Name: transient middle cerebral artery occlusion model of neonatal stroke in p10 rats
Uploaded: 2017-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats at JoVE.com

Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.

Tutta la ricerca animale è stato approvato dalla University of California, San Francisco il Comitato Animal Research ed è stata effettuata in conformità con la Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (Dipartimento di Salute e Servizi Umani, Pubblicazione No. 85-23, 1985 ). Gli animali sono stati attentamente monitorati dai veterinari del Comitato Istituzionale UCSF cura degli animali ed uso (IACUC), accreditato dal AAALAC. Una femmina Sprague-Dawley con un 8 giorni di età lettiera (10 nidiate) è stato ottenuto. La madre e suoi cuccioli sono stati dati cibo e acqua ad libitum e alloggiati in una struttura di cura degli animali temperatura e luce controllata con l&#39;arricchimento al giorno, secondo il protocollo IACUC, fino a quando i cuccioli sono stati 10 giorni di vita. Tutti gli strumenti chirurgici utilizzati in questa procedura sono stati sterilizzati in autoclave per garantire la sterilità. La sterilità delle punte strumento viene mantenuto per tutto l&#39;intervento chirurgico. 1. occlusione dell&#39;arteria cerebrale media <ol><li> Pesare il cucciolo e assicue che è il peso corretto (19-21 g). Anestetizzare il cucciolo in 3% isoflurano in 100% O 2 e assicurarsi che non v&#39;è alcuna risposta ad una presa piede. Mantenere la temperatura superficiale del corpo tra 35,5 ° C e 37 ° C con l&#39;uso di una piastra elettrica sotto la fase chirurgica. </li><li> Fissare l&#39;animale in posizione supina con nastro attraverso le zone di spalla. Utilizzando tamponi di cotone sterile, tamponare la zona cervicale anteriore con soluzione di povidone-iodio seguito da un tampone di 70% di etanolo in acqua bidistillata, alternando ogni soluzione per quattro tamponi totali. </li><li> Localmente infiltrarsi bupivacaina 0,25% nel sito di incisione previsto. Utilizzando uno stereoscopio, fare una linea mediana 5 a 7 mm anteriormente incisione cervicale per esporre l&#39;arteria carotide comune (CCA). Mettere 2-4 divaricatori per mantenere la cavità aperta e l&#39;arteria esposto. </li><li> Individuare l&#39;arteria carotide interna (ICA), arteria occipitale (OA), e l&#39;arteria carotide esterna (ECA). Lo sposo le arterie per avere una visione chiara. essere autoeful non disturbare il nervo vago. NOTA: per cuccioli sham, l&#39;inicision viene lasciata aperta e le arterie sono esposti, dopo di che l&#39;incisione viene suturata chiuso. Il tempo totale anestesia è equivalente a quello della chirurgia occlusione. </li><li> Tagliare 1,5 cm di 6-0 seta filo intrecciato di sutura. Unbraid sutura, estraendo filamenti singoli. Assicurarsi che i singoli filamenti sono pulite e non sfilacciato. NOTA: Se necessario, smoothe le estremità sfilacciate immergendo il singolo filo in acqua sterile e governare il filamento con punte forcep. </li><li> Tenendo il filo di sutura con una pinza 45 gradi, spostare la pinza in un movimento ampio arco di passare sotto l&#39;ICA in modo che le punte forcep emergono tra ACI e OA. NOTA: Se la dissezione è fatto bene, questo passaggio sarà relativamente facile. Se l&#39;ICA e OA si toccano, fare attenzione a non rompere le arterie quando si utilizza la pinza per isolare l&#39;ICA. In caso di emorragia, applicare pressione dell&#39;arteria con la pinza finol&#39;emorragia si ferma. Assorbire il sangue con un tampone sterile. </li><li> Afferrare l&#39;estremità del filo di sutura che viene trattenuto dalle pinze e tirarlo in modo che alla fine è di facile accesso. Rilasciare il filo dalla pinza e sostenere le pinze da sotto l&#39;ICA, invertendo il moto al passo 1.5 (Figura 1A). </li><li> Legare una legatura temporaneo intorno ICA alla base, più vicino a dove si separa dal CCA. NOTA: È importante legare il nodo in modo che l&#39;estremità del filo che verrà tirato per rimuovere il nodo è sufficientemente lungo (maggiore di 1 mm, inferiore a 3 mm) di afferrare facilmente con una pinza, mentre assicurando che v&#39;è un quantità appropriata di filamento di sutura sull&#39;altro lato del nodo di svincolo. </li><li> rientrare con cura l&#39;ICA lateralmente e utilizzare una clip per fissare il filo di