We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.

Nota: Il seguente protocollo è progettato per la sintesi di un bioconjugate proteina-colorante come mostrato in Figura 1 è un protocollo generale per la reazione di un maleimmide con proteine ​​superficie libera cisteina contenenti, con note inserite eventualmente per assistere con proteine ​​di membrana. bioconiugati, bioconiugati proteina-polimero e dimero proteina sintetica (proteina-proteina) bioconiugati. In questo caso particolare, la proteina iso-1 citocromo c ha una cisteina residui superficie disponibile per reagire che permette un&#39;etichettatura altamente specifico a verificarsi. Se una proteina di interesse ha più residui di cisteina, lo stesso protocollo si applica, sebbene con la perdita di specificità e omogeneità del prodotto. Chimica mira residui superficie di lisina, utilizzando N -hydroxysuccinimidyl esteri o isotiocianati, può essere un approccio più semplice se la specificità non è necessaria. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. bioconjugation schema di reazione. In caso esempio, una raccolta della luce, molecola antenna a base di rutenio verrà allegato al citocromo c via addizione di Michael di un maleimmide pendente sulla molecola antenna a base di rutenio e di un residuo di cisteina esposta (CYS102) sulla proteina. La zona rossa della superficie cit c indica il gruppo eme. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54157/54157fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 1. Purificazione del citocromo c Nota: Questo passaggio non è applicabile a tutte le proteine. Tuttavia, è importante sapere che una proteina ottenuta da un fornitore commerciale può contenere altri, proteina isoforme indesiderati che possono avere bisogno di essere rimosso da un&#39;ulteriore purificazione 13. <ol><li> Sciogliere 2,4 g di fosfato monosodico (M w = 120 g mol -1) in 1 l di acqua ultrapura per prepare una soluzione tampone contenente 20 mM NaH 2 PO 4. Regolare il pH con NaOH 1 M a pH 7. Nota: I tamponi fosfato utilizzati in questo protocollo deve essere rinnovato su base giornaliera, e filtrati attraverso un filtro a membrana 0,2 micron di cellulosa prima dell&#39;uso. </li><li> Sciogliere 29.22 g di cloruro di sodio (M w = 58.44 g mol -1) in 500 ml di NaH 2 PO 4 20 mM tampone per fare un 20 mM NaH 2 PO 4 e 1 tampone M NaCl. Questo è il buffer di eluizione per la purificazione nel passaggio 1.6). </li><li> Sciogliere 12.0 mg di liofilizzato citocromo c (cit c) in 6 ml di pH 7 20 mM tampone fosfato. </li><li> Separatamente sciogliere 14,7 mg di ditiotreitolo (DTT, M w = 154.25 g / mol) in 95,3 ml di acqua ultrapura per preparare un 1 M soluzione madre. Nota: La soluzione madre DTT deve essere preparata al momento, come questo reagente è suscettibile di ossidativo disattivazione in soluzione acquosa. </li><li> semeette 60 ml di soluzione 1 M DTT nella soluzione proteica per ridurre il citocromo c. Il colore della soluzione cambia dal rosso scuro al rosso chiaro sulla miscelazione. </li><li> Filtrare la soluzione proteica ridotta attraverso un filtro siringa PVDF vincolante 0,22 micron a basso contenuto proteico prima di iniettare su qualsiasi supporto cromatografico. </li><li> Fissare una colonna di scambio cationico 3,3 ml forte tra il ciclo di iniezione e rivelatore UV-Vis di una cromatografia liquida (FPLC) strumento veloce di proteine. </li><li> Equilibrare la colonna con 3 volumi di colonna di acqua ultrapura, seguono 3 volumi di colonna di 20 mM pH 7 tampone fosfato, con una portata di 1 ml / min. </li><li> Carico 1 ml di greggio ridotto cit c nel ciclo di iniezione, e avviare un metodo del gradiente 328-450 mM NaCl, in 5 volumi di colonna. Monitorare i 280 nm e 410 nm canali del rivelatore UV-Vis, e raccogliere il maggior picco. </li><li> Aumentare la concentrazione di sale per 1 M per 2 volumi di colonna per eluire iso-2 Cytochrome