We would like to acknowledge the technical assistance of Kristina Jurcic in the University of Western Ontario MALDI MS facility, as well as the National Sciences and Engineering Council (NSERC) for funding this work. The authors would also like to acknowledge the Caprioli group (Vanderbilt University, TN) and Chaurand group (Universit&#233; de Montreal, QC) for their advice in optimizing the sublimation technique presented in this manuscript.

Tutte le procedure di gestione degli animali descritti di seguito aderire alla University of comitato cura degli animali del Western Ontario (2016-014). 1. Preparazione del tessuto e sezionamento <ol><li> Estratto tessuto cerebrale di ratto attraverso un processo noto come &quot;Fresh congelati estrazione&quot; (FFE). <ol><li> Euthanize il topo con una dose eccessiva di sodio pentobarbital e monitorare riflessi negli arti. Una volta che tutti i riflessi hanno cessato, recidere il capo del ratto usando una ghigliottina. </li><li> Attenzione separare i muscoli e altri tessuti dal cranio con un bisturi. Utilizzare pinze osso-taglio per rompere il cranio per esporre il cervello, partendo dalla base del cranio (occipitale) alla porzione anteriore. </li><li> Una volta che il cervello è esposto, scoop accuratamente fuori con una spatola chirurgica e collocare immediatamente in ghiaccio secco schiacciato per congelamento flash. NOTA: Il cervello sarà molto malleabile. Pertanto, prestare la massima attenzione quando si posiziona il cervello sughiaccio secco. Se il cervello è schiacciato o premuto contro una superficie, altera la sua forma e congelare in quella posizione. </li></ol></li><li> Rimuovere il tessuto fresco congelato (non perfusi con formaldeide o incorporato in OCT) da - 80 ° C freezer e luogo in ghiaccio secco. </li><li> Mettere alcune gocce di acqua su un supporto criostato e posto su entrambi ghiaccio secco o la barra di congelamento criostato. Premere il tessuto leggermente sul supporto criostato come si comincia a congelare e tenere premuto fino a quando l&#39;acqua gela intorno alla base del tessuto ed ancora in posizione. Aggiungere acqua supplementare per fissare ulteriormente il tessuto sul supporto se necessario. NOTA: dell&#39;acqua invece dell&#39;OCT mezzi per il tessuto di montaggio al fine di evitare la contaminazione del tessuto con composti che possono influenzare il rilevamento del segnale desiderato. </li><li> tessuti posizione nel criostato. tessuto Sezione fino alla posizione anatomica desiderata. Assicurarsi che lo spessore di taglio è compresa tra 8-12 micron. NOTA: quando sezionare il tessuto in criostato comunaledispositivi, è imperativo che i materiali separati come lame, spazzole, barre antirollio, e titolari essere utilizzati al fine di evitare la contaminazione con l&#39;incorporamento composti. L&#39;interno del criostato deve essere pulito anche accuratamente con etanolo prima dell&#39;uso. </li><li> Utilizzando la barra antirollio criostato, lentamente sezione appiattita sezioni di tessuto. Fori o segni sul tessuto può verificarsi se il posizionamento roll bar non è corretto o lama è ottuso. Spostare il tessuto verso il centro di affettare piattaforma usando pennelli puliti. </li><li> Montaggio <ol><li> Congelare diapositive conduttive o piastre di metallo inserendoli nel criostato mentre affettare. Quando la slitta è completamente congelato, spostare accuratamente il tessuto sezionato sulla superficie conduttiva del vetrino utilizzando pennelli puliti. Una volta che tutte le sezioni di tessuto sono posizionati correttamente sul vetrino, mettere un dito sotto il vetrino, di fronte al tessuto, e premere fino a quando la sezione si scioglie. NOTA: Le sezioni possono piegare o arricciare durante il processo di scongelamento quandoUtilizzando questo metodo di montaggio. Questo può essere ridotto mantenendo la slitta nella criostato quando scongelamento del tessuto. Se questi problemi diventano problematici, in alternativa, warm-mount metodo è elencato di seguito. </li><li> In alternativa, prendere una temperatura ambiente di indio-stagno Oxide (ITO) slitta (o piastra di metallo) e premere leggermente verso il basso sezione di tessuto congelato sulla superficie della piattaforma affettare, lato conduttivo verso il basso. Questo porterà alla scongelamento sezione di tessuto in modo uniforme sulla superficie del vetrino con poco arricciatura o ripiegamento del tessuto. NOTA: La condensa può apparire sotto la sezione per il montaggio si utilizza questo metodo, che possono portare alla perdita di alcune proteine ​​e lipidi. </li></ol></li><li> Collocare i vetrini con il tessuto in un essiccatore per 5 - 10 minuti. </li></ol> 2. sublimatore Apparato Set-up NOTA: Effettuare queste operazioni in una cappa aspirante. <ol><li> Inserire un bagno di sabbia in un contenitore di alluminio su una piastra calda, con la piastra su un elevatore di metallo forbicedi un&#39;adeguata superficie (cioè maggiore della piastra). Accendere la piastra calda e impostare la temperatura a 140 ° C. NOTA: Il punto di fusione per matrice DAN è compresa tra 187-190 ° C. Non superare questa temperatura sulla piastra. <ol><li> Se la piastra è dotata di una sonda di retroazione di temperatura, utilizzarlo per monitorare la temperatura della sabbia tutto l&#39;esperimento e garantire la coerenza della temperatura. Questa caratteristica può aiutare con l&#39;esperimento riproducibilità attraverso vari esperimenti di sublimazione. NOTA: Il bagno di sabbia deve essere contenuta all&#39;interno di un contenitore di alluminio come un contenitore di vetro possono rompersi a temperature elevate. </li></ol></li><li> Mettere 300 mg di matrice DAN sulla superficie inferiore dell&#39;apparecchio sublimazione. Posizionare la matrice al centro dell&#39;apparato e sparsi in uno strato uniforme nella larghezza approssimativa e la lunghezza della slitta essendo sublimata. ATTENZIONE: matrix DAN è tossico. Pertanto, è importante indossare guanti, maschere, e sicurezzaocchiali di protezione in ogni momento durante la manipolazione della matrice in polvere. DAN deve essere conservato al buio in quanto è sensibile alla luce. </li><li> Nastro una piastra di metallo sulla superficie interna dell&#39;apparecchio con la piastra di entrare in contatto diretto con la parte inferiore del condensatore al fine di garantire una distribuzione uniforme di raffreddare tutta la superficie del vetrino durante sublimazione temperatura. In alternativa, la sabbia sul fondo del condensatore al fine di garantire una superficie piana. <ol><li> Posizionare il nastro lungo i bordi esterni della piastra e aderire ai lati del vetro interno. Se il nastro viene posizionato sotto la piastra e aderisce al fondo della superficie di vetro interna, la distribuzione della temperatura non può essere uniforme e può causare distribuzione matrice uniforme su tutta la superficie del vetrino. </li><li> Nastro uno spazio (test) scivolare diagonalmente attraverso la superficie della piastra metallica con il nastro nuovo posto sui bordi esterni della slitta. </li></ol></li><li> Collegare le porzioni superiore e inferiore dell&#39;apparecchiatura, with un O-ring in gomma nel mezzo per garantire una tenuta completa. </li><li> Inserire un metallo giunto cardanico attorno al centro dell&#39;apparato e serrare vizi fino alla metà superiore e inferiore dell&#39;apparecchiatura sono sigillati ermeticamente insieme. Mettere in O-ring di metallo sopra il bagno di sabbia. </li><li> Prendete una manciata di ghiaccio tritato e metterlo nel condensatore. Riempire condensatore ¼ a ½ con acqua fredda per creare granita di ghiaccio. La fanghiglia ghiaccio raffreddare la piastra metallica all&#39;interno dell&#39;apparecchio e successivamente il vetrino aderito ad esso. Attendere almeno 5 minuti per la temperatura di raggiungere uno stato stazionario. </li><li> Versare 300 mL di etanolo nel contenitore trappola fredda e posizionare il vetro nel contenitore. Goccia 2 - 3 piccoli pezzi di ghiaccio secco in etanolo nel fondo del contenitore trappola fredda. L&#39;ingresso trappola fredda ha un tubo di vetro in esecuzione al fondo del cilindro, mentre l&#39;uscita no. </li><li> Collegare la pompa del vuoto al freddo uscita trappola utilizzando tubi in gomma. Utilizzare un altro pezzo di gommatubo per collegare l&#39;ingresso trappola fredda all&#39;apparato sublimazione. Assicurarsi che il tubo sia ben fissato con fascette metalliche, se disponibile. </li><li> Utilizzare la pompa a vuoto per fornire un vuoto di 30 - 50 mt. Lasciare che la pompa di funzionare per almeno 5 minuti per il raggiungimento dell&#39;equilibrio di pressione. Morse su U-ring di apparecchi sublimazione possono essere serrati nuovamente dopo la pompa da vuoto viene attivato a causa della riduzione della pressione nell&#39;apparecchiatura. NOTA: Si raccomanda che un vacuometro essere collegato alla pompa per monitorare la pressione di vuoto durante l&#39;esperimento e testare perdite in pressione al fine di ottenere la massima riproducibilità possibile tra esperimenti. Tuttavia, la maggior parte delle pompe sono progettati per mantenere una pressione costante, quindi l&#39;indicatore non sia essenziale per gli utenti esperti. Inoltre, il grasso guarnizione di vuoto può essere utilizzato per aiutare a mantenere la pressione di vuoto. </li></ol> 3. sublimazione <ol><li> Assicurarsi che la temperatura del bagno di sabbia ha stabilzata a 140 ° C e che l&#39;apparecchio sia fissato nella O-ring di metallo sopra il bagno di sabbia con tutti i tubi collegati e il vuoto acceso. </li><li> Impostare il timer per 7 minuti ma non avviare il timer. Lentamente sollevare la forbice e sabbia vasca fino all&#39;apparato sublimazione finché il giunto a U del sublimatore è ben sopra l&#39;O-ring di metallo. Questo spazio permette di regolare l&#39;apparecchio sulla sabbia. <ol><li> Premere rapidamente il sublimatore delicatamente sulla superficie di sabbia per assicurare che l&#39;apparecchio è seduto uniformemente sulla sabbia, e quindi iniziare immediatamente il