pelle in eccesso vicino alla regione ascellare sul lato opposto l&#39;incisione. Assicurarsi che questo filone retrattile è abbastanza tesa a fermare il flusso di sangue prima di procedere alla fase successiva, allaridurre al minimo il rischio di sanguinamento incontrollato. Si osservi che l&#39;arteria è piatto e pallido. NOTA: Non esagerare con retrazione, in quanto può causare una rottura parziale o totale del ICA. La retrazione può essere regolata prima rendendo l&#39;arteriotomia tirando il filo sul lato opposto alla clip. </li><li> Utilizzare 45 ° pinze per afferrare un altro filo di sutura unbraided e loop sotto e intorno al ICA, come al punto 1.5. Posizionare questo filone lateralmente alla retrazione filamento (Figura 1B). NOTA: questo passaggio può essere fatto anche prima del ritiro. Se sicuri della qualità di retrazione, questo nodo può essere molto vagamente legato prima del passaggio successivo. </li><li> Tagliare una metà arteriotomy 0,2 mm fra legature legati e non legati, che sbaglia più vicino alla legatura legato. NOTA: Il sangue rimanente nel arteria legato-off può svuotare attraverso l&#39;arteriotomia ma non deve superare i 5 microlitri. Se il sanguinamento persiste, estrarre delicatamente il filo di retrazione ad aumentare retrazione, con cura per unvuoto danneggiare l&#39;arteria dalla tensione eccessiva. </li><li> Utilizzando un righello metrico, misurare la sutura occlusione e tagliare la sutura con una tolleranza supplementare di 2-3 mm per la rimozione del occlusore durante la riperfusione. Tenere l&#39;occlusore con una pinza di 45 gradi e utilizzare pinze diritte per creare una curva alla lunghezza appropriata per raggiungere la MCA, segnando un punto di sosta per l&#39;avanzamento. NOTA: A 10 mm Lunghezza occlusione dalla punta fine silicone per la curva è utilizzata per P10 Sprague Dawley o Long Evans cuccioli di ratto in questo intervallo di peso. </li><li> Utilizzando 45 ° pinze, alimentare il nylon occlusione sutura siliconata nel arteriotomia e far avanzare la sutura alla curva che segna la distanza predeterminata al MCA (Figura 1C). Assicurarsi che il progresso si sente liscia; interrompere immediatamente l&#39;avanzamento se si avverte resistenza. Durante l&#39;avanzamento, mirare la sutura in una direzione che è parallela al CC / ECA, verso la testa. NOTA: se la sutura è dorsalmente avanzata, versocolonna vertebrale dell&#39;animale, si può incorrere in arteria pterigopalatino (PTA). In caso di resistenza dopo 3-5 mm di avanzamento, la sutura ha colpito la giunzione PTA. Back L&#39;occlusore fuori dell&#39;arteria fino a quando la testa di silicone è vicino al arteriotomia prima di regolare il senso di avanzamento. Non è necessario rimuovere completamente l&#39;occlusore dalla arteriotomia. </li><li> Fissare l&#39;occlusore legando una legatura temporanea, utilizzando il filo dal punto 1.10 (Figura 1D). </li><li> Rimuovere la clip divaricatore. Tagliare i fili di entrambe le legature temporanei in modo che il filamento del nodo che viene tirato per rimuovere il nodo è facile da afferrare con una pinza diritte ed è più lungo del filo che viene tirato per stringere il nodo. NOTA: I fili devono essere abbastanza breve in modo che non si aggrovigliano nella cavità dopo la chiusura. </li><li> Rimuovere i divaricatori e chiudere la cavità con 6-0 seta intrecciato per creare tre o quattro punti staccati. </li><li> Rimuovere il cucciolo daanestesia e posizionarlo su una piastra elettrica in aria ambiente. Monitorare il cucciolo fino a che non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale e garantire che essa ha pienamente recuperato prima di tornare alla diga. Assicurarsi che il cucciolo mantiene una temperatura superficiale del corpo tra 35,5 ° C e 37 ° C. </li><li> Durante occlusione, risonanza magnetica pesata in diffusione (DW-MRI) sotto anestesia con isoflurano può essere utilizzato per verificare l&#39;induzione appropriata di lesioni. La Figura 2 mostra danno ischemico in corso rilevato da DW-MRI durante tMCAO 9. NOTA: diffusione ponderato rotazione di imaging echo planare viene eseguita 10-15 minuti prima della riperfusione. L&#39;intero cervello è ripreso con seriali sezioni coronali 2 mm di spessore utilizzando le seguenti impostazioni della sequenza di impulsi: TR / TE = 5,000 / 60 ms, 4 