Il nostro protocollo ci permette di studiare come i tessuti, come il muscolo scheletrico, regolano le loro dimensioni, che rimane una questione chiave nella biologia cellulare e dello sviluppo con importanti implicazioni fisiologiche e mediche. Il vantaggio principale della nostra tecnica è che la crescita cellulare può essere osservata e misurata in animali vivi in vivo in vivo con un alto grado di accuratezza spaziale e temporale. I progressi nella comprensione di base della crescita muscolare precoce possono evidenziare le origini dello sviluppo dei problemi muscolari precoci e portare alla scoperta di Novo Therapeutics per la protezione contro la perdita muscolare negli anziani e nei pazienti con disturbi muscolari.
Preparare l'1% LMA in un tubo da 1,5 millilitri e tenerlo in un blocco termico di 37 gradi Celsius per un uso ripetuto. Seleziona il pesce da montare e anestetizza transitoriamente ogni pesce. Per evitare shock termici, rimuovere l'aliquota LMA dal blocco termico e lasciarla raffreddare appena sopra l'impostazione.
Prendi una capsula di Petri da 60 millilitri che è stata rivestita con uno strato di LMA all'1% e posizionala sul palco di un microscopio da dissezione. Trasferire la larva con una pipetta Pasteur di plastica da un millilitro su una capsula di Petri rivestita da 60 millimetri e rimuovere il più possibile il mezzo trasferito. Quindi, sempre utilizzando la pipetta Pasteur, posizionare alcune gocce di LMA sul pesce e orientare rapidamente la larva vicino alla superficie superiore dell'LMA con il suo asse anteroposteriore e dorsoventrale entro 10 gradi dall'orizzontale, usando una pinza o un ago di vetro sottile lucidato a fuoco prima che l'LMA tramonti.
In alternativa, utilizzare una pipetta Pasteur in plastica da un millilitro. Raccogliere le larve con un minimo di terreno di pesce e trasferire le larve nell'aliquota di LMA raffreddato. Lasciare che la larva affondi per cinque secondi per diventare completamente circondata da LMA.
Quindi recuperare la larva e trasferirla in una goccia di LMA sulla capsula di Petri rivestita di agarosio. Posizionare rapidamente la larva come dimostrato in precedenza. Se le larve non sono montate correttamente orizzontalmente vicino alla superficie della goccia di agarosio, rimuovere e re-incorporare, le larve possono essere facilmente recuperate mediante aspirazione delicata utilizzando una pipetta Pasteur di plastica da un millilitro e LMA può essere rimosso delicatamente utilizzando salviette chimiche.
Attendere circa 10 minuti fino a quando LMA non si imposta. Inondare il piatto con circa 10 millilitri di terreno di pesce contenente tricaina. Per catturare le pile confocali, lasciare riposare il pesce montato per almeno 10 minuti prima della scansione, poiché si verifica il gonfiore dell'agarosio.
Caricare il piatto campione sullo stadio del sistema confocale. Individua le larve e concentrati sul somite desiderato. Somite 17 può essere scelto per la sua facilità di localizzazione vicino allo sfiato anale e la facilità di imaging.
Controlla contando i somiti dalla parte anteriore. Per acquisire immagini YZ, impostare come per acquisire uno stack Z. Inizia definendo i punti superiore e inferiore del pesce.
Sia il lato sinistro che quello destro possono essere catturati come desiderato, assicurando che tutte le scansioni YZ rapide catturino le regioni desiderate. Orientare l'area di scansione per il pesce come consentito dal software confocale. Posizionare il pesce con l'asse anteroposteriore, parallelo all'asse dex dell'immagine e all'asse dorsoventrale parallelo all'asse Y con somite 17 al centro del campo.
Concentrarsi su un piano di livello medio nel miotomo superiore, in cui l'intera metà epaxiale e ipassiale somite, insieme ai miosepti verticali e orizzontali sono visibili e catturano un'immagine XY ad alta risoluzione. Assegnare un nome al file e salvare l'immagine. Per catturare le immagini YZ, disegna una linea precisa da dorsale a ventrale attraverso la somite scelta, perpendicolare all'asse anteroposteriore del pesce.
Aggiungi una posizione anteroposteriore selezionata, quindi esegui una scansione della linea dello stack Z. Ripetere la scansione della linea YZ tre volte in posizioni anteroposteriori definite lungo il miotomo selezionato per catturare YZA, YZM e YZP. Assegna un nome e salva queste immagini con l'immagine XY correlata.
Questo protocollo è stato definito come il metodo delle quattro sezioni e le immagini possono essere analizzate utilizzando il software Zen o ImageJ. Per creare una camera di stimolazione, prendi una piastra di sei per 35 millimetri e crea due piccole aperture di meno di cinque millimetri di diametro, a un centimetro di distanza su ciascun lato di ciascun pozzetto usando un saldatore stretto. Una volta creata, la camera di stimolazione può essere riutilizzata.