timer. </li></ol></li><li> Quando il timer suona, spegnere la pompa del vuoto e con attenzione abbassare il sollevatore a forbice fino alla sublimatore non è a contatto con il bagno di sabbia ed è seduto saldamente l&#39;O-ring in metallo. <ol><li> Lentamente allentare la valvola di micro-sfogo per scaricare la pressione nell&#39;apparato. Allentare la fascetta metallica attorno al tubo di gomma dell&#39;apparato sublimazione e lentamente cominciano ad allentare il tubo. Una volta che il rutubo bBER è stato allentato un po &#39;, piegare il tubo da un lato per consentire pressione residua di fuoriuscire. </li><li> Quando ritorna a pressione ambiente, rimuovere con attenzione il tubo di gomma dall&#39;apparato sublimazione. </li></ol></li><li> Allentare i vizi sul giunto cardanico dell&#39;apparecchiatura e rimuovere. separare con cautela le due metà dell&#39;apparato sublimazione ed estrarre il vetrino dalla parte superiore del vetro interno. Esaminare scivolo per confermare una distribuzione uniforme della matrice. NOTA: Se matrice è irregolare, la matrice in polvere in fondo alla sublimatore può essere riposizionato o dell&#39;apparato sublimatore può essere riposizionata nella sabbia per la diapositiva successiva. Il processo di sublimazione può essere ripetuto più volte usando la stessa matrice, tuttavia, la matrice finirà per diventare più scura da calore ripetuta e la quantità di polvere diminuirà tale che il tempo sublimazione dovrà essere lievemente modificate per compensare. Per questa ragione, è importante controllare la quantità di matrice being sublimato dopo ogni esperimento per garantire la coerenza nella deposizione di matrice tra le diapositive </li><li> Se la distribuzione e la quantità di matrice sublimato è sufficiente, il nastro una nuova diapositiva con il tessuto sulla parte interna del sublimatore e ripetere Sezione 3. NOTA: Per controllo di qualità (QC) scopi, la quantità di matrice sublimato può essere misurata dopo ogni esperimento pesando il vetrino prima e dopo sublimazione e dividendo il peso di matrice sublimato con la superficie del vetrino 2, va notato che a causa della mancanza di precisione della maggior parte delle scale oltre 4 punti decimali e la variabilità tra le scale, queste misure dovrebbero essere essere utilizzato solo una guida per la deposizione ottimale della matrice piuttosto che un mezzo completamente quantificabili di controllo di qualità a meno che non si utilizzi un equilibrio di alta precisione (si veda la Figura 3). </li></ol> 4. tessuto di stoccaggio / reidratazione <ol><li> Dopo sublimazione, negozio scivola in un contenitore sigillato o piccola cassette in sacchetto di plastica sigillato. </li><li> Incubare i vetrini a -20 ° C freezer per 2 ore o durante la notte. NOTA: L&#39;obiettivo del processo di congelamento è di agire come una fase di reidratazione per il desorbimento di materiali tessuti nella matrice. Il processo di congelamento è stato anche dimostrato di prevenire il degrado dei segnali di lipidi per fino a 1 settimana, se conservato a -80 ° C 12. Per questo motivo, la quantità di tempo i campioni vengono conservati nel congelatore può essere variato in una certa misura per soddisfare le esigenze dello sperimentatore senza alterare significativamente rilevazione del segnale (come osservato nel nostro laboratorio). Tuttavia, abbiamo notato un po &#39;di scolorimento della matrice quando i campioni sono congelati per più di 24 ore a -20 ° C. Così, si consiglia l&#39;imaging del tessuto sublimato prima di quel momento o conservare il tessuto a -80 ° C per periodi di incubazione più lunghi. </li><li> Estrarre i vetrini dal congelatore (e contenitore) e posto in un essiccatore per 5 - 10 minuti. </li></ol> 5. Imaging e AANALISI <ol><li> Estrarre i vetrini da essiccatore e applicare standard strumento per garantire l&#39;accuratezza di massa dello strumento MALDI durante l&#39;imaging. Il tipo di standard varierà secondo strumentazione. Gli standard sono generalmente applicati in modo uniforme su tutta scorrevole, tessuto circostante per essere ripreso (Figura 3D). </li><li> Inserisci diapositiva in strumento MALDI e seguire le istruzioni del produttore per esperimenti di imaging (metodi strumento dovrebbe essere ottimizzati per una 1.000 - 2.000 range di massa). Risultato rappresentativo (figura 4) è stata acquisita in modalità negativa reflectron con un raster 70 micron e 20 colpi / spettro (acquisizione in tempo ~ 2 h). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dettagli Questo lavoro un protocollo standardizzato di matrice sublimazione sul tessuto per la rilevazione di lipidi carichi negativamente, come gangliosidi, in esperimenti MALDI IMS. Preparazione del campione per MALDI IMS è altamente variabile e deve essere personalizzato per soddisfare le proprietà uniche del analita di interesse. L&#39;applicazione della matrice sulla superficie del campione di tessuto è un aspetto cruciale del processo di preparazione del campione per quanto riguarda la qualità dei risultati in...