medie, campo visivo = 35 mm, matrice di dati = 128x128, diffusione durata gradiente = 20 ms, separazione = 29.7 ms, ampiezza = 70mt / m, e b-factor = 1.045 s / mm 2.Gli animali che presentano una mancanza di coinvolgimento corticale o di danno ischemico atipici, come ad esempio nel tronco encefalico, sono esclusi. </li></ol> 2. riperfusione NOTA: occlusione viene eseguita per 3 ore a causare una quantità moderata-grave di lesioni che coinvolge il corpo striato e la corteccia. <ol><li> A circa 2 ore e 50 minuti dopo l&#39;occlusione della MCA, anestetizzare il cucciolo in 3% isoflurano in 100% O 2. Mantenere la temperatura superficiale del corpo tra 35,5 ° C e 37 ° C con l&#39;uso di una piastra elettrica sotto la fase chirurgica. </li><li> Rimuovere le suture interrotte dal punto 1.16 e individuare la giunzione, che è caratterizzato da due legature e la coda della sutura occlusione. NOTA: animali sham-operati sono indotti e rimangono sotto anestesia per un periodo di tempo equivalente agli animali occlusi. L&#39;incisione viene nuovamente aperto e suturato chiuso. Per gli animali sham-operati, procedere al punto 2.11. </li><li> attentamente untieil nodo più laterale precedentemente legato a passo 1.14 tirando il filo più lungo. NOTA: Se v&#39;è resistenza sciogliere il nodo, fermata per assicurare che la corretta filamento del nodo viene tirato. Se la resistenza continua, aumentare l&#39;ingrandimento per una migliore visualizzazione. Siate cauti quando svincolo, in quanto è possibile danneggiare l&#39;arteria durante questa fase. </li><li> Rimuovere il filo di sutura dalla cavità. </li><li> Esattamente 3 h dopo MCA occlusione, lentamente la sutura occlusione fuori dell&#39;arteria. Non ci sarà alcuna resistenza. NOTA: Nella maggior parte dei casi, non ci sarà alcun sanguinamento. Se si verifica una piccola quantità di sanguinamento, applicare pressione dell&#39;arteria nel sito arteriotomia. </li><li> Utilizzare pinze per applicare pressione al arteriotomia, come il passo successivo ripristina il flusso sanguigno ICA per riperfusione. </li><li> sciogliere il nodo con attenzione mediale utilizzando lo stesso metodo come nel passaggio 2.3. </li><li> Rimuovere il filo di sutura dal corpo e applicare un agente emostatico al arteriotomia per arrestare il sanguinamento. </li&gt; <li> Assicurarsi che l&#39;emorragia si è fermata. NOTA: Il ritorno della forma originale del arteria e di colore rosso conferma che il flusso di sangue ICA è stata restaurata. </li><li> Rimuovere i divaricatori e chiudere la cavità con tre o quattro punti staccati di seta 6-0 intrecciata. </li><li> Rimuovere il cucciolo dall&#39;anestesia e posizionarlo su una piastra elettrica in aria ambiente. Monitorare fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale e garantire il pieno recupero prima di tornare alla diga. Assicurarsi che il cucciolo mantiene una temperatura superficiale del corpo tra 35,5 ° C e 37 ° C. </li><li> Ispezionare i cuccioli al giorno per 5 giorni. Recprd il loro peso e controllare i siti di incisione a stretto contatto per un&#39;adeguata guarigione. Rimuovere i punti di sutura dopo 7-14 giorni. Lesioni post-tMCAO può essere ripreso con la risonanza magnetica, se lo si desidera 9. NOTA: Gli animali possono perdere fino a 1 g di peso il primo giorno, ma in genere recuperare il peso senza l&#39;intervento e di essere all&#39;interno di un simile pesointervallo t a controlli da giorni 4-5. Raramente, un cucciolo può perdere il peso eccessivo o hanno difficoltà di alimentazione, che richiede sonda gastrica nutre per 2-3 giorni. </li><li> A P21, pregiudizio può essere attendibilmente valutato con test comportamentali sensorimotorie, come rotarod o allevamento cilindro. Test cognitivi può essere effettuata già a 4-6 settimane di età utilizzando valutazioni, come il riconoscimento di oggetti romanzo o il labirinto di acqua Morris 13. </li><li> Eutanasia i ratti mediante iniezione intraperitoneale di Euthasol (50 mg / kg) per il raccolto cervello 11, 12. </li><li> Analisi istologica per valutare il volume lesioni o risposta agli interventi possono essere eseguite con violetto cresolo o colorazione H &amp; E (Figura 3) 10. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Passaggi critici all&#39;interno del protocollo In primo luogo, è importante mantenere normotermia decorrere dall&#39;inizio di anestesia fino al completo recupero, in quanto non vi sono effetti di entrambi ipotermia 17 e 18 ipertermia sulla progressione del danno cerebrale sia in animali immaturi e maturi conoscere. In secondo luogo, garantendo nel contempo l&#39;animale e ritraendo l&#39;incisione, posizionamento ottimale per monitorare la respirazione e per assicurare che la trachea è libero di compressione è essenziale. Terzo, evitare schiacciamenti o allungamento del nervo vago, poiché ciò può causare variazioni della frequenza cardiaca con stimolazione vagale. In quarto luogo, poiché retrazione dell&#39;ACI è necessario per controllare il sanguinamento durante l&#39;arteriotomia, occorre prestare attenzione al grado di tensione durante la retrazione per evitare di danneggiare l&#39;arteria. Se l&#39;arteria non strappare dalla retrazione, o se v&#39;è una scarsa un&#39;incisione arteriotomia, l&#39;animale deve essere escluso dall&#39;analisi a causa del rischiodi emorragia e poveri riperfusione. Modifiche e risoluzione di problemi Usando MRI come guida, la lunghezza sutura può essere ottimizzato per garantire che la punta di silicone occlude correttamente la MCA per creare l&#39;ischemia focale. Se la risonanza magnetica non è disponibile, i cuccioli possono essere eutanasia prima di riperfusione per la dissezione di visualizzare il posizionamento della sutura. Regolare la lunghezza della sutura come necessario. Il peso dei cuccioli altamente correlata con i requisiti di lunghezza occlusione sutura. Il tempo di occlusione può essere modificato per regolare il grado di gravità della lesione. Inoltre, la forma e la lunghezza sutura sono critici. Per P10 ratti Sprague-Dawley e Long Evans pesatura 19-21 g 10 mm è la lunghezza ottimale di inserimento nella nostra esperienza. Ulteriore inserimento della sutura occlusione può causare perforazione del MCA. Inoltre, la coerenza nella forma del filamento di occlusione in ogni chirurgia si tradurrà in una maggiore consistenza del pregiudizio pattern 19, 20. Per questo motivo, si consiglia di utilizzare suture professionalmente realizzati per questo scopo specifico. E &#39;anche importante notare che il modello pregiudizio può variare tra gli operatori a causa delle differenze apparentemente minute a tecnica. Limitazioni della tecnica L&#39;esecuzione di questa tecnica in un piccolo, lo sviluppo di roditore richiede esperienza significativa. Se eseguito correttamente, il chirurgo è in grado di causare un modello di lesioni molto coerente in tutti gli animali di diverse dimensioni e di raggiungere un tasso di sopravvivenza superiore al 95%. Inoltre, adeguati strumenti chirurgici sono essenziali. Gli strumenti chirurgici devono essere ben tenute a garantire che tutti i suggerimenti dello strumento si avvicinano in modo corretto. Importanza di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti o alternativi Mentre ipossia-ischemia, o il modello di Rice-Vannucci 2 </sup&gt;, è più comunemente utilizzato per studiare danno ipossico-ischemico nel cervello in via di sviluppo, è importante notare che questo modello di tMCAO è distinto da HI a che non ci sia l&#39;ischemia focale transitoria senza ipossia globale, seguita da una fase di riperfusione quando il ostruzione viene rimosso e il flusso di sangue viene ripristinato. Ciò causa una lesione più costante e riproducibile ed è più clinicamente traslazionale provocando un modello infortunio simile a quello osservato negli ictus neonatale a termine. In questo modo lo studio dei tipi di lesione focali e risposte compensatorie nel tessuto illeso. Le future applicazioni Dopo aver imparato questa tecnica Questo modello è simile alla causa più comune di ictus nei neonati umani, un trombo occlusivo transitorio che si verifica durante il periodo perinatale 11, 21. L&#39;eziologia non è del tutto chiara ed è più probabile multifattoriale, ma si presume nella maggior parte dei casi to derivare da emboli passando dalla placenta 11. Inoltre, molti nati con ictus perinatale presunta spesso presenti con attività convulsiva entro o sottile esame neurologico focale Anomalie 22. Questo rende l&#39;utilizzo di un modello di lesioni traslazionale coerente per identificare i meccanismi di progressione lesioni e le possibili strategie terapeutiche cruciali.

