This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.

1. Preparazione di plasmidi <ol><li> Preparare un plasmide (ad esempio, pET22) contenente la proteina di ancoraggio (OmpA) fusa a un dominio di legame biortogonale (di cui al presente protocollo come anchor-ST), tag epitopo (come 6xHis, myc o la bandiera tag per la purificazione e identificazione), tag periplasmic localizzazione, la resistenza agli antibiotici, e l&#39;origine appropriata di replica in base al ceppo batterico selezionato 7. <ol><li> Estrarre il DNA plasmide da culture durante la notte utilizzando un kit di isolamento del DNA disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore. </li></ol></li><li> Preparare un plasmide (ad esempio, pACYC184) contenente l&#39;enzima / proteine (PTE) da confezionare all&#39;interno della OMV fusa al dominio di legame bioorthogonal complementare a quella della proteina di ancoraggio (denominato nel presente protocollo come enzima-SC), epitopo, tag periplasmic localizzazione, la resistenza agli antibiotici che è diverso da quello del plasmide proteine ​​di ancoraggio, e orig appropriatain di replica basata sul ceppo batterico selezionato 7. <ol><li> Estrarre il DNA plasmide da culture durante la notte utilizzando un kit di isolamento del DNA disponibile in commercio seguendo il protocollo 7 del produttore. </li></ol></li></ol> 2. Generazione di un OMV Packaging E. coli Cultura <ol><li> Isolamento plasmidi <ol><li> Purificare plasmidi che codificano l&#39;enzima-SC costruire ed ancoraggio-ST costruisce da linee cellulari di manutenzione separati utilizzando un kit di isolamento plasmide commerciale come da protocollo 7 del produttore. Determinare la concentrazione di DNA e la purezza misurando l&#39;assorbanza a 260 nm e 280 nm. </li></ol></li><li> Co-trasformazione <ol><li> Selezionare un ceppo di E. coli che è disponibile in commercio per facilitare l&#39;espressione delle proteine. NOTA: BL21 cellule (DE3) sono stati utilizzati qui. Il lysogen T7 è necessaria per l&#39;espressione del costrutto ancoraggio-ST, che si basa sul promotore T7 e T7 RNA polimerasi per protespressione ein. L&#39;uso di altri ceppi batterici richiede o la presenza del gene lysogen T7 o l&#39;uso di un plasmide diverso pET22 7. </li><li> Diluire purificato DNA plasmidico a concentrazioni molari equivalenti poi trasformarle in cellule batteriche competenti tramite uno shock termico trasformazione o elettroporazione seguenti protocollo del produttore per le cellule competenti scelti. </li><li> cellule piastra trasformato Onto antibiotico contenente Luria-Bertani (LB) piastre di agar sia con ampicillina (pET22) e cloramfenicolo (pACYC184); entrambi presenti a concentrazioni finali di 25 ug / ml. </li><li> Porre la capsula cultura a 37 ° C durante la notte per isolare solo i cloni che contengono entrambi i plasmidi. NOTA: Le colonie che sopravvivono selezione antibiotica saranno utilizzati per tutti i futuri preparati OMV. Antibiotici (ampicillina e cloramfenicolo) saranno aggiunti a tutti colture liquide per mantenere la pressione selettiva e garantire la presenza di entrambi i plasmidi. </li></ol></li></ol> 3. OMV Produzione <ol><li> Colony espansione <ol><li> Seminare 5 ml di terreni di coltura (tipicamente Brodo Terrific (TB) o LB) contenenti antibiotici alle concentrazioni di cui sopra (punto 2.2.3) con una singola colonia dalle piastre di selezione descritti al punto 2.2.4. </li><li> Eseguire una diluizione 1: 100 volte della coltura starter durante la notte in fiasche di coltura sconcertato. NOTA: utilizzare un volume di file multimediali tra 250-500 ml. </li><li> Mantenere la coltura a 37 ° C agitando a 250 rpm per garantire che sufficiente aerazione della cultura è raggiunto. </li></ol></li><li> Induzione di ogni plasmide <ol><li> Lasciare che la coltura batterica a crescere ad un OD 600 di 0,6-0,8, a circa 3 ore di crescita dopo l&#39;inoculazione del pallone di crescita primario. </li><li> Per migliorare la resa finale del PTE-SC vescicole caricate, centrifugare