Matrix-Assisted Laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) sta diventando una tecnica molto ricercato per la visualizzazione della distribuzione spaziale dei lipidi, peptidi e proteine ​​su superfici campione intatte. MALDI IMS era precedentemente conosciuto come una tecnica analitica per analiti pre-purificato, ma negli ultimi anni, ha attirato l&#39;attenzione in molte altre discipline causa della capacità di combinare la precisione della spettrometria di massa ad alta risoluzione punti di riferimento anatomici / visivi senza bisogno di alcuna etichettatura esterna. Come la piscina scientifica dei ricercatori che utilizzano questa tecnica continua a crescere, vi è una maggiore necessità di standardizzati, protocolli facili da seguire per assistere nello sviluppo e ottimizzazione di esperimenti IMS. I gangliosidi, un gruppo di lipidi di membrana altamente abbondanti nel sistema nervoso centrale, sono ideali per esperimenti MALDI IMS come loro ubicazione, incorporato all&#39;interno della membrana, rende certi species impossibile da rilevare con i convenzionali Immuno-etichettatura. Inoltre, abbiamo dimostrato, utilizzando MALDI IMS, che questi lipidi, che funzionano come modulatori di segnalazione cellulare, tra le altre cose, hanno modelli di distribuzione anatomica unici nel cervello dei roditori sani che vengono modificate dopo lesione cerebrale 3, 4, 5. I gangliosidi sono situati in un range di massa più elevata rispetto alla maggior parte delle specie di lipidi, e sono quindi più adatto alla piattaforma di imaging MALDI. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig1.jpg" /> Figura 1: Flusso di lavoro di MALDI IMS Experiment. Diagramma dello schema generale di un esperimento MALDI IMS tramite sublimazione. Tessuti congelati a -80 ° C è sezionato in un criostato e 10 sezioni micron sono disgelo montato su vetrini ITO conduttivo. Il vetrino viene quindi posto in un essiccatore fino sublimazione. Slides sono inseriti nell&#39;apparecchiatura sublimazione e uno strato uniforme di matrice viene applicata alla superficie del campione di tessuto. I campioni sono congelati durante la notte in un congelatore C -20 ° poi messo in essiccatore per 10 minuti. Una volta applicate norme, i campioni vengono inseriti nello strumento MALDI cui un laser è diretto attraverso il tessuto causando molecole desorbiti nella matrice a ionizzare. Gli ioni viaggiano lungo un tubo di volo e separati in base alla loro massa (tempo di volo / TOF) fino a raggiungere il rilevatore. Le informazioni sulla abbondanza ionica di analiti in un intervallo predeterminato di massa-carica (m / z) viene visualizzata come sia un&#39;immagine molecolare e spettro di massa. Questi dati possono essere utilizzati sia per visualizzare e quantificare l&#39;abbondanza ionica dell&#39;analita di interesse all&#39;interno del tessuto con immagini stampate. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> preparazione del campioneper MALDI IMS è molto variabile in ogni fase del processo deve essere personalizzato per gli analiti di interesse. La caratteristica distintiva di esperimenti MALDI-base è l&#39;uso di un rivestimento a matrice depositata sulla superficie del campione prima dell&#39;analisi. Oltre al ruolo di assorbire e trasferire energia di radiazione dal laser durante il processo di ablazione, la matrice serve anche ad isolare vari analiti dal campione, facilitando così l&#39;analisi di composti di interesse 6, 7. applicazione omogenea della matrice alla superficie del campione è il passo più importante nel processo di preparazione del campione. Deposizione di matrice non corretta può portare a grandi formazioni eterogenee cristallo matrice e lo sviluppo di artefatti, ionico segnale basso, e scarsa riproducibilità 7. A causa della affinità di alcune matrici per isolare analiti specifici, il tipo di matrice selezionata per un esperimento puòalterare in modo significativo l&#39;esito. Le matrici utilizzate per l&#39;imaging di proteine ​​e peptidi spesso differiscono da quelli utilizzati per i lipidi di imaging e il processo è ulteriormente complicata dalla necessità di procedure aggiuntive come lavaggio e reidratazione passaggi per rilevare correttamente i segnali dal tessuto. Sebbene esistano fasi di lavaggio per la valorizzazione dei segnali lipidi 8, non sono un prerequisito per la rilevazione della maggior parte delle specie di lipidi. Quando si seleziona una matrice per un esperimento di imaging lipidi, è importante considerare la polarità del lipide di interesse come questo restringere la gamma di matrici adatte. Ad esempio, gangliosidi contengono residui di acido sialico che conferiscono loro una polarità negativa complessiva. Ci sono una serie di matrici che possono efficacemente desorbire e ionizzare gangliosidi dal tessuto; Tuttavia, fattori come picchi matrice derivata nello spettro e stabilità della matrice sotto vuoto devono essere presi in considerazione. 