Ictus durante il periodo neonatale è una causa importante di morte e disabilità, che si verificano in ben 1 a 2.300 nati vivi 1. Questo porta a sviluppo del sistema nervoso centrale alterata e aumentata morbilità a lungo termine, tra cui una maggiore incidenza di epilessia, paralisi cerebrale, ritardo mentale, e altri tipi di motore o disfunzione cognitiva. Gli effetti per tutta la vita di ictus precoce rendono modelli animali traslazionali essenziale per esaminare i meccanismi di danno e riparazione in questa popolazione, comprese le strategie per proteggere il cervello danneggiato o per migliorare la riparazione. Diversi modelli di ischemia sono stati utilizzati per studiare le lesioni cerebrali in animali adulti, e mentre la Rice-Vannucci (Modificata Levine) 2 procedura viene comunemente utilizzato per studiare danno ipossico-ischemico nel cervello in via di sviluppo, focale ischemia-riperfusione è un meccanismo distinto di lesioni provocando lesioni focali, con un nucleo ferito e Penumbra e tessuti remoto indenne. I modelli Koizumi 3 e 4 Longa stati sviluppati in ratti adulti per raggiungere transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media attraverso l&#39;arteria carotide comune (CCA) e l&#39;arteria carotide esterna (ECA), rispettivamente. In entrambi i modelli, la legatura permanente e cauterizzazione di rami dell&#39;arteria sono importanti per ridurre al minimo il sanguinamento e di snellire la procedura chirurgica, che provoca anche effetti negativi sulla capacità dell&#39;animale di alimentare e ad aumentare di peso dopo un trauma. Inoltre, ci sono distinti meccanismi di lesione nel cervello immaturo e modelli specifici di lesioni visti come risultato. Più di recente, ictus photothrombotic (metodo Rose-Bengal) 5 e permanente legatura MCA 6 sono stati utilizzati per studiare ictus neonatale e adulti. Sia ictus photothrombotic e MCA legatura creano variazioni permanenti del flusso sanguigno cerebrale che si traducono in una mancanza di reperfusionico. Riperfusione è un componente critico di sviluppo e nella progressione di lesioni focali, con maggiore eccitotossicità, formazione di radicali liberi, e la produzione di ossido nitrico che porta alla morte cellulare ritardata che coinvolge cascate di segnalazione che sono distinti dalla fase ischemica 7. Ipossia-ischemia coinvolge permanente legatura unilaterale carotide seguita da ipossia globale, che varia da causa di danno ipossico-ischemico nell&#39;uomo e non causa un pattern lesione focale costante, rendendo studio del nucleo danneggiato e penombra più impegnativo. Abbiamo precedentemente descritto un modello ictus ischemia-riperfusione non emorragica nel ratto immaturo utilizzando transitoria cerebrale media occlusione dell&#39;arteria (MCAO) 8, 9, 10. Questo è un metodo meno invasivo che accede e occlude il MCA attraverso l&#39;arteria carotide interna senza ligati permanenteo cauterizzazione. Questo fornisce un modello di lesione simile alla causa più comune di ictus nel periodo perinatale 11, 12. Questo modello di ischemia-riperfusione dei risultati lesioni danni al corpo striato ipsilaterale e la corteccia parieto-temporale. Questo modello di tMCAO permette anche il controllo sulla gravità delle lesioni variando la durata di occlusione. L&#39;esame delle vie di segnalazione e cambiamenti istologici nel nucleo ferito e penombra e nel tessuto ipsilaterale e controlaterale illeso possono ulteriormente chiarire i meccanismi di danno e riparazione del cervello immaturo. Questo studio dimostrerà questo importante modello di lesione per il cervello in via di sviluppo.

