Gli autori vorrebbero ringraziare V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger e K. Svoboda dell&#39;Espressione Neuronale Codificata Genetica ed Effector (GENIE) presso il Campus di Ricerca Janelia presso l&#39;Istituto Medico Hughes Howard per la loro generosa donazione di AAV1-GCaMP6f All&#39;Università di Pennsylvania Vector Core. Vorrebbero inoltre ringraziare l&#39;A. Olson e la Neuroscience Microscopic Core presso l&#39;Università Stanford sostenuta dalla NIH NS069375 per i loro servizi di microscopia confocale.

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Gli autori hanno letto la politica del diario e hanno i seguenti interessi concorrenti: SG, SO e VC sono dipendenti pagati a Inscopix.

Capire l&#39;attività del circuito neurale durante il comportamento sveglio è un livello vitale di indagini neuroscientificali necessarie per disciparle efficacemente la funzione del cervello in salute e malattie. La corteccia è una regione particolarmente importante da studiare nel contesto del comportamento sveglio, in quanto svolge un ruolo importante in molte funzioni vitali, cognitive ed esecutive 28 , 29 . La colonna corticale è considerata l&#39;unità funzionale base nella corteccia e l&#39;attività delle cellule corticali a livello di popolazione è noto per essere diversa in base alla loro posizione fisica all&#39;interno della colonna. Ad esempio, i neuroni eccitatori negli strati 2/3 nella corteccia somatosensoria proiettano principalmente altre regioni neocorticali e modulano altre reti corticali 30 , mentre le cellule in strati più profondi proiettano principalmente nelle regioni subcorticali come il thalamus 31 . Registrazione dell&#39;attività di centoS di celle corticali pre-specificate simultaneamente e affidabile nel tempo attraverso diverse lamelle in soggetti liberamente comportanti, avrebbe notevolmente migliorato la nostra comprensione del flusso informativo corticale, consentendo una più funzionale dissezione funzionale di colonne corticali informate da informazioni comportamentali in tempo reale e da tempo- bilancia. La raccolta di questo livello di dati dei circuiti neurali è resa possibile grazie all&#39;impiego di una piattaforma miniaturizzata microscopica efficiente e semplificata per condurre un&#39;imaging su larga scala Ca 2+ in soggetti con comportamenti liberi (o soggetti fisso a piacere). Utilizzato con indicatori di calcio geneticamente codificati per consentire il targeting specifico di tipo cellulare e l&#39;immagine di un campo di visione multistrato fornito da una sonda a prisma cronica impiantato, questo protocollo ha esplorato un caso tra molte applicazioni possibili: osservare le differenze laminari nell&#39;elaborazione corticale somatosensoria quando i topi Fisicamente impegnati con un oggetto nuovo ( Figura 5 ).Questa è la prima illustrazione procedurale di questo tipo di approccio specifico e in vivo di cellule specifiche per studiare più strati corticali in animali svegli e liberamente comportamentali e amplifica lo spettro dei metodi sperimentali disponibili per comprendere le strutture laminari nel cervello attivo. Il campo visivo periscopico permesso dalla sonda a prisma in questa tecnica può essere applicato in modo efficace ad altre strutture del cervello quando si desidera la conservazione del tessuto direttamente dorsale verso una regione di interesse; Per esempio, l&#39;imaging CA3 potrebbe essere raggiunto senza interruzione della funzione ippocampale. L&#39;approccio basato sulla sonda prismatica per l&#39;attività di imaging Ca 2+ richiede l&#39;inserimento fisico e l&#39;impianto permanente di un microprismo nella corteccia, che equivale alla creazione di una lesione corticale in cui viene inserita la sonda dell&#39;obiettivo. Ciò può causare interruzioni alla circuiteria neurale locale, compreso il taglio di dendriti e processi apici. TLa sua procedura provocherà anche un&#39;attivazione iniziale di cellule gliali nella regione, anche se questo si prevede di essere localizzato al tessuto circa 150 μm dalla faccia di prisma e di diminuire dopo che il cervello è guarito 22 . È molto importante considerare se questa tecnica influenzerà la normale anatomia e / o il comportamento del circuito quando pianifica esperimenti. I gruppi di controllo comportamentali dovrebbero sempre essere condotti per garantire che non ci siano alterazioni significative nei comportamenti di base che potrebbero produrre risultati confondenti sperimentali. Utilizzando questa miniatura, la tecnica mobile Ca 2+ di imaging con manipolazione neurofarmacologica, i diversi paradigmi cognitivi, sociali, motori o intrinseci comportamentali e combinandola con altre metriche fisiologiche possono approfondire e arricchire gli studi mirati alla comprensione dei ruoli funzionali dei circuiti neurali nel comportamento e nel segnale Elaborazione 32 . Soppressione o attivazioneLa determinazione di alcuni percorsi modulati da farmaci può influenzare comportamenti associati, che possono essere facilmente studiati usando questa tecnologia 33 . Il raggruppamento in diversi tipi di cellule modificando il targeting dell&#39;indicatore di calcio è un&#39;altra applicazione potente e utile e consente molte combinazioni creative di strumenti sperimentali per affrontare diverse domande sul circuito neurale.