l&#39;intera cultura a 7.000 xg per 15 min. Risospendere il pellet di cellule in pre-riscaldato, terreni di coltura fresco. NOTA: Questo optionale passaggio consente di rimuovere qualsiasi OMV vuoto che sono presenti nel terreno di coltura prima dell&#39;induzione PTE-SC. </li><li> Ottenere una soluzione stock al 20% di L-arabinosio in acqua e filtro sterile utilizzando un filtro di 0,22 micron. Conservare la soluzione L-arabinosio a 4 ° C per 2-4 settimane. </li><li> Aggiungere la soluzione L-arabinosio al pallone di coltura ad una concentrazione finale dello 0,2% di avviare la produzione PTE-SC. NOTA: Questo aiuta a precaricare spazio periplasmatico con PTE-SC prima di promuovere una maggiore vescicolazione attraverso l&#39;induzione del mutante OmpA-ST. </li><li> Fare una soluzione 1 M isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in acqua e filtro sterile utilizzando un filtro di 0,22 micron. NOTA: IPTG deve essere utilizzato immediatamente una volta idratato. Aliquote di IPTG possono essere conservati congelati per 3-6 mesi e possono essere scongelati immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Aggiungere IPTG dopo un ulteriore periodo di incubazione 3 ore ad una concentrazione finale di 0,5 mM di avviare la produzione del OmpA-ST. </li><li> Lasciare che il culture a crescere per un ulteriore 8-14 ore a 37 ° C sotto agitazione. </li></ol></li></ol> 4. OMV Purificazione <ol><li> Rimozione dei batteri Intact <ol><li> Centrifugare terreni di coltura batterica per 15 min a 7000 xga 4 ° C per sedimentare batteri intatti. </li><li> Decantare, e salvare, i media la parte superiore del post centrifugazione pellet cellulare facendo attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Ripetere i punti 4.1.1 e 4.1.2 per un ciclo di centrifugazione ulteriore per garantire tutti i batteri intatti vengono rimossi dal terreno di coltura avendo cura di decantare e salvare i media. </li></ol></li><li> La rimozione di aggregati proteici <ol><li> Ulteriori purificare il terreno di coltura batterica usando un filtro da 0,45 micron a membrana per rimuovere batteri residui e grande materiale cellulare indesiderato. NOTA: utilizzare un materiale a membrana biologicamente compatibile per i recuperi più elevati e minore assorbimento di proteine, come acetato di cellulosa (CA) o polivinilidene difluoruro (PVDF). volumi filtri Siringa meno di 100 ml e volumi filtra sotto vuoto superiore a 100 ml. <ol><li> Per il filtro della siringa, disegnare terreno di coltura in siringa sterile 10-50 ml. Fissare 0,45 micron filtro per Luer fine della siringa. Premere stantuffo e raccogliere flusso continuo in una nuova nave. </li><li> Per aspirare il filtro, il trasferimento terreno di coltura ad un apparato di filtrazione sterile. Fissare unità a vuoto della pompa o affondare aspiratore per generare aspirazione. Trasferimento medio filtrata a nuova nave. </li></ol></li></ol></li><li> Isolamento di OMV via Ultracentrifugazione <ol><li> Aggiungere il terreno di coltura filtrato in tubi centrifugazione facendo attenzione a bilanciare i tubi opposte nella centrifuga. </li><li> Pellet a ~ 150.000 xg per 3 ore a 4 ° C in un&#39;ultracentrifuga utilizzando il rotore corrispondente corrispondenza dello strumento e tubi essendo utilizzata. </li><li> Decantare il terreno di coltura impoverito OMV dal pellet OMV, facendo attenzione a non disturbare il pellet OMV, immediatamente al completamento of centrifugazione a consentire il pellet OMV rimanere nei media ammorbidire il pellet riducendo recupero OMV. NOTA: Questo pellet sarà leggermente marrone e seconda della quantità di partenza di coltura batterica può o non può essere visibile ad occhio. Aspirare il supporto direttamente dalla parte superiore del tubo di centrifugazione è anche un&#39;opzione tenendo presente che i media più rimossi dal OMV pellet più pura campione finale OMV sarà. </li><li> Salvare il surnatante centrifugato per la prova successiva Dynamic Light Scattering (DLS) per verificare che le particelle OMV sono state