Questo lavoro è stato finanziato in parte da un NIH Pathway to Independence Award (Grant GM 099.893) ei fondi di avvio facoltà di SRB, nonché un progetto di assegno di ricerca (Grant GM 042.219). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta dei dati e l&#39;interpretazione, o la decisione di presentare il lavoro per la pubblicazione.

1. Preparazione del Buffer Solutions <ol><li> Preparare salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) diluendo una soluzione stock di 10x PBS ad una concentrazione finale di 1x con ultrapura (distillata e deionizzata) acqua. </li><li> Preparare la soluzione quenching combinando 2 mL di acetonitrile, 2 mL di metanolo, 1 mL di H 2 O ultrapura, e 19 microlitri (0,1 mM di concentrazione finale) di acido formico. </li><li> Preparare LC-MS solvente A per aggiunta di acido formico (0,2% [v / v] concentrazione finale) per acqua ultrapura. </li><li> Preparare LC-MS solvente B per aggiunta di acido formico (0,2% [v / v] concentrazione finale) per acetonitrile. NOTA: Tutte le soluzioni dovrebbero essere preparate utilizzando i reagenti più alto grado di purezza disponibile (in genere ad alte prestazioni di prima scelta cromatografia liquida). Le soluzioni devono essere preparate fresco prima di ogni esperimento e conservati in ghiaccio prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Istituzione di steady-state S. aureus Crescita <ol><li> Streak S. aureuceppi s di interesse per l&#39;isolamento sul Tryptic Soy Agar (TSA) da uno stock di glicerolo congelato. Incubare a 37 ° C per 16-24 h. </li><li> Seminare 4 mL di brodo Tryptic Soy (TSB) o altro mezzo idoneo in provette di incubazione vetro sterili con singole colonie di ciascun ceppo. Incubare inclinata (~ 70 ° angolo) con rotazione a 60 giri al minuto (rpm) a 37 ° C per 16-20 ore. NOTA: culture di notte sono inclini a gradienti di ossigeno utilizzando metodi standard, comprese quelle descritte nella fase 2.2, che influenzano fisiologia cellulare. Così, ci avvaliamo di una strategia multipla back-diluizione al fine di garantire a regime biologico (vedere i passi 2.4-3.2, di seguito). </li><li> Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica delle colture dal punto 2.2 a 600 nm (OD 600). Utilizzare mezzo sterile come riferimento ottico (vuoto). Diluire le cellule ad una OD 600 di 0,05 a 50 ml di terreno TSB sterile (preriscaldata a 37 ° C) in separato, 250 mL DeLong fiaschi. </li><li> incubate le colture a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua con agitazione a 280 rpm. </li><li> Ogni 30 minuti, prendere OD 600 misurazioni; all&#39;aumentare delle densità ottiche, può essere necessario diluire le culture con TSB modo che rimangano nell&#39;intervallo assorbanza lineare dello spettrofotometro. </li><li> Quando le culture dal punto 2.5 raggiungono un OD 600 di ~ 0.8-1.0, li subcoltura in 50 ml di 37 ° C TSB ad un OD 600 di 0,01-0,05 e ripetere i punti 2.4 e 2.5. </li></ol> Setup Collection 3. Il campione <ol><li> Preparare un letto di ghiaccio secco tritato in un recipiente appropriato (ad esempio, vetro piatto, ghiaccio, o raffreddamento). </li><li> Poiché le densità ottiche delle culture avvicinano al punto di raccolta desiderata, aggiungere 1 ml di soluzione di tempra 35 mm greggia Petri e pre-raffreddamento in ghiaccio secco per ≥5 min. NOTA: Il &quot;punto di raccolta desiderato&quot; varierà a seconda degli obiettivi sperimentali. Ad esempio, se si dovesse verificare metabolites durante la crescita aerobica, indicatori chiave di questo stato includono escrezione acetato e ri-assimilazione del acetato durante la fase di crescita post-esponenziale 32, 33. Generalmente, questo punto dovrebbe essere all&#39;interno di una fase di crescita specifico (ad esempio, fase esponenziale). Le specifiche OD 600 valori associati a questo stadio può variare tra i diversi ceppi batterici e mezzi di crescita. </li><li> Posizionare una fritta filtro in acciaio inox (pre-raffreddata a -20 ° C) in un tappo di gomma e posizionarlo in cima una beuta da vuoto collegata ad un vuoto casa o pompa a vuoto. </li><li> Applicare il vuoto e posizionare un misto estere di cellulosa membrana (0,22 um dimensione dei pori) sulla parte superiore. NOTA: È fondamentale utilizzare un filtro con un diametro uguale a quello della fritta e per centrare correttamente questo filtro per garantire che il campione viene fatto passare attraverso il filtro, piuttosto che sul bordo. Bagnare la membrana con ghiacciata, H 2 O sterile può aiutarecon il posizionamento della membrana. </li></ol> 4. Esempio Harvest <ol><li> A un OD 600 di ~ 0,4-0,5, utilizzare una pipetta sierologica per rimuovere 13 ml di coltura dal pallone e di applicare il campione al filtro. </li><li> Dopo che l&#39;intero campione è stato filtrato, immediatamente lavare il filtro con ≥5 mL di PBS ghiacciato per lavare via metaboliti medie associata. </li><li> Scollegare il vuoto e usare un paio di pinzette sterili per rimuovere il filtro dal fritta. Invertire il filtro (cella rivolto verso il basso) nella soluzione di raffreddamento pre-raffreddata. NOTA: È importante eseguire i passaggi sopra rapidamente (cioè entro secondi) e appena il liquido è stato rimosso per assicurare il raffreddamento rapido delle cellule, arrestando l&#39;attività metabolica. </li><li> Incubare il filtro in soluzione di raffreddamento in ghiaccio secco per ≥20 min. </li><li> Con una pinzetta sterili, invertire il filtro (cella rivolta verso l&#39;alto) nella capsula di Petri e utilizzare una micropipetta per sciacquare le cellule fuori di tegli membrana nella soluzione di tempra. </li><li> Risospeso