1,5-diaminonapthalene (DAN matrice) è sufficientemente stabile in condizioni di vuoto strumento per la maggior parte delle applicazioni di imaging e ha dimostrato un alto grado di sensibilità per lipidi desorbimento e può essere utilizzato per l&#39;analisi dei lipidi in entrambe le modalità di ioni positivi e negativi 2. matrix DAN, rispetto ad altre matrici negative lipidico affinità come acido diidrossibenzoico (DHB), 9-aminoacridine (9-AA), e 5-cloro-2-mercaptobenzotiazolo (CMBT), era in grado di desorbire più efficiente gangliosidi di cervello di ratto tessuto in modalità ioni negativi (manoscritto in preparazione). Selezione del metodo appropriato di deposizione di matrice è di uguale importanza alla selezione matrice stessa. Wet metodi di deposizione di matrice in cui la matrice solida viene disciolto in un solvente organico, e depositato dal pneumatico o spruzzatori o spotters automatizzate, sono particolarmente efficaci per il desorbimento di proteine ​​e peptidi come liquido permea il campione per consentire supplementarection di composti e co-cristallizzazione con la matrice. Sebbene queste tecniche possono essere usate anche per applicazioni lipidici, analita delocalizzazione e formazioni cristalline matrice irregolare sono fenomeni comuni a causa della grande abbondanza e la solubilità dei lipidi in solventi, particolarmente nel tessuto 2, 9. Poiché i lipidi sono facilmente ionizzati dal tessuto, secco tecniche di deposizione di matrice, come sublimazione, offrono una semplice, economica alternativa alla irroratrici che aggirano molti lo svantaggio di queste tecniche. Il successo di sublimazione in esperimenti MALDI IMS è attribuita a caratteristiche quali la morfologia matrice microcristallina che aumenta la superficie di matrice analita vincolante, maggiore purezza della matrice, e la deposizione di matrice omogenea che aumentano la riproducibilità rispetto alle tecniche matrice umido 1, 10. sublimazione involves riscaldamento di una matrice di polvere sotto vuoto immediatamente sotto una superficie del campione raffreddato con conseguente solida transizione in fase gas della matrice polvere seguita dalla deposizione sulla superficie del campione di tessuto. Durante sublimazione, deposizione di matrice può essere controllata da diversi fattori quali tempo, temperatura e pressione per fornire risultati altamente riproducibili. Un singolo esperimento sublimazione può richiedere da 5 a 20 min a seconda del tipo di matrice selezionata, che può essere riutilizzato più volte prima dello smaltimento. L&#39;apparecchio può essere acquistato commercialmente ad una frazione del prezzo delle irroratrici automatizzate ed è facilmente smontato per pulizia e manutenzione. Il basso costo e la relativa semplicità di questa tecnica di deposizione di matrice rendono ideale per i ricercatori che iniziano o in espansione su applicazioni di imaging di lipidi in MALDI IMS. Anche se le informazioni in dettaglio i protocolli per sublimazione dei tessuti per IMS sono stati riportati 11, alcuni protocolli standardizzati esistono which concentrarsi sul flusso di lavoro di base coinvolto con la realizzazione di un esperimento di sublimazione per l&#39;imaging lipidi alta massa in modalità di ioni negativi, il che rende difficile stabilire la tecnica senza vasta tentativi ed errori. Il seguente è un protocollo sperimentale che mira a colmare questa lacuna per la sublimazione della matrice di DAN su sezioni di cervello di ratto per imaging ad alta risoluzione e la rilevazione dei gangliosidi. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig2.jpg" /> Figura 2: sublimazione Apparatus. Fotografico (A) e schema (B) dell&#39;apparecchiatura sublimazione. La pompa per vuoto è collegata con un tubo in gomma per una trappola a freddo riempito con 300 mL di etanolo. La trappola fredda è poi collegata con un tubo in gomma per l&#39;apparato sublimazione. L&#39;apparecchiatura è costituita da due pezzi separati di vetro che sono sigillati insieme con un metallo giunto cardanico. La metà superiore della sublimatorecontiene il condensatore che è riempito di fanghiglia di ghiaccio. La piastra campione viene registrato sul fondo del condensatore, all&#39;interno dell&#39;apparato di vetro sigillato. La metà inferiore del dispositivo sublimazione contiene la matrice DAN, distribuite in modo uniforme di fronte al piatto del campione. Durante sublimazione, l&#39;apparecchio di vetro è posto su un bagno di sabbia riscaldata a 140 ° C da una piastra calda direttamente sotto di esso. La sonda di temperatura aiuta a mantenere una temperatura stabile durante l&#39;esperimento sublimazione attraverso il feedback della temperatura del bagno di sabbia rispetto alla temperatura preimpostata per l&#39;esperimento. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Sublimator</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG3038-01</td><td></td></tr><tr><td>1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D21200&amp;nbsp;</td><td>100 G</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td>CryoStar NX50</td></tr><tr><td>Hot plate with temperature feedback</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>HP88857290</td><td>Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V</td></tr><tr><td>Stainless Steel Jack</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2216479</td><td>10x10</td></tr><tr><td>Cold Trap</td><td></td><td></td><td>Custom built on site</td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>Franklin Electric</td><td>1102180403</td><td>Savant VP100 Two Stage</td></tr><tr><td>Indium-tin-oxide (ITO) Slides</td><td>Hudson Surface Technology</td><td>PSI 1111000</td><td>type II, 1.1 mm/25 each</td></tr><tr><td>MALDI TOF/TOF 5800 Instrument</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2797</td><td>tabletop desiccator</td></tr></tbody></table>

