Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione APART dell'Accademia austriaca delle scienze (CTH), l'agenzia di tecnologia della Repubblica Ceca nessun progetto. TA04010877 (CTH, VH e GDC), e la Fondazione di scienza ceca (GACR) nessun GA16-01246S (al GDC) del progetto. Ringraziamo W. Tecumseh Fitch per suo suggerimento di usare la crema fissante della protesi dentaria e Ing. P. Liska dal servizio di foresta dell'esercito ceco per il suo aiuto nell'acquisire la larynges di cervi asportato.

Gli esemplari di animali analizzati in questa carta sono stati trattati in conformità con i requisiti standard etici dell'Università Palacky in Olomouc, Repubblica Ceca. Essi derivano da red deer selvaggiamente vivono nelle foreste, che sono stati cacciati dal servizio forestale esercito ceco durante una stagione di caccia regolare.
1. preparazione del campione Hemi-laringe
Nota: Solo i campioni correttamente preparati devono essere utilizzati, come indicato in4 . Rapido congelamento della laringe25 immediatamente dopo l'asportazione e conservazione a-80 ° C riduce al minimo il potenziale di degradazione del tessuto e l'alterazione delle proprietà biomeccaniche e permette di eseguire gli esperimenti in qualsiasi momento conveniente.
<ol><li>
Lo sbrinamento della laringe
	<ol>
<li>Inserire la laringe congelata in due sacchetti di autoclave o eventuali altri sacchetti in plastica con guarnizione impermeabile. Sigillare i sacchetti e metterli in una vasca di acqua riscaldata a 30 ° C fino a quando la laringe è completamente scongelata. La durata necessaria varia da poche ore a più di un giorno, a seconda della dimensione del laringe e temperatura di congelamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pulizia della laringe
	<ol>
<li>Dopo la laringe è scongelata, rimuoverlo dal sacchetto e pulirlo accuratamente con soluzione fisiologica (0,9% NaCl).</li>
		<li>Rimuovere attentamente il tessuto superfluo come applicabile (cioè esterno collo muscoli, osso ioide ecc.) senza danneggiare le strutture principali della laringe e accorciare la trachea a una lunghezza adeguata per il montaggio della laringe in un tubo di alimentazione aria (solitamente ca. 4-5 cm).</li>
		<li>Controllare il tessuto laringeo per potenziali anomalie del tessuto, quali ferite, deformazioni organiche o crepe potenzialmente che accade dal processo di congelamento, che poteva rendere la laringe inadatto per l'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esposizione delle cartilagini tiroide e cricoide
	<ol>
<li>Rimuovere le parti del tessuto muscolo laringeo esterno intorno la cartilagine tiroidea e cricoidea usando un bisturi, esponendo così le cartilagini in preparazione per il taglio sagittale creando hemi-laringe. Questa fase di preparazione è raffigurata in Figura 1A e 1B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Taglio sagittale attraverso la cartilagine tiroidea
	<ol>
<li>Fare un taglio verticale iniziale attraverso la parte anteriore della cartilagine tiroidea.</li>
		<li>Posizionare con attenzione il taglio leggermente più sul lato che sta per essere rimosso, per non danneggiare il popolare vocale che deve rimanere conservato. Se possibile, utilizzare un bisturi per il taglio. Se la cartilagine è ossificata, utilizzare una piccola sega.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Taglio della cartilagine cricoide
	<ol>
<li>Portare il taglio in verticale (inferiormente) da tra le cartilagini arytenoid e poi attraverso la cartilagine cricoide ad un livello circa orizzontale della tacca inferiore della tiroide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rimozione di una piega vocale, creando un'incisione a forma di L nella laringe
	<ol>
<li>Rendere un orizzontale tagliare a partire dall'estremità inferiore del taglio verticale precedentemente fatto nella cartilagine cricoide e portare il nuovo taglio verso la tacca inferiore della tiroide. Anteriormente e piegare il lato della laringe che sta per essere rimosso.</li>
		<li>Fare una verticale tagliare attraverso i tessuti molli sul lato interno della cartilagine tiroidea - attenzione mentre conduceva il taglio tra l'attacco anteriore dei popolare vocali alla cartilagine di tiroide, evitando così danni al popolare vocale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raffinatezza del taglio attraverso la cartilagine tiroidea
	<ol>
<li>Uso un bisturi, una sega o un file, al fine di applicare un taglio proprio dritto in cartilagine tiroidea e ottenere come vicino possibile alla parte anteriore del popolare vocale precedentemente ispezionato.</li>
		<li>Rimuovere anche una piccola parte della cartilagine tiroidea posteriore, al fine di creare spazio per inserire il Polo per avvicinare arytenoid cartilagine e così il vocal fold (Vedi sotto). Questa fase di preparazione è raffigurata in Figura 1 e D 1. Nota: A seconda della domanda di ricerca, esposizione completa del popolare complesso vocale può essere necessaria per consentire la visibilità dall'alto. In tal caso, le strutture sopra la piega vocale (vera) (cioè, la ventricolare o vestibolare piega, come applicabile dato l'anatomia dell'esemplare) dovrebbero essere rimosso. In alcuni esemplari il tessuto laringeo molle interno sopra le corde vocali potrebbe perdere la connessione con la cartilagine tiroidea e interferisce con il popolare vocale durante la vibrazione, causando potenzialmente spurie modelli oscillatorie (per lo più irregolari). In tal caso attenta rimozione di quel tessuto è inevitabile.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55303/55303fig1.jpg"> Figura 1 : Montaggio e preparazione di Hemi-laringe. (A) e (B) ripuliti laringe esemplare, Vista mediale e posteriore, prima della rimozione del popolare vocale di sinistra; (C) e (D) preparati hemi-laringe con incisione a forma di L (sinistra popolare vocale rimosso), mediale e dalla vista posteriore. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55303/55303fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