le cellule in soluzione di raffreddamento e poi trasferire la sospensione cellulare in una provetta 2 mL antiurto sterile contenente ~ 100 ml di perline di silice 0,1 mm. Conservare questo in ghiaccio secco o a -80 ° C. </li></ol> 5. Estrazione Metabolite <ol><li> campioni scongelamento in ghiaccio e distruggere le cellule in un omogeneizzatore con quattro 30 s raffica a 6.000 rpm, con periodi di raffreddamento 2 min in ghiaccio secco tra cicli. </li><li> Chiarire i lisati per 15 min in un pre-raffreddata, microcentrifuga refrigerata alla massima velocità (cioè, 18.213 xga ≤4 ° C). </li><li> Trasferire il surnatante in una provetta pulita. </li><li> Usando una micropipetta, trasferire una piccola porzione del campione in una provetta per la quantificazione del contenuto peptide residuo nel passaggio 6; memorizzare il residuo a -80 ° C. NOTA: Il volume del campione riservato varia, a seconda del dosaggio BCA utilizzato nel passaggio 6.1. Questocampione deve essere conservato in ghiaccio per l&#39;analisi immediata o congelato a -80 ° C. </li></ol> 6. Acido bicinconinico (BCA) Assay <ol><li> Eseguire un saggio BCA come raccomandato dal produttore del kit, utilizzando campioni dal punto 5.4 per determinare la concentrazione del peptide residuo per ogni campione. </li></ol> 7. LC-MS <ol><li> Mescolare 75 ml di S. aureus estratto con 75 ml di LC-MS solvente B, preparato al punto 1.4. </li><li> Vortex per miscelare e far girare a 13.000 xg per 5 min. </li><li> Posizionare 100 ml di surnatante in una cromatografia liquida (LC) fiala e tappare esso. Assicurarsi che non bolle d&#39;aria intrappolate nel campione. </li><li> Caricare le fiale LC sul campionatore automatico LC-MS e modificare l&#39;elenco in esecuzione nel software &quot;Offline Worklist Editor&quot;. <ol><li> Compila il &quot;Nome del campione&quot; (ad esempio, wild-type-1), &quot;Sample Position&quot; (ad esempio, P1-A1), &quot;Metodo&quot; (ad esempio, formico Acid-negativi Method), e (per esempio, wild-type-1) colonne di &quot;File di dati&quot;. Fare clic sul pulsante sul pulsante &quot;Salva lista di lavoro&quot;. Aprire il software &quot;Spettrometria di Massa Data Acquisition Workstation&quot; e inserire la lista di lavoro salvato in precedenza. Fare clic sul pulsante &quot;Start lista di lavoro Run&quot; per avviare la misurazione continua LC-MS. </li></ol></li><li> Separare i campioni su una colonna, collegare la colonna a un tempo di spettrometro di volo (TOF), e coppia lo spettrometro TOF con il sistema LC. Utilizzare un gradiente di fase mobile come segue: 0-2 min, 85% di solvente B; 3-5 min, 80% di solvente B; 6-7 min, 75% di solvente B; 8-9 min, 70% di solvente B; 10-11,1 min, 50% di solvente B; 11,1-14 min, 20% di solvente B; e 14,1-24 min, 5% di solvente B; terminare con un punto riequilibrio 10 min a 85% di solvente B e una velocità di flusso di 0,4 mL min -1. </li><li> Utilizzando una pompa isocratica, infondere una soluzione massa di riferimento con la corsa per consentire la calibrazione simultanea asse massa. NOTA: questo passaggiosi basa sul manuale spettrometro TOF standard. <ol><li> Utilizzare la miscela di acido acetico e D4 esakis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxy) phosphazine come soluzione massa di riferimento per eseguire la calibrazione in tempo reale. Usare la pompa isocratica con velocità di flusso di 2.5 mL min -1 per l&#39;infusione. </li></ol></li></ol> 8. Batch Correzione di Conti Ion <ol><li> Designare qualsiasi campione per servire come campione di riferimento per la correzione batch (ad esempio, di tipo selvaggio, replicare 1). </li><li> Calcolare la somma dei conteggi di ioni per tutti i metaboliti all&#39;interno del campione di riferimento. Ripetere questo calcolo per tutti i campioni. </li><li> Dividere il numero totale di ioni di ciascun campione dal conteggio ionica totale del campione di riferimento per generare un rapporto. </li><li> Dividere il numero di ioni per ogni metabolita all&#39;interno di un campione dal rapporto campione / riferimento per ottenere un numero di ioni lotti corretta per ciascun metabolita. </li></ol> 9. Peptide Normalizzazione <ol><li> Divide i valori di conteggio ionico lotti corretta per ciascun campione ottenuto nel passaggio 8 per la concentrazione del peptide determinata con il saggio BCA nel passaggio 6 per ottenere un valore normalizzato per ciascun metabolita. NOTA: I normalizzati, batch lotto corretto conteggio ionico per ciascun metabolita ottenuto nello stadio 9.1 può essere direttamente confrontata tra ceppi e sottoposto ad analisi statistica (ad esempio, una U di Mann-Whitney -test). In alternativa, un metabolita caratterizza per essere invariato sia attraverso un trattamento o background genetico può essere utilizzato come un normalizzatore per rilevare le variazioni dovute al metabolita decomposizione. L&#39;inclusione di una quantità nota di L-norvalina o acido gluraric nel tampone di estrazione può essere utilizzato per correggere la perdita durante l&#39;elaborazione del campione 34. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Tutti i metaboliti piccole molecole sono collegate tra di loro attraverso le loro origini comuni in vie metaboliche centrali. Durante la crescita esponenziale, le cellule batteriche sono a regime biologico e metabolico, fornendo una fotografia dello stato fisiologico in condizioni specifiche. Cody monitora sufficienza nutrienti rispondendo a IBT e GTP. Come ILV e GTP piscine goccia, attività Cody è probabile progressivamente ridotto, regolando l&#39;espressione dei suoi geni bersaglio per adattarsi alla crescente esau...