completamente esaurite da parte dei media. </li><li> Aggiungere 0,5-1 ml di soluzione sterile a pH 7,4 o 100 mM N -Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic tampone filtrata tampone fosfato (PBS) Acido (CHES) a pH 8,0 al pellet OMV permettendogli di incubare per 30 minuti a RT. Assicurarsi che il pellet non si asciughi. NOTA: Gli sbalzi di soluzione forza ionica, il pH e la temperatura può causare ridotta solubilità OMV e promuovere aggregazione. </li><li> pipetta con attenzione la soluzione purificata OMV dalla provetta, mescolando delicatamente per garantire l&#39;intero pellet è stato solubilizzato. </li></ol></li></ol> 5. OMV Caratterizzazione <ol><li> Utilizzare qualsiasi software DLS o di monitoraggio nanoparticelle disponibile in commercio seguendo i protocolli del produttore fornito uniche per ogni strumento per determinare la distribuzione delle dimensioni OMV e concentrazione di particelle. NOTA: Qui, distribuzione delle dimensioni OMV e la concentrazione è stata determinata utilizzando NanoSight LM10 nanoparticelle di monitoraggio e NTA 2.3 Software di analisi. <ol><li> Aprire il software. </li><li> Accendere il microscopio e pulire tutte le superfici dell&#39;unità microscopio e il monitoraggio delle nanoparticelle. </li><li> Aggiungere ~ 0,5 ml di OMV campione direttamente alla finestra di visualizzazione del dispositivo di tracciamento di particelle attraverso il raccordo Luer con 1 ml siringa sterile avendo cura di coprire l&#39;intera finestra di visualizzazione senza iniettare eventuali bolle d&#39;aria nel sistema. </li><li> luogo tegli nanoparticelle unità di monitoraggio sul palco microscopio e accendere il laser. </li><li> Fai clic su &quot;Capture&quot; nel software. </li><li> Regolare il fuoco microscopio e mettere in scena per visualizzare le particelle sullo schermo di anteprima presente nella finestra del software. </li><li> Regolare il &quot;Shutter&quot; e &quot;guadagno della telecamera&quot; fino a quando le particelle brillanti sono chiaramente visualizzati su uno sfondo scuro. </li><li> Regolare la durata di cattura per 60 sec. </li><li> Fai clic su &quot;Record&quot;. </li><li> Quando richiesto, immettere la temperatura del / dispositivo campione, etichettare il campione, e salvare i dati video al termine della ciascuna correre in una cartella utente designato. </li><li> Tenere tutti i parametri di analisi (Rilevazione soglia, Blur, lunghezza minima traccia, Min atteso Particle Size) su auto modalità di rilevamento e cliccare su &quot;svolgimento del processo.&quot; NOTA: Consultare il manuale per come ogni parametro può essere regolato in modo indipendente per fini risultati delle analisi sintonia. </li><li> Record distribuzione granulometrica e particelle / mconcentrazione l come determinato dal software. NOTA: Una tipica gamma di dimensioni idrodinamica OMV è compresa tra 30-200 nm con una concentrazione di particelle / ml di ~ 10 x 10 8. </li></ol></li><li> Determinazione OMV contenuto proteico <ol><li> Utilizzare SDS-PAGE e protocolli standard Western Blot per valutare la purezza OMV, la produzione di enzimi, e l&#39;efficienza di reticolazione SC-ST 7. NOTA: La reticolazione efficienza non sarà al 100% 7. </li></ol></li></ol> 6. Verifica di Enzyme Packaging <ol><li> PTE Activity Assay <ol><li> Eseguire tutti saggi enzimatici in un tampone adatto ad esempio 100 mM CHES tampone (pH 8) a 25 ° C sia in una cuvetta o multiplato in un piatto ben 96/384. </li><li> Aggiungere 5 ml di una diluizione 1: 1.000 in tampone paraoxon CHES a 90 ml di CHES e 5 ml di purificato OMV (~ 36 volte concentrato rispetto alla concentrazione OMV presente nei mezzi di coltura). Attenzione: Paraoxon è un pesticida tossicoe deve essere gestito per produttore e linee guida istituzionali. </li><li> Le letture di assorbanza a intervalli regolari (ogni 20 sec per ~ tempo di reazione totale di 2 ore) a 405 nm (ε = 18.1 mM -1 cm -1) e a 348 nm (ε punto isosbestic = 5.4 mM -1 cm -1) monitorare la progressione della reazione il prodotto guasto