La corteccia è un giocatore essenziale in molte complesse funzioni mentali e comportamentali, dall&#39;attenzione, dalla percezione sensoriale e dai controlli cognitivi dall&#39;alto 1 , 2 , 3 alle motivazioni, ricompense e dipendenze 4 , 5 . Comprendere i processi computazionali che sono alla base della sua funzione è un obiettivo importante per guidare una migliore comprensione clinica di molti disturbi mentali e comportamentali. Molte teorie attuali della malattia psichiatrica si concentrano attorno all&#39;idea che la disfunzione del circuito neuronale corticale o la disordinazione del disco possono essere alla base di anomalie cognitive e comportamentali che sono le caratteristiche di condizioni come la schizofrenia 6 , l&#39;autismo 7 o il disturbo ossessivo-compulsivo 8 . Così, ottenendo dati di attività neurale di popolazione da coI circuiti rtical all&#39;interno del corretto contesto di informazioni comportamentali simultanee sono di grande importanza e idealmente possono essere mirate a specifici tipi di cellule per la disezione del circuito neurale più fine. I microscopi miniaturizzati in combinazione con i microlenti dell&#39;indice di rifrazione del gradiente (GRIN) impiantabili permettono l&#39;accesso ottico a gruppi neuronali in condizioni di libera circolazione da una diversità di possibili regioni del cervello 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , incluse le corteccia 14 , 15 , 16 . L&#39;utilizzo di un sistema di microscopia mobile accoppiato con indicatori di calcio geneticamente codificato consente di ottenere immagini coerenti della stessa popolazione cellulare che comprende centinaia di neuroni tra giorni e settimane in molte regioni del cervello 9 e può essereGeneticamente mirati a specifici tipi di cellule utilizzando vettori virali o tecniche transgeniche. Poiché la corteccia è conosciuta per supportare funzioni diverse e connettersi a diverse regioni del cervello a seconda della posizione delle celle all&#39;interno della lamina corticale 17 , 18 , 19 , siamo interessati ad ottenere un&#39;attività neurale contemporanea multi-strato in soggetti comportamentali svegli. Qui dimostriamo come immagini centinaia di neuroni etichettati a fluorescenza nei topi liberi di comportamento per giorni, utilizzando il microscopio miniaturizzato a fluorescenza 20 accoppiato con una sonda prismata impiantata, che offre una visione multipla della corteccia ( Figura 1 ). La sonda a prisma utilizzata qui è composta da due lenti separate GRIN: un prisma e una lente cilindrica del relè ( figura 1 ). La luce del microscopio eccita il fluorescenti etichettatoCellule situate lungo la faccia di imaging della sonda a prisma, dopo essere riflesse dall&#39;ipotena della porzione di prisma della sonda. La luce emessa dalle cellule riflette anche l&#39;ipotenusa del prisma, viene raccolta attraverso l&#39;obiettivo del microscopio e raggiunge il sensore nel microscopio. La sonda a prisma utilizzata in questa procedura è adattata per un facile utilizzo con apparecchiature standard stereotassiali. Il microscopio miniaturizzato di fluorescenza 20 rileva i transienti Ca 2+ evocati dal potenziale d&#39;azione nelle popolazioni neuronali con risoluzione di una singola cellula, dopo che queste cellule sono state specificamente etichettate con indicatori fluorescenti geneticamente codificati Ca 2+ . In questo protocollo, abbiamo iniettato l&#39;indicatore Ca 2+ codificato in un vettore virale (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implantato una sonda a prisma, installato il microscopio, quindi ottenuto più giorni di dati di attività neurale somatosensoriale (S1 posteriori) Da un animale esponeD alle nuove superfici dell&#39;oggetto durante l&#39;esplorazione gratuita ( Figura 2 ).