2. esperimento Hemi-laringe
<ol><li>
Installazione di Hemi-laringeo
	<ol>
<li>Utilizzare un tubo di alimentazione dell'aria che trasporta l'aria riscaldata e umidificata nella laringe.</li>
		<li>Costrutto due disposti perpendicolarmente lastre trasparenti come una sostituzione per pezzi rimossi laringei.</li>
		<li>Punte di uso 4 per aumentare la stabilità della laringe e creazione di una configurazione corretta pre-phonatory laringe di avvicinare la piega vocale rimanente per la lastra di vetro verticale (Vedi Figura 2A). Nota: Teoricamente, le corde vocali anche potrebbe essere addotta da suture e pesi su una puleggia-leva sistema 26 . Tuttavia, tale approccio è, per la migliore conoscenza di questi autori, non ancora stato tentato per una preparazione hemilarynx.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55303/55303fig2.jpg">
Figura 2 : Installazione di Hemi-laringe. (A) strutture di sostegno: aria tubo di alimentazione, arrangiamento di piastra di vetro a forma di L, rebbi di adduzione. (B) montata preparazione hemi-laringe con rebbi di adduzione. (C) e (D) primi piani di hemi-laringe-preparazione, visto dal lato e dalla parte superiore, rispettivamente. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55303/55303fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2"><li>
Montaggio hemi-laringe
	<ol>
<li>Coprire il tubo di alimentazione dell'aria con fissativo protesi crema e montare la laringe utilizzando la parte restante della sua trachea. La crema fissante funziona come un adesivo e chiude gli spazi potenziali, creando così una tenuta ermetica.</li>
		<li>Fissare la trachea con una cinghia o una fascetta di serraggio di plastica.</li>
		<li>Anche coprire i bordi del taglio attraverso la cartilagine tiroidea con il fissativo crema, evitando di spalmare la crema fissante il popolare vocale o l'interno dei tessuti molle del laringeo.</li>
		<li>Fissare le piastre trasparente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stabilizzazione della cartilagine tiroidea, adduzione del popolare vocale usando i rebbi
	<ol>
<li>Utilizzare i rebbi del complesso popolare vocale alla piastra e stabilizzare la cartilagine tiroidea.</li>
		<li>Dopo la crema fissante è impostato, è possibile applicare il flusso d'aria al fine di stabilire l'oscillazione del popolare vocale e controllare per eventuali perdite tra hemi-laringe e le lastre di vetro.</li>
		<li>Sigillare le lacune eventualmente presenti in natura aggiungendo più crema fissante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La preparazione di hemi-laringe condivide i vantaggi dell'installazione "convenzionali" laringe asportata (completo): tale approccio sperimentale, possono essere fisiche e fisiologiche condizioni al contorno e parametri (quali la pressione subglottidale o allungamento del popolare vocale) abbastanza ben controllata. Il comportamento della hemilarynx è omologo a quella di una laringe completa con una perfetta laterale simmetria, con l'eccezione che magnitudini di alcuni parametri (ad es., portata d'aria, pressio...