paraoxon cromogenico, p -nitrophenol. NOTA: A valori di pH superiore a 8 è presente la forma deprotonato dominante di p -nitrophenol consentendo accurato monitoraggio a 405 nm. In tutte le altre soluzioni pH complessa o inferiore è necessario utilizzare il punto isosbestico di 348 nm come molteplici forme di p -nitrophenol saranno presenti. </li><li> Calcolare velocità di reazione iniziali determinando la pendenza della porzione lineare delle curve progressi dal punto 6.1.3 di confrontare in ciascun campione, efficienza confezionamento e produzione totale PTE la quantità relativa di PTE. </li><li> Eseguire enzimatica di serieprotocolli di analisi per determinare K M, V max e K gatto per la OMV incapsulati PTE. NOTA: un&#39;analisi Lineweaver-Burk può essere utilizzato per la determinazione di questi parametri cinetici dove l&#39;intercetta = 1 / V max e pendenza = K M / V max 20. </li></ol></li><li> Transmembrane substrato / diffusione del prodotto. <ol><li> Eseguire la stessa analisi analisi cinetica come descritto al punto 6.1 utilizzando concentrazioni crescenti di Triton X-100 in tampone CHES da 0-3% in volume. NOTA: L&#39;aggiunta di Triton X-100 per le funzioni solubilizzate OMV perturbare il doppio strato lipidico consentendo il contenuto della OMV il libero accesso alla soluzione di reazione. </li><li> Calcolare e confrontare le velocità iniziali per ogni livello di Triton X-100 per verificare transmembrana passaggio del substrato / prodotto indicato dal minimo cambiamento nell&#39;attività enzimatica (velocità iniziali) rispetto al enzimatica in mancanza di Triton X-100. Se un sostanziale aumento dell&#39;attività enzimatica è osservata in presenza di Triton X-100 è probabile che il substrato non diffonde liberamente nel OMV. </li><li> attività enzimatica libera Assay (come descritto sopra nel paragrafo 6.1) in presenza di Triton X-100 per verificare che l&#39;attività enzimatica non è inibita dal tensioattivo stesso. NOTA: Se l&#39;attività è notevolmente influenzato dalle Triton X-100, additivi alternativi, come saponine o vari polisorbato / tensioattivi interpolazione può essere più adatto alla rottura della membrana OMV. </li></ol></li></ol> 7. OMV bagagli <ol><li> Congelamento <ol><li> aliquote luogo ~ 100 ml di purificato OMV direttamente in azoto liquido a scatto per congelare il aliquote assicurandosi di non immergere completamente le fiale o contattare qualsiasi azoto liquido con il campione stesso. NOTA: purificata OMV può essere congelato a scatto direttamente nel buffer che è stato selezionato per solubilizzare il pellet OMV durante il depuprocesso ionico senza crioprotettori supplementari necessari 7. </li><li> Conservare le aliquote a scatto congelato a -80 ° C. </li><li> Scongelare aliquote congelate dal punto 7.1.1 mettendoli a temperatura ambiente assicurandosi di non riscaldare i campioni. </li><li> Prima di preparare tutti i campioni per la conservazione in questo modo eseguire il saggio enzimatico descritto al punto 6.1 confrontando velocità iniziali prima e dopo il congelamento per verificare che non vi è alcuna perdita significativa di attività enzimatica dopo congelamento-scongelamento. NOTA: Conservare purificato OMV a 4 ° C se una riduzione dell&#39;attività enzimatica si osserva dovuti al gelo. </li></ol></li><li> Liofilizzazione <ol><li> Lyophilize gli snap congelato purificati aliquote OMV che utilizzano attrezzature liofilizzazione disponibili in commercio 21. </li><li> Conservare aliquote liofilizzato a temperatura ambiente per settimane oa -80 ° C per molti mesi. </li><li> Aggiungere lo stesso volume di acqua purificata al liofilizzato OMV come prima liofilizzazione e lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 min per reidratare tlui campione. Mescolare delicatamente quando sia necessario assicurarsi di non vortice o ultrasuoni la OMV. </li><li> Aggiungere polvere liofilizzata OMV direttamente al punto di cura per le applicazioni dove prima diluizione / solubilizzazione non è necessario. </li></ol></li></ol>