<table><tbody><tr><td>Neurostar Motorized&lt;br/&gt; Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td><td>Kopf</td><td>Model 963SD</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Labomed</td><td>Prima DNT</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&quot;/1.6 mm diameter) - 1/4&quot; Jack</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Heating Pad 5 X 12.5 cm&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>40-90-2-07</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>DC Temperature Controller</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Microsyringe Pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3 model; serial 155788 F110</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>NanoFil 10 &amp;mu;L Syringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF35BV-2</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Omnidrill35, 115 - 230 V</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Burrs for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>nVista</td><td>Inscopix</td><td>100-001048</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-PV3435</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Victor Medical</td><td>5487</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Victor Medical</td><td>1699008&amp;nbsp;</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Victor Medical</td><td>1001054</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm)</td><td>Pfizer (Fisher Scientific)</td><td>NC9841478</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dissecting knives</td><td>Fine Science Tools</td><td>10055-12</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>ProView Implant Kit</td><td>Inscopix</td><td>100-000756</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length</td><td>Inscopix</td><td>100-000592</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Kwik-Cast Sealant</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Miniature Optical Mounting Post</td><td>Newport</td><td>M-TSP-3</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate</td><td>Inscopix</td><td>BPL-2</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate Cover</td><td>Inscopix</td><td>BPC-2</td><td>Imaging</td></tr></tbody></table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

L&#39; imaging funzionale a livello di circuito e di livello cellulare in vivo è uno strumento cruciale per capire il cervello in azione. L&#39;imaging ad alta risoluzione dei neuroni corticali di topi con la microscopia a due fotoni ha fornito una visione unica sulle strutture corticali, sulla funzionalità e sulla plasticità. Tuttavia, questi studi sono limitati agli animali fisso testa, riducendo notevolmente la complessità comportamentale disponibile per lo studio. In questo articolo descriviamo una procedura per eseguire la microscopia cronica di fluorescenza con risoluzione cellulare su più strati corticali in topi comportamentali liberamente. Abbiamo utilizzato un microscopio integrato miniaturizzato a fluorescenza accoppiato con una sonda prismata impiantata per visualizzare e registrare simultaneamente le dinamiche di calcio di centinaia di neuroni attraverso diversi strati della corteccia somatosensoriale come il mouse si è impegnato in un nuovo esplorazione di oggetti oggetto, per diversi giorni. Questa tecnica può essere adattata ad altre regioni del cervello in diverse specie animali per altri comportamentaliaradigms.