Voce viene in genere creato dalla vibrazione del tessuto laringeo (principalmente le corde vocali), che converte un flusso d'aria costante, fornito dai polmoni, in una sequenza di impulsi di flusso d'aria. La forma d'onda di pressione acustica (vale a dire, il suono primario) emergono da questa sequenza di impulsi di flusso acusticamente eccita il tratto vocale che li filtra, e il suono risultante è irradiato dalla bocca e (in una certa misura) dal naso1 . La composizione spettrale del suono generato è in gran parte influenzata dalla qualità della vibrazione del popolare vocale, sotto l'egida della laringe biomeccanica e interazioni con il flusso d'aria tracheale2. Sia in una clinica e un contesto di ricerca, documentazione e valutazione delle vibrazioni del popolare vocale è quindi di interesse soprattutto in quando si studia la produzione vocale.
In esseri umani, indagine endoscopica diretta della laringe durante la produzione del suono in vivo è impegnativo, ed è praticamente impossibile in mammiferi non umani, dati mezzi tecnologici attuali. Pertanto e in ordine alla garanzia attentamente controllato fisico e/o fisiologico sperimentale condizioni al contorno, l'uso di asportato larynges3,4 è in molti casi un'adeguata sostituzione per indagine su in vivo meccanismi di produzione di voce.
Vibrazione del popolare vocale è un fenomeno complesso tridimensionale5. Mentre i metodi di indagine convenzionali come endoscopia laringea (in vivo) o preparazioni laringe asportata in genere forniscono solo una superior vista dei popolare vocali vibrante6, non consentono per analisi tridimensionale completa di movimento del popolare vocale. In particolare, nella vista superiore i margini inferiori (caudali) dei popolare vocali sono invisibili durante una parte importante del ciclo vibratorio. Ciò è dovuto il ritardo di fase tra il inferior (caudale) e il bordo superiore (craniale) dei popolare vocali, un fenomeno che si verifica in genere durante popolare vocale oscillazione5. Come diretta evidenza empirica per il backup risultati da modelli matematici e fisici è scarso, conoscenza della geometria e movimento del canto inferiore piegare bordo7e quindi la geometria del canale subglottidale8,9 , 10 è cruciale per comprendere meglio l'interazione tra il flusso d'aria laringeo, il tessuto popolare vocale e la risultante delle forze e pressioni11,12. Un altro aspetto della vibrazione del popolare vocale che è nascosto dal consueta superior vista è la profondità verticale (caudo-craniale) del contatto tra le due corde vocali. La profondità di contatto verticale è relativo allo spessore verticale dei popolare vocali, che è un indicatore potenziale del registro vocale usato in canto ("petto" vs "falsetto" registro)13,14.
Al fine di superare le carenze delle preparazioni convenzionali laringe asportata (completo), può essere utilizzato un programma di installazione di cosiddetto hemi-laringe, dove metà della laringe è rimosso, facilitando così la valutazione delle caratteristiche vibratorie delle rimanenti del popolare vocale in tre dimensioni. Sorprendentemente, dopo l'introduzione di questa configurazione nel 1960s15 una convalida iniziale del concetto nel 199316, non molti laboratori hanno eseguito esperimenti con questo promettente approccio sperimentale17,la18 ,19,20,21,22,23. Una spiegazione per questo potrebbe essere trovata nelle difficoltà di creazione di una preparazione valida hemi-laringe. Mentre la preparazione convenzionale asportato laringe (completo) è ben documentato4, nessun tali istruzioni approfondite sono ancora disponibili per la creazione di un setup di hemi-laringe. È dunque lo scopo di questa carta per fornire un tutorial per la creazione di una configurazione riproducibili in modo affidabile hemi-laringe, completata da risultati sperimentali da esemplari di cervo.
Un programma di installazione di hemi-laringe condivide molte caratteristiche con un setup di laringe asportata "convenzionali", come apparecchiature di misurazione, ad alta velocità o altra tecnologia di imaging per documentare adeguatamente le vibrazioni delle strutture laringee durante la generazione del suono, o corretto fornitura di aria riscaldata e umidificata. Queste considerazioni generali di setup sono descritte in dettaglio in un libro capitolo4 e una relazione tecnica dal centro nazionale di voce e discorso24. Reiterazione di queste istruzioni potrebbe essere oltre la portata di questo manoscritto. Qui, solo le direttive specializzate per la generazione di un programma di installazione di hemi-laringe sono presentate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Surgical blades</td>
			<td >Surgeon</td>
			<td >Jai Surgical Ltd., New Delhi, India</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saw</td>
			<td >Hand saw (Lux, 150 mm length)</td>
			<td >Lux, Wermelskirchen, Germany</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermometer</td>
			<td >Testo 922</td>
			<td >Testo Ltd., Hampshire, UK</td>
			<td >K-type Probe, Operating temperature -20 to +50 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave bags</td>
			<td >Autoclave bags</td>
			<td >vwr.com, VWR International s.r.o., Stribrna Skalice, Czech republic</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conductive glass plates</td>
			<td >Custom made</td>
			<td >UPOL - Joint laboratory of Optics 
			Trida 17. listopadu 50A, 772 07 Olomouc, the Czech Rep.</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixative cream</td>
			<td >Denture fixative cream</td>
			<td >Blend-a-dent Natural</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Prongs and fastening system</td>
			<td >Customized Kanya Al eloxed profiles</td>
			<td >Distributor: VISIMPEX a.s.. Seifertova 33, 750 02 Prerov, the Czech Rep.;</td>
			<td >&#160;Combination of Kanya RVS and PVS fastening systems (http://www.kanya.cz/) + custom made prongs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mounting tube</td>
			<td >Custom made</td>
			<td >UPOL - Joint laboratory of Optics, 
			Trida 17. listopadu 50A, 772 07 Olomouc, the Czech Rep.</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED Light</td>
			<td >Verbatim 52204 LED Lamp</td>
			<td >Mitsubishi Chemical Holdings Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Camera</td>
			<td >Canon EOS1100D</td>
			<td >Canon Inc.</td>
			<td >18-55 mm lens</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Airpump</td>
			<td >Resun LP100</td>
			<td >Resun</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Strobe light</td>
			<td >ELMED Helio-Strob micro2</td>
			<td >ELMED Dr. Ing. Mense GmbH, Heiligenhaus, Germany</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Humidifier</td>
			<td >Custom made</td>
			<td >Voice Research Lab, Dept. Biophysics, Faculty of Sciences, Palacky University Olomouc, Czech republic</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Subglottic tract</td>
			<td >Custom made adjustable subglottic tract</td>
			<td >Voice Research Lab, Dept. Biophysics, Faculty of Sciences, Palacky University Olomouc, Czech republic</td>
			<td >Hampala, V., Svec, Jan, Schovanek, P., and Mandat, D. Uzitny vzor c. 25585: Model subglotickeho traktu. [Utility model no. 25585: Model of subglottal tract] (In Czech) Soukup, P. 2013-27834(CZ 25505 U1), 1-7. 24-6-2013. Praha, Urad prumysloveho vlastnictvi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemi-laryngeal setup for studying vocal fold vibration in three dimensions

