Descriveremo un metodo di micropattern a singola cella privo di litografia basato su stencil che supera molti ostacoli associati alla fotolitografia e alla litografia morbida. Gli stencil sono riutilizzabili e il processo è economico e personalizzabile. Questo metodo ha aperto una nuova strada per i ricercatori non ingegneri per studiare la forma cellulare e la meccanotraduzione indotta dall'area in vari contesti fisiologici e patologici.
Inoltre, questo protocollo consente la micropatterning di migliaia di cellule che possono essere utilizzate per lo screening dei farmaci ad alta produttività e la modellazione delle malattie in un piatto. La dimostrazione visiva faciliterà l'impianto di due passaggi cruciali: distacco di coverslip dall'idrogel, essiccazione dell'idrogel sufficientemente prima di posizionare lo stencil. Preparare la soluzione di idrogel di poliacrilammide in un nuovo tubo di centrifuga di propilene da 50 millilitri come descritto nel manoscritto.
Successivamente, per preparare la soluzione di fotoinizio del 5%, sciogliere gli ingredienti in 700 microlitri di etanolo al 100%. Gli ingredienti non sono solubili in acqua, quindi assicurati di dissolversi completamente con il vortice. Aggiungere 300 microlitri di PBS per un volume finale di un millilitro.
Lavorando su ghiaccio, diluire la soluzione di stock proteico della matrice di membrana basale con supporti DMEM F12 ghiacciati o 1X PBS al rapporto di diluizione ottimizzato. Tenere sul ghiaccio per un uso successivo. Quando si lavora con la matrice a membrana basale, assicurarsi di lavorare sempre sul ghiaccio e utilizzare soluzioni di freddo ghiaccio in punte e tubi di pipetta refrigerati.
Posizionare una lampada da banco UV in una cappa di sicurezza biologica. Quindi, posizionare i film di paraffina sterilizzati preparati in precedenza. Se le pellicole di paraffina non sono completamente asciutte, utilizzare un sistema di aspirazione sottovuoto per rimuovere eventuali liquidi residui.
Usando le forcep autoclavate, posiziona sei coverlips autoclavate sul film di paraffina sei in ogni piastra di Petri. Per preparare la soluzione finale di poliacrilammide cross-linkable UV, diluire la soluzione fotoiniziatore con la soluzione precursore dell'idrogel di poliacrilammide. Sterilizzare la soluzione utilizzando un'unità filtrante da 50 millilitri con una dimensione dei pori di 0,22 micrometri.
Quindi erogare 200 microlitri di soluzione finale in poliacrilammide retibile UV su ciascuno dei sei coprispacchi in vetro nelle piastre di Petri. Utilizzando le forcep autoclavate, coprire con cura ogni coverlip con un secondo coverslip intrappolando uno strato della soluzione tra i due copripavimenti. Posizionare le piastre di Petri contenenti i copripacchi sotto la lampada da banco UV con il coperchio chiuso.
La copertura del white paper sulla superficie non bianca è importante per ridurre al minimo la perdita di intensità UV. Per la protezione dalle radiazioni UV, coprire la lampada con un foglio di alluminio. Fotopolimerizzare gli idrogel di poliacrilammide per cinque minuti.
Utilizzare una lama di rasoio per separare accuratamente ogni paio di coverlips. Riempire il serbatoio contenente sei compositi di coverslip idrogel con PBS. Dopo il risciacquo per cinque minuti, riportare i compositi di coverlip dell'idrogel al film di paraffina nella piastra di Petri.
Ottenere un tubo di Sulfo-SANPAH dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius. Aggiungere 1.200 microlitri di PBS pre-refrigerato al tubo e mescolare tubazione su e giù. Distribuire 200 microlitri del Sulfo-SANPAH diluito sul film di paraffina nella piastra di Petri.
Posizionare un composito di coverslip idrogel sul Sulfo-SANPAH con l'idrogel che contatta il Sulfo-SANPAH. Quindi, posizionare i compositi di copertura dell'idrogel sotto la lampada UV ed esporli per cinque minuti per attivare il Sulfo-SANPAH. Se il Sulfo-SANPAH passa dall'arancione al marrone indicando l'attivazione e l'incorporazione di successo, procedere ai passaggi successivi entro 10 minuti.