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BioSyst. 8 (2036), (2012).</li><li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils:+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding.">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li><li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo.">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli.">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866 (2016).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme/protein+packaged+bacterial+vesicles.">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo funzioni di protocollo per dimostrare un rappresentante dirette tecnica imballaggio in cui viene prodotto e confezionato in OMV da E. coli un enzima di interesse. Come per molte tecniche complesse ci sono più aree in cui il protocollo può essere modificato per ospitare per l&#39;utilizzo in diverse applicazioni uniche, alcune delle quali sono descritte di seguito. Mentre il meccanismo di imballaggi OMV e l&#39;enzima incapsulamento può essere adattata alle esigenze specifiche ci sono diversi passaggi ...

Qui presentata è un metodo per la progettazione, produzione e purificazione di vescicole enzimi batterici caricato membrana esterna (OMV). OMV sono piccole, soprattutto unilamellare, proteoliposomi che variano nel formato 30-200 nm 1,2. Tutti i batteri Gram-negativi e Gram-positivi che sono stati studiati fino ad oggi hanno dimostrato rilascio di una OMV o vescicole extracellulari (EV) dalla loro superficie 3,4. Il meccanismo preciso con cui sono prodotti OMV devono ancora essere completamente chiarito causa delle diverse popolazioni batteriche che loro così come le funzioni diverse che servono secernono. OMV hanno dimostrato di trasportare una vasta gamma di carico da piccole molecole, peptidi e proteine di materiale genetico serve una varietà di segnalazione complesso, gene traslocazione, e virulenza FUNZIONI 5,6. I meccanismi esatti di OMV biogenesi non sono ben caratterizzati, e sembrano differire tra le specie batteriche. nonostante this Infatti, abbiamo sviluppato un metodo per migliorare l&#39;efficienza di confezionamento di una proteina ricombinante in OMV creando un legame sintetico tra una proteina di interesse e altamente abbondante endogena proteina alla membrana esterna batterica e successiva OMV. In assenza di un legame sintetico, o di affinità artificialmente incorporato, tra la proteina ricombinante espressa e la OMV l&#39;efficienza confezione osservato è molto basso 7. Questo risultato è prevedibile come l&#39;incorporazione delle proteine ​​all&#39;interno della OMV sia avviene attraverso l&#39;incapsulamento casualità nel momento preciso della formazione OMV in superficie batterica o attraverso il packaging diretto da meccanismi che non sono ben compresi. Qualche successo è stato osservato nel confezionamento proteine ​​semplicemente attraverso sovraespressione nello spazio periplasmatico che si basa su incapsulamento casualità ma efficace imballaggio è altamente proteina dipendente con alcune proteine ​​Confezioni ad alta efficienza rispetto ad altri tha non comprimere affatto 8-10. Utilizzando le tecniche comuni di biologia sintetica abbiamo cercato di progettare Escherichia coli (E. coli) per produrre contemporaneamente, pacchetto e secernere un enzima attivo di interesse in OMV che aggira le limitazioni attuali conoscenze su come si formano e come OMV carico viene selezionato dai batteri per confezionamento. Ai fini della presente domanda, un sistema di proteine ​​bioconjugation scaglionato è stato selezionato come il legame sintetici di scelta per facilitare confezionamento direzionale nel OMV. Come suggerisce il nome un sistema proteico bioconjugation scissione comprende due domini subunità complementari che interagiscono tra loro. I domini di proteine spaccatura selezionati ai fini del presente protocollo sono indicati come la SpyCatcher (SC) e SpyTag dominio (ST) e sono derivati dal Streptococcus pyogenes fibronectina-binding protein (FbaB) 11. Questo sistema proteina spaccatura è insolito in quanto wgallina le due subunità sono all&#39;interno di prossimità un legame isopeptide forma spontaneamente tra la prossimale aspartico residui acidi acidi e lisina aminoacidi che creano un legame covalente. Formazione del legame Isopeptide non richiede l&#39;aggiunta di proteine chaperone, enzimi catalitici o cofattori e può verificarsi facilmente a temperatura ambiente (RT) e su un ampio intervallo di condizioni fisiologicamente rilevanti 12. Come prova di concetto, phosphotriesterase (PTE) (CE 3.1.8.1) dal Brevundimonas minuto è stato scelto per essere confezionato in E. coli derivati OMV 13. PTE contiene un sito attivo binuclear Zn / Zn e ha la capacità di abbattere