batteri patogeni devono affrontare molte sfide all&#39;interno dell&#39;ambiente host. Oltre a attacco diretto da parte delle cellule immunitarie, l&#39;host sequestra anche nutrienti essenziali per la sopravvivenza batterica e la replicazione, generando immunità nutrizionale 1, 2. Per sopravvivere a questi ambienti ostili, batteri patogeni distribuire fattori di virulenza. Alcuni di questi fattori permettono ai batteri di eludere la risposta immunitaria; Altri fattori includono secreti enzimi digestivi, come ialuronidasi, termonucleasi, e lipasi, che possono permettere ai batteri di riempire le sostanze nutrienti mancanti consumando costituenti derivate dal tessuto 3, 4, 5. Infatti, i batteri hanno sviluppato sistemi regolatori che legano lo stato fisiologico della cella per la produzione di fattori di virulenza 6, 7, <s<html> up class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Un crescente corpo di evidenze indica Cody come un regolatore fondamentale che collega il metabolismo e virulenza. Sebbene scoperto nel Bacillus subtilis come repressore del gene 11 dipeptide permease (DPP), Cody è ormai noto per essere prodotto da quasi tutti i bassi batteri G + C Gram-positivi 12, 13 e regola decine di geni coinvolti in carbonio e azoto metabolismo 14, 15, 16, 17, 18, 19. In specie patogene, Cody controlla anche l&#39;espressione di alcuni tra i più importanti geni di virulenza 20, 21,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody è attivata come una proteina legante il DNA da due classi di ligandi: amminoacidi ramificati (BCAA, isoleucina, leucina e valina [ILV]) e GTP . Quando questi nutrienti sono abbondanti, Cody reprime (o in alcuni casi, stimola) trascrizione. Poiché questi nutrienti diventano limitato, attività Cody è progressivamente ridotto, con conseguente risposta trascrizionale graduata che ri-rotte precursori attraverso varie vie metaboliche legate al metabolismo centrale 28, 29, 30. Tandem cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) è una tecnica potente che può identificare accuratamente e quantificare piccole molecole metaboliti intracellulari 31. Quando è accoppiato con transcAnalisi riptome (ad esempio, RNA-Seq), questo flusso di lavoro di analisi in grado di fornire una conoscenza delle cambiamenti fisiologici che si verificano in risposta a stress ambientale o nutrizionale. Qui, presentiamo un metodo per l&#39;estrazione metabolita da cellule di Staphylococcus aureus e successiva analisi mediante LC-MS. Questo approccio è stato utilizzato per dimostrare gli effetti pleiotropici di Cody su S. aureus fisiologia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