Il protocollo descritto qui descrive un modo efficace ed efficace per eseguire l&#39;imaging Ca 2+ multi-layer longitudinale da centinaia di neuroni corticali in topi comportamentali che usano sonde prismatiche ( Figura 1 ). Gli approcci precedenti verso l&#39;imaging corticale multistrato sono stati principalmente limitati agli animali fisso testa 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Per acquisire questo livello di dati in un contesto comportamentale liberamente, è stata utilizzata una piattaforma miniaturizzata di microscopi per la flessibilità comportamentale; Un indicatore di calcio geneticamente codificato (GCaMP6f) è stato utilizzato per individuare una popolazione cellulare specifica (cellule CAMKII + nella corteccia); E una sonda a prisma è stata scelta per fornire un campo visivo cronico e multistrato. <p class="jove_content" fo:keep-ogether.within-page = &quot;1&quot;&gt; Abbiamo dimostrato il flusso di lavoro per la preparazione dell&#39;animale per l&#39;imaging. Un vettore virale che codifica un indicatore di calcio appropriato è stato iniettato nella corteccia ( figura 2 , passaggio 1), prima di impianto cronometrico di una sonda a prisma per consentire l&#39;accesso ottico alle celle etichettate ( figura 2 , passaggio 2). Una piastra base che funge da banchina sicura e temporanea per il posizionamento del microscopio durante le sessioni di imaging è stata poi installata sulla testa dell&#39;animale ( figura 2 , passaggio 3), consentendo la visualizzazione dell&#39;attività corticale su più strati di cellule in un esperimento sveglio di comportamento Setup ( Figura 2 , passaggio 4). Per assicurare che la popolazione cellulare desiderata sia stata selezionata, nella figura 3 è mostrata una sezione cerebrale coronale post-mortem da un topo rappresentativo con il tratto di sonda prismastico e il campo di vista contrassegnato rispetto al laboratorio GCaMP6fNeuroni eled nei livelli 2/3 e 5 della corteccia somatosensoriale. Durante il comportamento sveglio con il sistema, l&#39;attività dei neuroni corticali somatosensori è stata registrata quando il mouse è stato esposto a tre diversi ambienti: Open Field (Day 1), Object Familiarization (Day 2-4) e Object Novel (Day 5) ( Figura 4 ). Il giorno 1 il mouse è stato collocato in un arena comportamentale privo di qualsiasi oggetto. Il giorno 2-4 il mouse è stato messo nell&#39;arena con gli stessi due oggetti strutturalmente diversi (un gel pad e un blocco di legno). Il giorno 5, uno degli oggetti è stato sostituito da un nuovo oggetto. L&#39;animale è stato imaging per 5 giorni per 20 minuti ogni giorno. Dopo l&#39;estrazione delle cellule usando il software di analisi dei dati di immagine Ca 2+ , i filtri spaziali corrispondenti alle posizioni delle cellule sono state sovrapposte alla proiezione di intensità fluorescente media dei dati di registrazione del microscopio( Figura 5) . Una linea tratteggiata bianca separa gli strati di 2/3 e 5 cellule. Le corrispondenti Ca 2+ tracce da 5 celle di ognuno dei livelli mostrano lo schema di cottura delle celle in due contesti comportamentali diversi: Object Familiarization e Novel Object Exposure. Le cellule Layer 2/3 erano più attive rispetto alle cellule del livello 5 il giorno in cui il mouse è stato esposto ad un oggetto nuovo. Ciò è anche evidente dalle trame raster che mostrano l&#39;attività di cottura soggetta a tutte le cellule imaged nei giorni 1, 4 e 5. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Figura 1: In Vivo Ca 2+ Imaging su più livelli corticali in Mouse in movimento. ( A ) Specifiche della sonda prismata e rappresentazione del piano di imaging. Il rivestimento riflettente all&#39;interno dell&#39;ipotenusa consente di imaging 90 ° dal piano di inserimento della sonda a prisma. La lente cuFf si integra con il supporto dell&#39;obiettivo, che semplifica la procedura di impianto e consente la visualizzazione potenziale della fluorescenza del tessuto ambientale durante l&#39;impianto ( B ) (i). Illustrazione del posizionamento della craniotomia e del coltello della pressa prismatica rispetto al sito di iniezione del virus, e (ii) l&#39;illustrazione della posizione della sonda di prisma della superficie piana rispetto all&#39;incisione del coltello e al sito di iniezione del virus. ( C ) Illustrazione di setup in-vivo di Ca 2+ che mostra il percorso della luce per una piccola area all&#39;interno del campo visivo attraverso la sonda a prisma