Infilare un paio di fili d'argento o di platino attraverso le aperture di ciascun pozzetto. Il materiale adesivo riutilizzabile può essere applicato vicino alle aperture per mantenere i fili in posizione e garantire una separazione di un centimetro tra i fili. A tre giorni dopo la fecondazione, dividere il pesce in tre condizioni, controllo medio del pesce, gambo inattivo e inattivo più.
Per i gruppi staminali inattivi e inattivi più, anestetizzare le larve a 72 ore dopo la fecondazione con 0,6 millimolari tricaine. Per il pesce di controllo medio pesce, lasciarli non anestetizzati. Preparare 60 millilitri di agarosio al 2% in mezzo di pesce.
Scioglietelo accuratamente con un forno a microonde e lasciatelo raffreddare. Quindi aggiungere tricaina e versare almeno quattro millilitri in ciascun pozzetto della camera di stimolazione. Aggiungere immediatamente pettini a quattro pozzetti su misura tra gli elettrodi.
Attendere 10 minuti affinché il gel si fissi. Rimuovere accuratamente i pettini per creare quattro pozzetti rettangolari. Riempire ogni pozzetto con acqua tricaina e posizionare una singola larva anestetizzato, inattivo più stelo in ogni pozzetto usando una micro pipetta, con il loro accesso anteroposteriore perpendicolare agli elettrodi.
Controllare sotto il microscopio fluorescente da dissezione se ogni pesce è completamente anestetizzato all'interno di ogni camera pozzetto. Collegare uno stimolatore elettrofisiologico regolabile che genera pattern alla camera attraverso un controller di polarità, utilizzando clip a coccodrillo collegate a ciascun elettrodo su un lato della camera. Quindi stimolare il pesce come descritto nel manoscritto del testo.
Controllare regolarmente al microscopio per confermare che i pesci vengono stimolati. Lo stimolo elettrico dovrebbe indurre una contrazione bilaterale visibile e un leggero movimento una volta ogni cinque secondi seguendo i parametri descritti. Dopo la stimolazione, rimuovere con attenzione i pesci da ciascun pozzetto sciacquandoli delicatamente con una pipetta di plastica e restituirli all'incubatrice in un mezzo di pesce fresco contenente tricaina.
Versare via l'acqua tricaina dall'interno della camera e usare una pinza per tagliare e rimuovere l'agarosio da ciascun pozzetto, sciacquare i pozzetti con acqua di rubinetto e lasciarli asciugare. Per l'analisi delle dimensioni muscolari, denominata metodo a quattro fette, sono state ottenute immagini XY e YZ del muscolo larvale del pesce zebra ed è stato calcolato il volume di somite. È stata osservata una forte correlazione tra i metodi four slice e full stack, sebbene il metodo a quattro sezioni abbia fornito una stima del volume leggermente più grande.
L'analisi volumetrica dei miotomi adiacenti dei somiti 16 e 18 ha rivelato che ogni somite era circa il 7% più grande di quello dietro. Ulteriori indagini hanno rivelato che un metodo a due sezioni, che richiede solo una singola misurazione YZ, ha fornito una stima ragionevolmente accurata del volume del miotomo. Il miotomo è cresciuto in modo rilevabile in lunghezza e l'area della sezione trasversale tra due e cinque giorni dopo la fecondazione, portando ad un costante aumento di volume.
Il muscolo reso inattivo dalla tricaina anestetica tra il terzo e il quarto giorno dopo la fecondazione aveva ridotto significativamente il volume, indicando che la crescita muscolare larvale dipendeva dall'attività. Una maggiore variazione nella riduzione delle dimensioni del miotomo è stata osservata quando si misura il volume del miotomo a quattro giorni dopo la fecondazione, rispetto alla misurazione di ogni singolo pesce a tre e quattro giorni dopo la fecondazione. Tuttavia, non è stata osservata alcuna differenza significativa nel volume del miotomo tra i due metodi di misurazione del miotomo.
La misurazione del numero di fibre all'interno del miotomo, così come il volume medio delle fibre, ha rivelato che l'attività controlla entrambi gli aspetti cellulari della crescita. Assicurarsi che le larve siano completamente anestetizzate, usando tricaine appena preparate. L'anestesia parziale porterebbe a risultati variabili.
Come sappiamo, le larve rispondono più vigorosamente alla stimolazione elettrica. Questo metodo, combinato con la trascrittomica a valle e gli esperimenti farmacologici, ha rivelato nuove intuizioni su come il rilevamento della forza guida la crescita nel muscolo scheletrico.