organofosfati attraverso una reazione di idrolisi conversione aryldialkylphosphates in dialkylphosphates e alcoli arilici 14. L&#39;esposizione a organofosfati compromette il corretto funzionamento dei neurotrasmettitori attraverso inibendo l&#39;idrolisi di acetilcolina da acetilcolinesterasi alle giunzioni neuromuscolari makincomposti derivati g organofosfati estremamente pericolose 15. Prolungata o significativa esposizione a organofosfati si traduce spesso in preda a convulsioni incontrollabili e di solito provoca la morte tramite asfissia. Mentre PTE presenta la più alta attività catalitica verso paraoxon, un insetticida molto potente, è anche in grado di idrolizzare una vasta gamma di altri pesticidi e V / tipo G agenti nervini chimici 16. Per facilitare confezionamento OMV, un plasmide batterico creata che codifica un costrutto genico che contiene un promotore inducibile, una sequenza di localizzazione periplasmatica, ea breve polylinker monte della sequenza SC gene. Inserimento del gene PTE tra il leader e la sequenza SC permette la creazione di un interruttore genetico che colpisce la proteina di fusione PTE-SC allo spazio periplasmatico per imballaggi OMV. Mentre gli sforzi descritti qui concentrano sulla PTE, il gene dell&#39;enzima è intercambiabile e può essere facilmente sostituita con un&#39;altra sequenza genica a FACconfezionamento ilitate di un enzima alternativo o proteine. Come la seconda parte del collegamento sintetico, viene scelto per presentare la sequenza peptidica ST un&#39;abbondante proteina della membrana esterna (OmpA). Mentre la scelta di proteine ​​di ancoraggio può variare, è essenziale che la proteina ha un dominio permissiva che presenta all&#39;interno dello spazio periplasmatico, tollera il costrutto di fusione senza indurre citotossicità, è noto per essere presente in OMV, e non aggrega quando è ricombinante prodotta. OmpA è un kDa proteina transmembrana 37,2 porin che è noto per essere altamente espresso nella membrana esterna batterica e conseguente OMV 17. Si è implicato nel trasporto di piccole molecole, &lt;2 nm in termini di dimensioni, attraverso la membrana batterica 18. Native OmpA ha due domini strutturalmente unici, un barile motivo transmembrana beta e una porzione C-terminale periplasmically solubile noto per interagire con il peptidoglicano 19. Nel mutante OmpA-ST fusione designed qui la porzione C-terminale della OmpA stato eliminato e la ST è stata fusa alla periplasmically fronte N- o C-Termini. Eliminare la parte periplasmic del OmpA diminuisce il numero di interazioni tra la membrana esterna e il peptidoglicano con conseguente destabilizzazione della membrana che porta a iper-vescicole 7. Genomic OmpA stata mantenuta in aggiunta al costrutto OmpA-ST ricombinante espressa per mitigare destabilizzazione membrana lordo.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Any</td><td></td><td>Always prepare fresh or aliquot and freeze.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Any</td><td></td><td>Can be prepared ahead of time and stored at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Any</td><td></td><td>Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloramphenicol&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB Culture Media</td><td>Any</td><td></td><td>Other growth medias will likely work similarly.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Any</td><td></td><td>One of many potential suitable surfactants.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Baffled culture flasks</td><td>Any</td><td></td><td>The baffles promote higher levels of aeration.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH &gt; 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe Filter 0.45 &amp;micro;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical.</td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Culture Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g.</td></tr><tr><td>Sorvall Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Capable of centrifugal forces &amp;ge;150,000 x g.</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.</td></tr><tr><td>Spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Necessary for enzyme kinetic assays.</td></tr><tr><td>DLS/particle tracking</td><td>NanoSight&amp;nbsp;</td><td>LM10</td><td>Necessary for OMV size distribution and concentration determination.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>Suitable bacterial expression strain.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>Other plasmids can be used in place of these.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>Other plasmids can be used in place of these.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Example kit.</td></tr></tbody></table>

directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification

Un crescente interesse per l&#39;applicazione di tecniche di biologia sintetica per programmare vescicole membrana esterna (OMV) stanno portando ad alcune applicazioni molto interessanti e uniche per OMV in cui le nanoparticelle tradizionali si stanno rivelando troppo difficili da sintetizzare. Ad oggi, tutti i batteri Gram-negativi hanno dimostrato di produrre OMV confezionamento dimostrazione di una varietà di carico che comprende piccole molecole, peptidi, proteine ​​e materiale genetico. Sulla base della loro diversa carico, OMV sono implicati in molti processi biologici che vanno dalla comunicazione cellulare per il trasferimento genico e consegna dei fattori di virulenza seconda di quale batteri producono l&#39;OMV. Solo di recente sono batterica OMV diventati accessibili per l&#39;uso in una vasta gamma di applicazioni attraverso lo sviluppo di tecniche per il controllo e il confezionamento diretta di proteine ​​ricombinanti in OMV. Questo protocollo descrive un metodo per la produzione, purificazione, e l&#39;uso di enzima confezionato OMV prevede migliorata overala produzione ll di enzima ricombinante, aumento vescicole, e una maggiore stabilità dell&#39;enzima. utilizzazione di successo di questo protocollo comporta la creazione di un ceppo batterico che produce contemporaneamente una proteina ricombinante e la dirige per OMV incapsulamento attraverso la creazione di un collegamento sintetica tra la proteina ricombinante e una proteina della membrana esterna di ancoraggio. Questo protocollo dettagli anche i metodi per isolare OMV da colture batteriche così come le tecniche di manipolazione e cose da considerare quando si adattare questo protocollo per l&#39;uso per altre applicazioni uniche quali: la consegna della droga farmaceutica, diagnostica medica e risanamento ambientale.