sublimation of dan matrix for the detection and visualization of gangliosides in rat brain tissue for maldi imaging mass spectrometry

La preparazione del campione è la chiave per la rilevazione ottimale e la visualizzazione di analiti a laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) esperimenti di Matrix-assistita. Determinare il protocollo appropriato per seguire tutto il processo di preparazione del campione può essere difficile in quanto ogni passo deve essere ottimizzato per rispettare le caratteristiche uniche di analiti di interesse. Questo processo implica non solo trovare una matrice compatibile che può desorbire e ionizza le molecole di interesse in modo efficiente, ma anche selezionando la tecnica di deposizione matrice appropriata. Ad esempio, una tecnica di deposizione di matrice bagnata, che comporta sciogliendo una matrice in solvente, è superiore per desorbimento maggior parte delle proteine ​​e peptidi, che secchi tecniche di deposizione di matrice sono particolarmente efficaci per la ionizzazione di lipidi. Sublimazione stato segnalato come un metodo altamente efficiente di deposizione di matrice secca per la rilevazione di lipidi nei tessuti di MALDI IMS causa della homogeneity di deposizione di cristalli di matrice e minimale delocalizzazione analita rispetto a molti metodi di deposizione bagnata 1, 2. In generale, si prevede che il campione e la matrice in polvere in una camera sottovuoto con i campioni pressati contro una superficie fredda. L&#39;apparecchiatura viene quindi abbassata in un bagno riscaldato (sabbia o olio), risultando in sublimazione della matrice polvere sulla superficie del campione di tessuto raffreddata. Qui si descrive un protocollo sublimazione usando matrice 1,5-diamminonaftalene (DAN) per il rilevamento e la visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto utilizzando MALDI IMS.