Nel tentativo di contrastare i batteri patogeni, ospita spesso limitano la disponibilità di nutrienti nel sito di infezione. Questa limitazione può alterare le abbondanze dei metaboliti principali alle quali fattori regolatori rispondono, regolando il metabolismo cellulare. Negli ultimi anni, un certo numero di proteine ​​e RNA sono emersi come importanti regolatori dell&#39;espressione genica virulenza. Ad esempio, la proteina CODY risponde a livelli di amminoacidi ramificati e GTP ed è ampiamente conservato in basso G + C batteri Gram-positivi. Come regolatore globale Staphylococcus aureus, Cody controlla l&#39;espressione di decine di virulenza e geni metabolici. Ipotizziamo che S. aureus utilizza Cody, in parte, per alterare il suo stato metabolico nel tentativo di adattarsi alle condizioni di nutrienti limitativo potenzialmente presenti nell&#39;ambiente ospitante. Questo manoscritto descrive un metodo per l&#39;estrazione e l&#39;analisi metaboliti da S. aureus mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massaspettrometria, un protocollo che è stato sviluppato per verificare questa ipotesi. Il metodo evidenzia anche migliori pratiche che garantiranno rigore e riproducibilità, come il mantenimento stato stazionario biologica e costante aerazione senza l&#39;uso di colture chemostato continue. Rispetto alle USA200 meticillina-sensibili S. aureus isolare UAMS-1 ceppo parentale, il isogenico CODY mutante esposto aumenti significativi amminoacidi derivati da aspartato (ad esempio, treonina e isoleucina) e diminuisce nei loro precursori (ad esempio, aspartato e O -acetylhomoserine ). Queste scoperte correlano bene con i dati trascrizionali ottenuti con l&#39;analisi di RNA-seq: geni in questi percorsi sono up-regolata tra 10 e 800 volte nel mutante nullo Cody. Accoppiamento analisi globali del trascrittoma e il metaboloma può rivelare come i batteri alterano il loro metabolismo di fronte a stress ambientale o nutrizionale, permettono di approfondire il potenziale nelle Physmodifiche iological associati a esaurimento degli elementi nutritivi sperimentato durante l&#39;infezione. Queste scoperte possono aprire la strada per lo sviluppo di nuovi agenti anti-infettivi e terapeutica.