impiantata nella corteccia del mouse. ( D ) Campo di vista di esempio durante l&#39;installazione della sonda a prisma. Il microscopio miniaturizzato è collegato al supporto dell&#39;obiettivo, che contiene la sonda a prisma che consente di controllare l&#39;espressione del virus durante l&#39;installazione della sonda a prisma. ( E ) Integrazione del microscopio con sonda a prisma per l&#39;imaging corticale multistrato di celle S1 etichettate con GCaMP6f. F Campo di visualizzazione di esempioDurante l&#39;installazione del basamento. Il modello di vaso sanguigno chiaro è visibile al momento dell&#39;installazione del basamento con alcune celle nell&#39;immagine grezze. Altre celle sono chiaramente visibili quando DF / F è acceso nella finestra del software di acquisizione. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Figura 2: Diagramma che mostra la sequenza temporale degli eventi del flusso di lavoro per l&#39;impianto di impianto e l&#39;installazione del microscopio. Numero di settimane è rappresentato sull&#39;asse X e le fasi del flusso di lavoro delle procedure lungo l&#39;asse Y. ( A ) Grafico che illustra l&#39;iniezione virale (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) lungo lo stesso asse dorso-ventrale, per etichettare più strati della corteccia somatosensoria del topo. ( B ) 2 settimane dopo le iniezioni di virus, un prisma probE viene impiantato ad un asse parallelo ai siti di iniezione del virus. ( C ) Circa una settimana dopo l&#39;impianto di pressa pressa, l&#39;animale viene controllato per l&#39;espressione con il microscopio e una piastra di base è montata sulla testa se una popolazione di cellule è visibile. ( D ) L&#39;animale è quindi pronto per l&#39;imaging cronico durante compiti comportamentali pertinenti (Clip art del mouse modificato dopo il permesso di UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Figura 3: Validazione istologica postmortem della posizione della sonda prismata e dell&#39;espressione GCaMP. ( A ) sezione coronale da un cervello del topo rappresentativo che mostra il tratto della sonda della prism e con il suo lato di imaging rivoltoLe cellule espresse GCaMP6f (AAV1.CaMKII.GCaMP6f espresse nei neuroni negli strati 2/3 e 5). ( B ) Same sezione del cervello coronale dopo la colorazione per DAPI. Barra di scala = 250 μm ( C ) Zoomato in vista delle cellule GCaMP6f espresse in corteccia somatosensoriale. Barra di scala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Figura 4: L&#39;attività del mouse durante l&#39;abitudine, la familiarizzazione e il nuovo esame di esposizione degli oggetti sono stati monitorati tramite video utilizzando il software video. ( A ) Il primo giorno, l&#39;animale è stato messo in un arena comportamentale privo di qualsiasi oggetto (Open Field). ( B ) Nei giorni 2-4, gli stessi due oggetti strutturalmente diversi (gel pad e blocco di legno) sono stati posti nell&#39;arena (Object Familiarization). ( C ) Il giorno 5, uno degli oggetti è stato sostituito da un oggetto nuovo (blocco di legno con carta sabbia) (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Figura 5: Dinamica del calcio da superficiali e profondi livelli di corteccia somatosensoriale di un topo rappresentativo con il microscopio. ( A ) Immagine unita di filtri spaziali neuronali (blobs verdi) e proiezione media di intensità di fluorescenza della registrazione del microscopio attraverso il campo visivo della sonda a prisma. Il confine tra gli strati supragranulari e infragranulari indicati da una linea bianca tratteggiata. Barra di scala = 100 μm. ( B ) Tracce di calcio da cinque esempi di cellule strati superficiali e profonde (riempito blu e rosso cElls nel pannello A), indicando unità di deviazione standard della fluorescenza seguendo l&#39;analisi principale e indipendente dei componenti. Barra di scala orizzontale 50 s e barra di scala verticale 10 SD ( C ) Trama raster di celle superficiali (strati 2/3) e strati profondi (livello 5) mostrati sul campo aperto, Object Familiarization e Novel object exploration. Barra di scala = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Qui esempiamo una procedura per l&#39;esecuzione di immagini su larga scala Ca 2+ con risoluzione cellulare su più strati corticali in topi liberamente spostati. Centinaia di cellule attive possono essere osservate simultaneamente utilizzando un microscopio a testa in miniatura accoppiato con una sonda a prisma implantato.