Al termine dell&#39;esperimento sublimazione, le due metà del apparecchio di vetro vengono separati nella cappa e la slitta, registrato al condensatore, può essere rimosso (Figura 3A). A questo punto, il vetrino deve essere esaminato per la distribuzione uniforme della matrice e il tempo, la temperatura, o il posizionamento dell&#39;apparecchio in bagno di sabbia può essere adeguato per la diapositiva successiva. Un esperimento sublimazione successo DAN comporterà un...

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Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Sublimazione di DAN Matrix per la rilevazione e visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto Tissue per MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

sublimation-dan-matrix-for-detection-visualization-gangliosides-rat

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Views.  The University of Western Ontario. A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Video: Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Registered Bioimaging of Nanomaterials for Diagnostic and Therapeutic Monitoring

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end organs. The latter include the lung, RES, and brain and are operative during human immunodeficiency virus type one (HIV-1) infection. Macrophage entry into tissues is notable in areas of active HIV-1 replication and sites of inflammation. In order to assess the potential of macrophages as nanocarriers, superparamagnetic iron-oxide and/or drug laden particles coated with surfactants were parenterally injected into HIV-1 encephalitic mice. This was done to quantitatively assess particle and drug biodistribution. Magnetic resonance imaging (MRI) test results were validated by histological coregistration and enhanced image processing. End organ disease as typified by altered brain histology were assessed by MRI. The demonstration of robust migration of nanoformulations into areas of focal encephalitis provides '"proof of concept" for the use of advanced bioimaging techniques to monitor macrophage migration. Importantly, histopathological aberrations in brain correlate with bioimaging parameters making the general utility of MRI in studies of cell distribution in disease feasible. We posit that using such methods can provide a real time index of disease burden and therapeutic efficacy with translational potential to humans.

Bioimaging methods used to assess cell biodistribution of nanoparticles are applicable for therapeutic and diagnostic monitoring of nanoformulated compounds. The methods described herein are sensitive and specific when assessed by histological coregistration. The methodologies provide a translational pathway from rodent to human applications.

Bioimmagini registrato di Nanomateriali per il monitoraggio diagnostico e terapeutico

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end ...

Ricerca

Bioingegneria

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host of biomolecules from drugs and lipids to N-glycans. Although various sample preparation techniques exist, detecting peptides from formaldehyde preserved tissues remains one of the most difficult challenges for this type of mass spectrometric analysis. For this reason, we have created and optimized a robust methodology that preserves the spatial information contained within the sample, while eliciting the greatest number of ionizable peptides. We have also aimed to achieve this in a cost effective and simple way, thereby eliminating potential bias or preparation error, which can occur when using automated instrumentation. The end result is a reproducible and inexpensive protocol.

This protocol describes a reproducible and reliable method for the sublimation-based preparation of formalin fixed tissue destined for imaging mass spectrometry.

Preparazione ottimale di formalina riparata campioni per Peptide basati su matrice assistita spettrometria totale di desorbimento/ionizzazione Laser i flussi di lavoro di Imaging

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Biochimica

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

MALDI Imaging Mass Spectrometry dei neuropeptidi nella malattia di Parkinson

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Medicina

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Spettrometria di massa, di antigeni glicosfingolipide

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Immunologia e infezioni

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

Estrazione, purificazione e profilatura del ganglioside

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Tutto il corpo Imaging Mass Spectrometry da Infrared Matrix-Assisted Laser desorbimento per ionizzazione elettrospray (IR-Maldesi)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into extracellular plaques of the brain. The A&#946; peptides, composed of 40 amino acids, are generated from amyloid precursor proteins (APP) by &#946;- and &#947;-secretases. A&#946; is deposited not only in cerebral parenchyma but also in leptomeningeal and cerebral vessel walls, known as cerebral amyloid angiopathy (CAA). While a variety of A&#946; peptides were identified, the detailed production and distribution of individual A&#946; peptides in pathological tissues of AD and CAA have not been fully addressed. Here, we develop a protocol of matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) on human autopsy brain tissues to obtain comprehensive protein mapping. For this purpose, human cortical specimens were obtained from the Brain Bank at the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Frozen cryosections are cut and transferred to indium-tin-oxide (ITO)-coated glass slides. Spectra are acquired using the MALDI system with a spatial resolution up to 20 &#181;m. Sinapinic acid (SA) is uniformly deposited on the slide using either an automatic or a manual sprayer. With the current technical advantages of MALDI-IMS, a typical data set of various A&#946; species within the same sections of human autopsied brains can be obtained without specific probes. Furthermore, high-resolution (20 &#181;m) imaging of an AD brain and severe CAA sample clearly shows that A&#946;1-36 to A&#946;1-41 were deposited into leptomeningeal vessels, while A&#946;1-42 and A&#946;1-43 were deposited in cerebral parenchyma as senile plaque (SP). It is feasible to adopt MALDI-IMS as a standard approach in combination with clinical, genetic, and pathological observations in understanding the pathology of AD, CAA, and other neurological diseases based on the current strategy.

Molecular imaging with matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) allows the simultaneous mapping of multiple analytes in biological samples. Here, we present a protocol for the detection and visualization of amyloid &#946; protein on brain tissues of Alzheimer&#39;s disease and cerebral amyloid angiopathy samples using MALDI-IMS.