La voce degli esseri umani e la maggior parte dei mammiferi non umani viene generata nella laringe attraverso self-sustaining oscillazione dei popolare vocali. Documentazione visiva diretta della vibrazione del popolare vocale è impegnativo, specialmente in mammiferi non umani. In alternativa, laringe asportata esperimenti forniscono la possibilità di indagare la vibrazione del popolare vocale in condizioni fisiologiche e fisiche controllate. Tuttavia, l'uso di una laringe completa fornisce semplicemente una vista dall'alto dei popolare vocali, escluse parti cruciali delle strutture oscillante da osservazione durante la loro interazione con le forze aerodinamiche. Questa limitazione può essere superata utilizzando un programma di installazione di hemi-laringe dove metà della laringe è metà-sagittally rimosso, fornendo sia una superior e una vista laterale del popolare vocale rimanente durante l'oscillazione autosostenuto.
Qui, una guida passo passo per la preparazione anatomica delle strutture hemi-laringeo e il loro montaggio su banco di laboratorio è dato. Fonazione esemplare della preparazione hemi-laringe è documentato con alta velocità dati video catturati da due telecamere sincronizzate (viste superiore e laterale), visualizzando tridimensionale del popolare vocale movimento e area di contatto corrispondente variabili nel tempo. La documentazione dell'installazione hemi-laringe in questa pubblicazione faciliterà l'applicazione e affidabile ripetibilità nella ricerca sperimentale, fornendo gli scienziati vocale con il potenziale per comprendere meglio la biomeccanica della produzione vocale.

Illustrazioni della preparazione hemi-laringe e suo montaggio sul tubo di alimentazione dell'aria, come indicato nella sezione precedente, sono forniti in Figura 1 e Figura 2, rispettivamente.
Documentazione di vibrazione del popolare vocale da due angolazioni
Oscillazione autosufficiente indo...

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Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

Questo documento introduce un protocollo per la preparazione di campioni di hemi-laringe facilitando una vista multi-dimensionale di vibrazione del popolare vocale, al fine di indagare i vari aspetti biofisici della produzione vocale negli esseri umani e non umani mammiferi.