<table><tbody><tr><td>Isoflourane</td><td>Henry Schein</td><td>50033</td><td>anesthetic, at 3%&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trinocular Surgioscope</td><td>World Precision Instruments</td><td>PSMT5N</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sunbeam</td><td>000731-500-000</td><td>low to medium setting</td></tr><tr><td>IR Thermometer</td><td>Extech Instruments</td><td>72-5270</td><td></td></tr><tr><td>Retraction kit for small animals&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>CermaCut Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>112522-00</td><td>2x</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>2x</td></tr><tr><td>B-2 Micro Clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>00398-02</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts for Clamp Application</td><td>Fine Science Tools</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro Vannas Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>2mm cutting edge</td></tr><tr><td>Occlusion Sutures</td><td>Doccol</td><td>602123PK10</td><td>701712PK5Re</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemostatic Agent&amp;nbsp;</td><td>Avitene</td><td>DVL1010590</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture</td><td>Ethicon</td><td>769G</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>0.22 mL/kg</td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>Henry Schein</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Tape</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr></tbody></table>

transient middle cerebral artery occlusion model of neonatal stroke in p10 rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

La gravità del danno causato da tMCAO dipende in larga misura sia il tempo di occlusione e l&#39;esperienza del chirurgo. A 90-minuti di occlusione spesso produce una lieve a moderata modello infortunio, mentre 3 h produce una lesione moderata-grave. Gravità del danno può essere valutato attraverso una varietà di metodi, tra cui la risonanza magnetica, l&#39;istologia, o analisi comportamentali a breve oa lungo termine. La figura 2 illustra un esempio di DW-MRI eseguita 75 min in un&#39;occlusione 90 min, confermando danno ischemico coinvolge l&#39;emisfero ipsilaterale. Diffusione pesate dimostra aumentata diffusione nello striato ipsilaterale e la maggioranza della corteccia ipsilaterale, senza cambiamenti controlaterale, durante la fase ischemico acuto. Questo è correlato a un livello moderato di lesioni a lungo termine che coinvolge sia la corteccia e la materia grigia profonda. L&#39;occlusione dei risultati MCA inmorte cellulare che inizia nello striato per lesioni meno gravi e si sviluppa un peggioramento lesioni corticali e dell&#39;ippocampo per tempi più lunghi di occlusione e lesioni più gravi. Durante l&#39;ottimizzazione della tecnica chirurgica, come la determinazione della lunghezza di inserimento sutura, RM è consigliabile, in quanto consente la conferma della corretta sutura e visualizzazione di edema e progressione lesioni durante l&#39;occlusione 14, 15, 16. Se la risonanza magnetica non è disponibile, H &amp; E o colorazione viola cresolo sono metodi istologici semplici ed affidabili per determinare la morfologia lesioni e possono essere utilizzati in entrambi i punti temporali precoce e tardiva dopo il tMCAO. La figura 3 illustra uno schema lesione moderata a grave in esame istopatologico dopo 3 h occlusione, dimostrando formazione di cisti e il volume nel corpo striato omolaterale e la corteccia. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"&gt; Imparziale quantificazione stereologica di sezioni cresolo-viola-macchiata per calcolare il rapporto di ipsilaterale volume emisferica controlaterale conferma ipsilaterale danno ischemico-riperfusione. Specificamente, dopo anestetizzare l&#39;animale con Euthasol, il cervello è stato raccolto da transcardiac perfusione in 0,1 M PBS con 4% paraformaldeide. Seguendo postfixation notte e equilibrazione nel 30% di saccarosio, l&#39;intero cervello è stata sezionata a 50 um intervalli, e ogni sezione XII è stato selezionato, montato, e colorate con violetto cresolo 10. Anche con lesioni lievi, modifiche dell&#39;apparato locomotore, come la circuitazione e emiparesi, sono noti nel corso del periodo di occlusione. Con la ferita più grave, questi cambiamenti persistere dopo riperfusione. test comportamentali supplementare può essere utilizzato per valutare la gravità delle lesioni, tra cui rotarod o cilindro di prova di allevamento per la funzione sensomotoria e il labirinto di acqua Morris perla funzione cognitiva 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig1.jpg" /> Figura 1: in diretta chirurgici Immagini della Procedura tMCAO. (A) Il primo filamento di sutura occhiello attorno al ICA, come illustrato nel passo 1.6. (B) La prima legatura temporaneo è legato e ICA è retratto. Il secondo filamento di sutura viene avvolta attorno alla ICA, lateralmente al primo filamento di sutura, come illustrato nel passo 1.9. (C) La siliconato sutura occlusione viene alimentato nel sito di arteriotomia, come illustrato nel passo 1.12. (D) La seconda legatura temporanea è legata per fissare l&#39;occlusore in posizione, come illustrato nel passo 1.14. bar scala = 1 mm. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig2.jpg" /> Figura 2: MRI Durante Occlusione dimostra l&#39;appropriato unilaterale Injury. Anteriore a posteriore, fette di immagini coronali del DW-MRI, eseguite durante 90 min occlusione, dimostrare maggiore diffusione coinvolge l&#39;emisfero ipsilaterale (frecce), che è coerente con la lesione ischemica in corso nella fase acuta. Ristampato con il permesso di Stroke 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig3.jpg" /> Figura 3: unilaterale di lesioni che coinvolgono lo striato e la corteccia a 4 settimane seguenti tMCAO. Posteriore alla anteriore, cresolo-viola macchiato sezioni del cervello coronali (ogni 50 micron) raccolti da P38 animali dimostrano lesioni piuttosto gravi (le frecce indicano la formazione di cisti omolaterale e ridotto corticale eVolume striatale) dopo 3 h tMCAO a P10. Il foro circolare sul lato sinistro rappresenta un identificatore emisfero controlaterale. bar scala = 5 mm. Ristampato con il permesso di Neurobiology of Disease 12. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Transient Medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale Modello di Stroke neonatale nei ratti P10

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

transient-middle-cerebral-artery-occlusion-model-neonatal-stroke-p10

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K Views.  University of California, San Francisco. Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Video: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable clinical state; in the development of animal models of focal ischemia, however, achieving reproducibility of experimentally induced infarct volume is essential. The rat is a widely used animal model for stroke due to its relatively low animal husbandry costs and to the similarity of its cranial circulation to that of humans2,3. In humans, the middle cerebral artery (MCA) is most commonly affected in stroke syndromes and multiple methods of MCA occlusion (MCAO) have been described to mimic this clinical syndrome in animal models. Because recanalization commonly occurs following an acute stroke in the human, reperfusion after a period of occlusion has been included in many of these models. In this video, we demonstrate the transient endovascular suture MCAO model in the spontaneously hypertensive rat (SHR). A filament with a silicon tip coating is placed intraluminally at the MCA origin for 60 minutes, followed by reperfusion. Note that the optimal occlusion period may vary in other rat strains, such as Wistar or Sprague-Dawley. Several behavioral indicators of stroke in the rat are shown. Focal ischemia is confirmed using T2-weighted magnetic resonance images and by staining brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 24 hours after MCAO.