Reintegrare il serbatoio monouso in polipropilene con PBS fresco. Trasferire i compositi di frantoio attivati nel serbatoio e sciacquarli brevemente per rimuovere il Sulfo-SANPAH non legato. Posizionare i compositi di coverlip dell'idrogel sul film di paraffina nelle piastre di Petri e tamponarli con cura con salviette sterili senza pelucchi.
Posizionare uno stencil sopra ogni idrogel coverslip composito. Per garantire una tenuta stretta tra lo stencil e il composito, rimuovere l'umidità in eccesso tamponando con salviette autoclavate senza pelucchi. Erogare con cura la soluzione proteica della matrice di membrana basale diluita posizionando 200 microlitri sopra ogni composito di coprisciuma idrogel.
Incubare i costrutti durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, trasferire i compositi su una piastra a sei pozza. Una tenuta stretta tra idrogel e stencil può essere facilmente convalidata osservando se la soluzione proteica della matrice è stata mantenuta sopra lo stencil.
La mancata formare una tenuta stretta porta a una rapida perdita della soluzione proteica attraverso i fori. Immergere completamente i compositi in PBS. Utilizzando pinzette in autoclave, staccare accuratamente gli stencil dagli idrogel senza strappare gli idrogel.
Rimuovere il PBS dai pozzi e riempire i pozzi con DMEM. Incubare il piatto durante la notte a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso la piastra dall'incubatore, esaminare il DMEM.
Se il DMEM non è torbido, i compositi idrogel coverslip sono pronti per essere utilizzati per la placcatura cellulare. Gli stencil erano fabbricati contenenti matrici di quadrati e rettangoli. Substrati idrogel micropatterned sono stati creati dagli stencil e sono state ottenute isole di proteine matrici.
Sono state ottenute anche isole cellulari. Ad esempio, isole di cardiomiociti pluripotenti derivati da cellule staminali indotte dall'uomo. La concentrazione di proteine matriciali ha svolto un ruolo essenziale nel generare modelli propri.
Una concentrazione ottimale ha portato ad una distribuzione omogenea delle proteine. Le concentrazioni di soluzione proteica a matrice non ottimale hanno portato a modelli non ottimale. È fondamentale utilizzare il lato anteriore dello stencil.
Se viene utilizzato il lato posteriore dello stencil, la dimensione delle isole proteiche della matrice aumenta a causa della direzione del taglio laser. Mentre l'uso del lato posteriore dello stencil non influisce in modo significativo sulla larghezza dei motivi rettangolari, l'altezza è aumentata significativamente portando a una riduzione delle proporzioni desiderate. La modelliatura a base di stencil è stata applicata ai substrati di elastomero di silicio.
I cardiomiociti modellati sui substrati di elastomero di silicio sono stati visualizzati dall'immunocitochimica della troponina cardiaca T a basso ingrandimento e dalla proteina sarcomerica alfa-actina ad alto ingrandimento. Il modello a base di stencil è stato anche applicato al modello di due cardiomiociti fianco a fianco su idrogel con rigidità diverse. La scoperta di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e dei corrispondenti protocolli di differenziazione ne ha fatto un modello umano ideale in vitro per lo studio dell'oncogenesi e della patogenesi.
Tuttavia, una delle principali limitazioni all'uso del sistema IPS è l'assenza di struttura al microambiente che ha particolare composizione biochimica e rigidità per interagire con le cellule. Il patterning può essere combinato con microscopia a forza di trazione e test immunocitochimica per caratterizzare la struttura e la funzione dei cardiomiociti. L'analisi dei tipi cellulari derivati dall'IPS, nel nostro caso cardiomiocita, in una morfologia più fisiologica apre opportunità per studiare cardiomiociti impegnativi nel piatto di coltura.
La tecnica può anche essere applicata a molti altri sistemi come e piastre di screening ad alto contenuto. La forma e il substrato possono essere facilmente adattati all'applicazione.