L&#39;espressione simultanea di due proteine ​​ricombinanti, come è richiesto per la strategia di imballaggio OMV descritto in questo protocollo, può essere realizzato attraverso diverse vie. Qui, un sistema a due vettoriale è stato utilizzato con origini compatibili di replicazione e cassette geniche inducibili separati. Per l&#39;espressione del PTE-SC costruire un backbone plasmide commerciale (pACY184) è stato progettato per includere una arabinosio inducibile cassetta genica...

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Packaging proteine ​​diretto all&#39;interno della membrana esterna vescicole da<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Progettazione, produzione e purificazione

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

13.3K Views.  Naval Research Laboratory. A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented. 

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Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 tramite Microseeding e Zinco-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Ricerca

Biochimica

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Chimica

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Progettazione e Costruzione di Artificiale matrice extracellulare (AECM) Proteine ​​da<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Per la pelle Ingegneria dei Tessuti

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Bioingegneria

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

Escherichia coli-base della sintesi proteica Cell-Free: protocolli per la tecnologia della piattaforma robusta, flessibile e accessibile

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.

Diretto Assemblea di proteine Elastin-like in strutture supramolecolari definite e Incapsulamento di carico In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Biologia

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of conventional light microscopes. As the resolution for a given microscope cannot be easily enhanced, we present protocols to transform the small rod-shaped gram-negative Escherichia coli (E. coli) and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) into larger, easily imaged spherical forms called spheroplasts or protoplasts. This transformation allows observers to rapidly and clearly determine whether peptides lodge themselves into the bacterial membrane (i.e., membrane localizing) or cross the membrane to enter the cell (i.e., translocating). With this approach, we also present a systematic method to characterize peptides as membrane localizing or translocating. While this method can be used for a variety of membrane-active peptides and bacterial strains, we demonstrate the utility of this protocol by observing the interaction of Buforin II P11A (BF2 P11A), an antimicrobial peptide (AMP), with E. coli spheroplasts and B. megaterium protoplasts.

Here we present a protocol to produce gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts to clearly visualize and rapidly characterize peptide-bacteria interactions. This provides a systematic method to define membrane localizing and translocating peptides.

Produzione e visualizzazione di Sferoplasti batteriche e protoplasti di caratterizzare Peptide antimicrobico localizzazione

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Packaging proteine diretto all'interno della membrana esterna vescicole da

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine di membrana

Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Progettazione e Costruzione di Artificiale matrice extracellulare (AECM) Proteine da

Escherichia coli-base della sintesi proteica Cell-Free: protocolli per la tecnologia della piattaforma robusta, flessibile e accessibile

Diretto Assemblea di proteine Elastin-like in strutture supramolecolari definite e Incapsulamento di carico In Vitro

Identificazione di complessi proteici in

Produzione e visualizzazione di Sferoplasti batteriche e protoplasti di caratterizzare Peptide antimicrobico localizzazione

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Packaging proteine ​​diretto all'interno della membrana esterna vescicole da

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Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Progettazione e Costruzione di Artificiale matrice extracellulare (AECM) Proteine ​​da

Escherichia coli-base della sintesi proteica Cell-Free: protocolli per la tecnologia della piattaforma robusta, flessibile e accessibile

Diretto Assemblea di proteine Elastin-like in strutture supramolecolari definite e Incapsulamento di carico In Vitro

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Produzione e visualizzazione di Sferoplasti batteriche e protoplasti di caratterizzare Peptide antimicrobico localizzazione

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Packaging proteine diretto all'interno della membrana esterna vescicole da

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine di membrana

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