: (1) pH-responsive gelation: varying pH levels induce the protonation or deprotonation of amino acid residues, altering electrostatic interactions between peptide molecules and promoting their self-assembly into hydrogels; (2) Metal ion addition: polyvalent metal ions chelate with negatively charged amino acid residues, acting as bridges between peptides to form a network hydrogel; (3) Solvent exchange: hydrophobic peptides are initially dissolved in non-polar organic solvents and subsequently induce self-assembly into hydrogels upon transitioning to a polar aqueous environment. These methods utilize conventional experimental procedures to facilitate peptide self-assembly into hydrogels. By designing peptide sequences to align with specific gelation-inducing conditions, it is possible to achieve finely tuned micro/nanostructures and biological functions, highlighting the significant potential of peptide hydrogels in the biomedical domain.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Migliorare la produzione di fibre autoassemblanti e idrogel peptidici per una biocompatibilità superiore

This protocol presents three fast and simple preparation methods that use environmental conditions to trigger the self-assembly of peptides into hydrogels. Additionally, the characterization of peptide hydrogels is described, demonstrating that mechanically stable peptide hydrogels can be formed under these straightforward conditions.

Preparazione di idrogel peptidi autoassemblati meccanicamente stabili

Peptide hydrogels are highly hydrophilic, three-dimensional network gels formed by the self-assembly of nanofibers or polymers, creating water-locking ...

Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

Forno a microonde assistita Funzionalizzazione di poli (etilene glicole) e On-resina Peptidi per l'uso a polimerizzazione a catena ed idrogel Formazione

Preparazione di idrossi-PAAM idrogel per dissociare gli effetti di meccanotrasduzione Cues

Photopatterning proteine e cellule in acquosa ambiente utilizzando TiO

La sintesi di RGD-funzionalizzati idrogeli come strumento per applicazioni terapeutiche

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Micropatterning a cella singola semplice senza litografia con stencil laser-cut

Preparazione di idrogel peptidi autoassemblati meccanicamente stabili

Preparazione di idrogel peptidi autoassemblati meccanicamente stabili

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Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche

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