Hemi-laringeo Setup per lo studio delle vibrazioni del popolare vocale in tre dimensioni

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual ...

hemi-laryngeal-setup-for-studying-vocal-fold-vibration-three

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  Palacky University Olomouc. Questo documento introduce un protocollo per la preparazione di campioni di hemi-laringe facilitando una vista multi-dimensionale di vibrazione del popolare vocale, al fine di indagare i vari aspetti biofisici della produzione vocale negli esseri umani e non umani mammiferi.

Video: Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Basato su chip tridimensionale coltura cellulare in perfuso Micro-bioreattori

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

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Biologia

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

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The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

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Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

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Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

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Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

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Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

La coltivazione di<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In tre dimensioni in laboratorio

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Approcci quantitativi per studiare le strutture cellulari e la morfologia delle orgine in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The Quadruple&#160;checkerboard, also called the Q-checkerboard, aims at maximizing the number of possible combinations that can be obtained between four drugs in one experiment to minimize the time and work needed to accomplish the same results with other protocols. This protocol is based on the simple micro dilution technique where the drugs are diluted and combined together in several 96-well plates.
In the first set of 96-well plates, Muller-Hinton broth is added followed by the first required drug (e.g., Cefotaxime here) to serially dilute it. After the first step is done, another set of 96-well plates is used to dilute the second drug (e.g., Amikaci), which will be transferred by removing a specific volume of drug 2 and put in the corresponding wells in the first set of 96-well plates that contains drug one. The third step is done by adding the required concentrations of the third drug (e.g., Levofloxacin), to the appropriate plates in the initial set containing combination of drug 1 and 2. The fourth step is done by adding the required concentrations of the fourth drug (e.g., Trimethoprim-sulfamethoxazol) into the appropriate plates in the first set. Then, E. coli ESBL bacterial inoculum will be prepared and added.
This method is important to evaluate all the possible combinations and has a wider range of possibilities to be tested furthermore for in vivo testing. Despite being a tiring technique requiring a lot of focus, the results are remarkable and time saving where a lot of combinations can be tested in a single experiment.

This protocol describes how to study all possible combinations that can be obtained between four drugs in one single experiment. This method is based on the standard 96-well plate micro dilution assay and the calculation of fractional inhibitory concentrations (FICs) to evaluate the results.

Quadruple-Checkerboard: una modifica della scacchiera tridimensionale per lo studio delle combinazioni di farmaci

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often require indirect methods due to their small diameter (40-250 nm), which is beneath the diffraction limit of typical light microscopy. We have developed a super-resolution microscopy-based visualization of EVs to bypass the diffraction limit in both two and three dimensions. Using this approach, we can resolve the three-dimensional shape of EVs to within +/- 20 nm resolution on the XY-axis and +/- 50 nm resolution along the Z-axis. In conclusion, we propose that super-resolution microscopy be considered as a characterization method of EVs, including exosomes, as well as enveloped viruses.

Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) is used to bypass the typical diffraction limit of light microscopy and to view exosomes at the nanometer scale. It can be employed in both two and three dimensions to characterize exosomes.

Microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta di vescicole extracellulari in tre dimensioni

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display intelligent behaviors. In both natural and artificial systems, learning is the adaptive updating of system parameters based on new information, and intelligence is a measure of the computational process that facilitates learning. Stentor coeruleus is a unicellular pond-dwelling organism that exhibits habituation, a form of learning in which a behavioral response decreases following a repeated stimulus. Stentor contracts in response to mechanical stimulation, which is an apparent escape response from aquatic predators. However, repeated low-force perturbations induce habituation, demonstrated by a progressive reduction in contraction probability. Here, we introduce a method for quantifying Stentor habituation using a microcontroller board-linked apparatus that can deliver mechanical pulses at a specified force and frequency, including methods for building the apparatus and setting up the experiment in a way that minimizes external perturbations. In contrast to the previously described approaches for mechanically stimulating Stentor, this device allows the force of stimulation to be varied under computer control during the course of a single experiment, thus greatly increasing the variety of input sequences that can be applied. Understanding habituation at the level of a single cell will help characterize learning paradigms that are independent of complex circuitry.

Studying Habituation in Stentor coeruleus

We introduce a method for quantifying Stentor habituation using a microcontroller board-linked apparatus that can deliver mechanical pulses at a specified force and frequency. We also include methods for assembling the apparatus and setting up the experiment in a way that minimizes external perturbations.

Studiare l'assuefazione in Stentor coeruleus

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display ...