Corticale multistrato Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging nei mouse con movimento libero con sonde a prisma e microscopia a fluorescenza miniaturizzata

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

30.9K Views.  Inscopix Inc..  Qui esempiamo una procedura per l'esecuzione di immagini su larga scala Ca 2+ con risoluzione cellulare su più strati corticali in topi liberamente spostati. Centinaia di cellule attive possono essere osservate simultaneamente utilizzando un microscopio a testa in miniatura accoppiato con una sonda a prisma implantato. 

Video: Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically identified cells during behavior1-6. Here we describe methods to perform two-photon imaging in mouse cortex while the animal navigates a virtual reality environment. We focus on the aspects of the experimental procedures that are key to imaging in a behaving animal in a brightly lit virtual environment. The key problems that arise in this experimental setup that we here address are: minimizing brain motion related artifacts, minimizing light leak from the virtual reality projection system, and minimizing laser induced tissue damage. We also provide sample software to control the virtual reality environment and to do pupil tracking. With these procedures and resources it should be possible to convert a conventional two-photon microscope for use in behaving mice.

Here we describe the experimental procedures involved in two-photon imaging of mouse cortex during behavior in a virtual reality environment.

Due fotoni Imaging di calcio in topi Navigazione una realtà ambiente virtuale

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

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Comportamento

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a living animal&#8217;s brain. Moreover, the lengthy recovery from anesthesia limits the frequency of repeated recording/imaging episodes in longitudinal studies. Hence, new methods that would allow stable recordings from non-anesthetized behaving mice are expected to advance the fields of cellular and cognitive neurosciences. Existing solutions range from mere physical restraint to more sophisticated approaches, such as linear and spherical treadmills used in combination with computer-generated virtual reality. Here, a novel method is described where a head-fixed mouse can move around an air-lifted mobile homecage and explore its environment under stress-free conditions. This method allows researchers to perform behavioral tests (e.g., learning, habituation or novel object recognition) simultaneously with two-photon microscopic imaging and/or patch-clamp recordings, all combined in a single experiment. This video-article describes the use of the awake animal head fixation device (mobile homecage), demonstrates the procedures of animal habituation, and exemplifies a number of possible applications of the method.

This method creates a tangible, familiar environment for the mouse to navigate and explore during microscopic imaging or single-cell electrophysiological recordings, which require firm fixation of the animal&#8217;s head.

Appartamento con pavimento Platform aria sollevata: Un nuovo metodo per la combinazione di Comportamento con microscopia o Elettrofisiologia su Awake liberi di muoversi Roditori

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biologia

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Imaging in vivo di Deep strati corticali usando un microprismi

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Neuroscienze

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

In vivo Imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

In vivo Imaging del calcio a campo largo e a due fotoni da un topo utilizzando una grande finestra cranica

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Imaging a due fotoni e calcio ad ampio campo nel collicolo superiore

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autore in primo piano: Svelare la codifica neurale e i meccanismi di elaborazione visiva nel collicolo superiore 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Corticale multistrato Ca

Riepilogo

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