Abbiamo analizzato piscine metaboliti intracellulari di S. aureus durante la crescita in vitro in una ricca, mezzo complesso. Come prova di principio, abbiamo confrontato i profili dei metaboliti tra il sensibile alla meticillina di S. aureus osteomielite isolare UAMS-1 (wild-type [WT]) e un ceppo isogenico manca il regolatore trascrizionale globale Cody (Δ Cody) 26. Stato stazionario, culture esponenziali dei ceppi WT e Co...

Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Qui si descrive un protocollo per l&#39;estrazione di metaboliti da Staphylococcus aureus e la loro successiva analisi mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa.

Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.0K Views.  Georgetown University.  Qui si descrive un protocollo per l'estrazione di metaboliti da Staphylococcus aureus e la loro successiva analisi mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa. 

Video: A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Un approccio Facile ed efficiente per la produzione di micelle reversibile Disulfide Croce-linked

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

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A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

Un approccio G-quadruplex del DNA-affinità per purificazione di enzimaticamente attiva G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, we developed IDBac&#8212;a low-cost and high-throughput matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) bioinformatics pipeline. IDBac software is designed for non-experts, is freely available, and capable of analyzing a few to thousands of bacterial colonies. Here, we present procedures for the preparation of bacterial colonies for MALDI-TOF MS analysis, MS instrument operation, and data processing and visualization in IDBac. In particular, we instruct users how to cluster bacteria into dendrograms based on protein MS fingerprints and interactively create Metabolite Association Networks (MANs) from specialized metabolite data.

IDBac is an open-source mass spectrometry-based bioinformatics pipeline that integrates data from both intact protein and specialized metabolite spectra, collected on cell material scraped from bacterial colonies. The pipeline allows researchers to rapidly organize hundreds to thousands of bacterial colonies into putative taxonomic groups, and further differentiate them based on specialized metabolite production.

Utilizzo della pipeline OPEN-Source MALDI TOF-MS IDBac per l'analisi dei dati sulle proteine microbiche e sui metaboliti specializzati

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Un approccio personalizzabile per la produzione e la purificazione esulta dei prodotti naturali Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management of product yield and quality. Metabolomics data provides a read-out of these interactions at a given moment in time and is informative of an organism&#39;s biochemical status. Further, individual metabolites or panels of metabolites can be used as precise biomarkers for yield and quality prediction and management. The plant metabolome is predicted to contain thousands of small molecules with varied physicochemical properties that provide an opportunity for a biochemical insight into physiological traits and biomarker discovery. To exploit this, a key aim for metabolomics researchers is to capture as much of the physicochemical diversity as possible within a single analysis. Here we present a liquid chromatography-mass spectrometry-based untargeted metabolomics method for the analysis of field-grown wheat grain. The method uses the liquid chromatograph quaternary solvent manager to introduce a third mobile phase and combines a traditional reversed-phase gradient with a lipid-amenable gradient. Grain preparation, metabolite extraction, instrumental analysis and data processing workflows are described in detail. Good mass accuracy and signal reproducibility were observed, and the method yielded approximately 500 biologically relevant features per ionization mode. Further, significantly different metabolite and lipid feature signals between wheat varieties were determined.

A method for the untargeted analysis of wheat grain metabolites and lipids is presented. The protocol includes an acetonitrile metabolite extraction method and reversed phase liquid chromatography-mass spectrometry methodology, with acquisition in positive and negative electrospray ionization modes.

Analisi metabolomica a base di cromomia liquida non mirata del grano di grano di grano

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di

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