Visualizzazione dei depositi β amiloide nel cervello umano con Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging spettrometria di massa

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Neuroscienze

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly using MALDI (matrix&#160;assisted laser desorption/ionization)-based analytical techniques. New matrices for small-molecule MSI, which can improve the analysis of low-molecular weight (MW) compounds, are needed. These matrices should provide increased analyte signals while decreasing MALDI background signals. In addition, the use of ultrahigh-resolution instruments, such as Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometers, has&#160;the ability to resolve analyte signals from matrix signals, and this can partially overcome many problems associated with the background originating from the MALDI matrix. The reduction in the intensities of the metastable matrix clusters by FTICR MS can also help to overcome some of the interferences associated with matrix peaks on other instruments. High-resolution instruments such as the FTICR mass spectrometers are advantageous as they can produce distribution patterns of many compounds simultaneously while still providing confidence in chemical identifications. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging. In this work, a protocol for the use of DT for MALDI imaging of endogenous lipids from the surfaces of mammalian tissue sections, by positive-ion MALDI-MS, on an ultrahigh-resolution hybrid quadrupole FTICR instrument has been provided.

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging of small molecules; protocols for the use of DT for the MALDI imaging of endogenous lipids on the surface of tissue sections&#160;by positive-ion MALDI-MS on an ultrahigh-resolution quadrupole-FTICR instrument are provided here.

Dithranol come Matrix Assisted Laser per Matrix desorbimento / ionizzazione Imaging su una trasformata di Fourier Ionorisonanza Ciclotronica Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Biologia

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

MALDI-Mass spettrometria di imaging per le inchieste sui metaboliti in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Root noduli

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

 Advanced MALDI-MSI Mapping of Metabolites in Brain Organoids

Molecular Imaging of Human Brain Organoids Using Mass Spectrometry 

Brain organoid models serve as a powerful tool for studying human brain development and function. Mass spectrometry imaging (MSI), a cutting-edge technology, allows us to map the spatial distribution of diverse molecules such as lipids, sugars, amino acids, drugs, and their metabolites within these organoids, all without the need for specific molecular probes. High-quality MSI data hinge on meticulous sample preparation. Fixatives play a pivotal role, but conventional options such as glutaraldehyde, paraformaldehyde, and cryopreserving such as sucrose may inadvertently impact tissue metabolites. Optimal fixation entails flash freezing in liquid nitrogen. However, for small organoids, a more suitable approach involves transitioning the organoids directly from the incubator into a warmed embedding solution, followed by freezing in dry ice-cooled ethanol. Another critical step is the embedding prior to cryosectioning, which also requires materials compatible with MSI, as traditional options can interfere with matrix deposition and ionization. Here, an optimized protocol for high resolution-MALDI-MSI of human brain organoids is presented, encompassing sample preparation, sectioning, and imaging using mass spectrometry. This method showcases the molecular distribution of small metabolites, such as amino acids, with high mass accuracy and sensitivity. As such, coupled with complementary studies of brain organoids, it can assist in illuminating complex processes governing early brain development, metabolic cell fate trajectories, and distinctive metabolite signatures. Furthermore, it provides insights into the precise locations of molecules within the organoid, enriching our understanding of the spatial organization of 3D brain organoid models. As the field continues to advance, a growing number of studies leveraging MSI to delve into brain organoids and complex biological systems is anticipated, thereby deepening the understanding of the metabolic aspects of human brain function and development.

Molecular Imaging of Human Brain Organoids Using Mass Spectrometry

An advanced method was developed for mass spectrometry imaging (MSI) of brain organoids that allows mapping metabolite distributions within these models. This technology offers insights into brain metabolic pathways and metabolite signatures during early development and in disease, promising a deeper understanding of the human brain function.

Sublimazione di DAN Matrix per la rilevazione e visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto Tissue per MALDI Imaging Mass Spectrometry

Riepilogo

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Bioimmagini registrato di Nanomateriali per il monitoraggio diagnostico e terapeutico

Preparazione ottimale di formalina riparata campioni per Peptide basati su matrice assistita spettrometria totale di desorbimento/ionizzazione Laser i flussi di lavoro di Imaging

MALDI Imaging Mass Spectrometry dei neuropeptidi nella malattia di Parkinson

Spettrometria di massa, di antigeni glicosfingolipide

Estrazione, purificazione e profilatura del ganglioside

Tutto il corpo Imaging Mass Spectrometry da Infrared Matrix-Assisted Laser desorbimento per ionizzazione elettrospray (IR-Maldesi)

Visualizzazione dei depositi β amiloide nel cervello umano con Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging spettrometria di massa

Dithranol come Matrix Assisted Laser per Matrix desorbimento / ionizzazione Imaging su una trasformata di Fourier Ionorisonanza Ciclotronica Mass Spectrometer

MALDI-Mass spettrometria di imaging per le inchieste sui metaboliti in

Molecular Imaging of Human Brain Organoids Using Mass Spectrometry