Surgical induction of ischemic brain damage in the rat is a widely used model for stroke research. Here we demonstrate the induction of focal cerebral ischemia by occlusion of the middle cerebral artery. Visualization of the resulting infarct by histological staining and magnetic resonance imaging is also shown.

Modello di ischemia cerebrale focale da occlusione endovascolare Sutura della arteria cerebrale media nel ratto

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Ricerca

Neuroscienze

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modello murino di Mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Medicina

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Corsa di modellazione in Mouse: Coagulazione permanente dell&#39;arteria cerebrale media distale

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA thrombolysis) rarely produces benefits in mechanical occlusion-based experimental models, which dominate preclinical stroke research. This split between the bench and bedside suggests the need to employ tPA-responsive models in preclinical stroke research. To this end, a simple and tPA-reactive thrombotic stroke model is invented and described here. This model consists of transient occlusion of the unilateral common carotid artery and delivery of 7.5% oxygen through a face mask in adult mice for 30 min, while maintaining the animal rectal temperature at 37.5 &#177; 0.5 &#176;C. Although reversible ligation of the unilateral carotid artery or hypoxia each suppressed cerebral blood flow only transiently, the combination of both insults caused lasting reperfusion deficits, fibrin and platelet deposition, and large infarct in the middle cerebral artery-supplied territory. Importantly, tail-vein injection of recombinant tPA at 0.5, 1, or 4 hr post-tHI (10 mg/kg) provided time-dependent reduction of the mortality rate and infarct size. This new stroke model is simple and can be standardized across laboratories to compare experimental results. Further, it induces thrombosis without craniectomy or introducing pre-formed emboli. Given these unique merits, the tHI model is a useful addition to the repertoire of preclinical stroke research.

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Un trombotica Stroke modello basato sulla transitoria cerebrale ipossia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Establishment of Acute Pontine Infarction in Rats by Electrical Stimulation

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided here is a protocol for successfully establishing a rat model of acute pontine infarction. Rats weighing about 250 g are used, and a probe with an insulated sheath is injected into the pons using a stereotaxic apparatus. A lesion is produced by the electrical stimulation with a single pulse. The Longa score, Berderson score, and beam balance test are used to assess neurological deficits. Additionally, the adhesive-removal somatosensory test is used to determine sensorimotor function, and the limb placement test is used to evaluate proprioception. MRI scans are then used to assess the infarction in vivo, and TTC staining is used to confirm the infarction in vitro. Here, a successful infarction is identified that is located in the anterolateral basis of the rostral pons. In conclusion, a new method is described to establish an acute pontine infarction rat model.

Presented here is a protocol for establishing acute pontine infarction in a rat model via electrical stimulation with a single pulse.

Istituzione dell'infarto pontino acuto nei ratti mediante stimolazione elettrica

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided ...

Modeling Stroke in Mice: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion via the External Carotid Artery

Stroke is the third most common cause of mortality and the leading cause of acquired adult disability in developed countries. To date, therapeutic options are limited to a small proportion of stroke patients within the first hours after stroke. Novel therapeutic strategies are being extensively investigated, especially to prolong the therapeutic time window. These current investigations include the study of important pathophysiological pathways after stroke, such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity, and regeneration. Over the last decade, there has been increasing concern about the poor reproducibility of experimental results and scientific findings among independent research groups. To overcome the so-called &#8220;replication crisis&#8221;, detailed standardized models for all procedures are urgently needed. As an effort within the &#8220;ImmunoStroke&#8221; research consortium (https://immunostroke.de/), a standardized mouse model of transient middle cerebral artery occlusion (MCAo) is proposed. This model allows the complete restoration of the blood flow upon removal of the filament, simulating the therapeutic or spontaneous clot lysis that occurs in a large proportion of human strokes. The surgical procedure of this &#8220;filament&#8221; stroke model and tools for its functional analysis are demonstrated in the accompanying video.

Different models of middle cerebral artery occlusion (MCAo) are used in experimental stroke research. Here, an experimental stroke model of transient MCAo via the external carotid artery (ECA) is described, which aims to mimic human stroke, in which the cerebrovascular thrombus is removed due to spontaneous clot lysis or therapy.

Modellazione dell'ictus nei topi: occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media attraverso l'arteria carotide esterna

Stroke is the third most common cause of mortality and the leading cause of acquired adult disability in developed countries. To date, therapeutic options ...

Stabilire un modello di topi transcranici per l'occlusione dell'arteria cerebrale media

A Modified Transcranial Middle Cerebral Artery Occlusion Model to Study Stroke Outcomes in Aged Mice

In experimental stroke research, middle cerebral artery occlusion (MCAO) with an intraluminal filament is widely used to model ischemic stroke in mice. The filament MCAO model typically exhibits a massive cerebral infarction in C57Bl/6 mice that sometimes includes brain tissue in the territory supplied by the posterior cerebral artery, which is largely due to a high incidence of posterior communicating artery atresia. This phenomenon is considered a major contributor to the high mortality rate observed in C57Bl/6 mice during long-term stroke recovery after filament MCAO. Thus, many chronic stroke studies exploit distal MCAO models. However, these models usually produce infarction only in the cortex area, and consequently, the assessment of post-stroke neurologic deficits could be a challenge. This study has established a modified transcranial MCAO model in which the MCA at the trunk is partially occluded either permanently or transiently via a small cranial window. Since the occlusion location is relatively proximal to the origin of the MCA, this model generates brain damage in both the cortex and striatum. Extensive characterization of this model has demonstrated an excellent long-term survival rate, even in aged mice, as well as readily detectable neurologic deficits. Therefore, the MCAO mouse model described here represents a valuable tool for experimental stroke research.

Autore in primo piano: Tecniche innovative e direzioni future nella ricerca sull'ictus 

This protocol demonstrates a unique mouse stroke model with a medium-sized infarct and an excellent survival rate. This model allows preclinical stroke researchers to extend the ischemia duration, use aged mice, and assess long-term functional outcomes.

Un modello modificato di occlusione dell'arteria cerebrale media transcranica per studiare gli esiti dell'ictus nei topi anziani

In experimental stroke research, middle cerebral artery occlusion (MCAO) with an intraluminal filament is widely used to model ischemic stroke in mice. ...

Un modello di ischemia cerebrale transitoria mediante occlusione dell'arteria cerebrale media

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Stroke

Stroke stands as a major cause of death or chronic disability globally. Nevertheless, existing optimal treatments are limited to reperfusion therapies during the acute phase of ischemic stroke. To gain insights into stroke physiopathology and develop innovative therapeutic approaches, in vivo rodent models of stroke play a fundamental role. The availability of genetically modified animals has particularly propelled the use of mice as experimental stroke models.
In stroke patients, occlusion of the middle cerebral artery (MCA) is a common occurrence. Consequently, the most prevalent experimental model involves intraluminal occlusion of the MCA, a minimally invasive technique that doesn't require craniectomy. This procedure involves inserting a monofilament through the external carotid artery (ECA) and advancing it through the internal carotid artery (ICA) until it reaches the branching point of the MCA. After a 45 min arterial occlusion, the monofilament is removed to allow reperfusion. Throughout the process, cerebral blood flow is monitored to confirm the reduction during occlusion and subsequent recovery upon reperfusion. Neurological and tissue outcomes are evaluated using behavioral tests and magnetic resonance imaging (MRI) studies.

Autore in primo piano: Valutazione del danno da ictus ischemico attraverso il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media 

This protocol describes the model of transient focal cerebral ischemia in mice through intraluminal occlusion of the middle cerebral artery. Additionally, examples of outcome assessment are shown using magnetic resonance imaging and behavioral tests.

Modello transitorio di occlusione dell'arteria cerebrale media dell'ictus

Stroke stands as a major cause of death or chronic disability globally. Nevertheless, existing optimal treatments are limited to reperfusion therapies ...

Transient Medio occlusione dell'arteria cerebrale Modello di Stroke neonatale nei ratti P10

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Modello di ischemia cerebrale focale da occlusione endovascolare Sutura della arteria cerebrale media nel ratto

Modello murino di Mezzo occlusione dell'arteria cerebrale

Corsa di modellazione in Mouse: Coagulazione permanente dell'arteria cerebrale media distale

Un trombotica Stroke modello basato sulla transitoria cerebrale ipossia-ischemia

Istituzione dell'infarto pontino acuto nei ratti mediante stimolazione elettrica

Modellazione dell'ictus nei topi: occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media attraverso l'arteria carotide esterna

Un modello modificato di occlusione dell'arteria cerebrale media transcranica per studiare gli esiti dell'ictus nei topi anziani

Un modello modificato di occlusione dell'arteria cerebrale media transcranica per studiare gli esiti dell'ictus nei topi anziani

Un modello modificato di occlusione dell'arteria cerebrale media transcranica per studiare gli esiti dell'ictus nei topi anziani

Modello transitorio di occlusione dell'arteria cerebrale media dell'ictus