c, e dopo la colonna è stata lavata, riequilibrare la colonna con 2 volumi di colonna di tampone fosfato 20 mM prima di iniettare il successivo un&#39;aliquota grezzo. </li><li> Ripetere i passaggi 1,9-1,10 fino a quando tutta la proteina grezza è stato purificato. </li><li> Si riuniscono gli iso-1 contenenti frazioni e concentrarli con un 3,5 kDa peso molecolare Cutoff (MWCO) filtro rotativo e centrifugazione a 3.000 x g. </li><li> Caricare la proteina concentrata in 3,5 cassette dialisi kDa MWCO e dializzare contro ultrapura acqua durante la notte, con 2 cambi di acqua. </li><li> Determinare la concentrazione della soluzione proteica concentrata pura prendendo 10 microlitri, diluito a 100 ml con acqua ultrapura, e prendendo uno spettro di assorbanza. Utilizzare un basso volume, 100 ml cuvetta di quarzo per ottenere proteine ​​assorbanza spettri. Tipicamente, la concentrazione di proteine ​​non diluito è dell&#39;ordine di 50 - 100 micron. <ol><li> Utilizzare la caratteristica di picco 410 nm di cit c per quantificare il concentration utilizzando la legge di Beer-Lambert con un valore assorbimento molare di 97,6 cm -1 mM -1: A = ε × c × ι dove A è l&#39;assorbanza, ε è il coefficiente di assorbimento molare, c è la concentrazione in mM, e ι è la lunghezza del percorso della cuvetta in cm 13. </li></ol></li><li> A questo punto, dividere la proteina in 1 ml aliquote e tenere congelato a -20 ° C fino a quando non sono necessari. Cyt c può essere congelato e scongelato, senza perdita di struttura o di una funzione, ma i cicli di ripetizione inizierà a denaturare le proteine. Nota: Le proteine ​​tollerano il congelamento di diversi gradi. Ad esempio, le proteine ​​fluorescenti verdi 5,9 non deve essere congelato, invece conservati in frigorifero. </li></ol> 2. Sintesi del citocromo c bioconiugati <ol><li> Sciogliere 0,9 mg di rutenio (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (tpa) 2 -maleimide, 0,975 mmol, 6 equivalenti) in 600 ml di acetonitrile. Nota: se il maleimmide utilizzato è solubile in acqua, preparare una soluzione madre in acqua invece di acetonitrile. E &#39;importante per la maleimmide sia solubile nel tampone di reazione. Dimetilsolfossido, N, N -dimethylformamide e acetonitrile sono tutti comunemente utilizzati coadiuvanti per assistere nella dissoluzione di basso peso molecolare 12, spesso reagenti maleimmide idrofobiche. </li><li> Preparare una soluzione tampone contenente 100 mM tampone fosfato e 100 mm di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, M w = 292,24 g / mol), che quando diluito al 20 mm è a pH 7. Aggiungere idrossido di sodio solido fino a quando l&#39;EDTA è sciolto (diversi grammi tipicamente ) e regolare il pH a 7. </li><li> Sciogliere 2,87 mg di Tris (2-carbossietil) fosfina cloridrato (TCEP 15, M w = 286,65 g / mol) in 1 ml di acqua ultrapura per preparare una soluzione stock 10 mM. Questo passaggio è di importazioneant per garantire che la cisteina sulla proteina è completamente ridotto prima Maleimide accoppiamento 15. Nota: La soluzione madre TCEP deve essere preparata al momento per ogni reazione, perché il reagente è suscettibile di disattivazione ossidativo in soluzione acquosa. </li><li> Combinare 11.4 ml di acqua ultrapura con 3 ml di 100 mm di fosfato / EDTA soluzione madre in un tubo di plastica da 50 ml. Quando diluito ulteriormente con soluzioni di proteine ​​e azionari maleimmide la concentrazione di buffer sarà di 20 mm. Nota: Se la proteina essere etichettato è una proteina transmembrana, affinché un detergente adatto è aggiunto al buffer per solubilizzare le proteine. Se un detergente non viene utilizzata la proteina di membrana può lentamente precipitare che influirebbero negativamente rese di reazione. Utilizzare il detergente in tutte le fasi di purificazione successive. </li><li> Aggiungere 0,15 mmol (3 ml di una soluzione 50 mM, 1 equivalente) di purificato cit c al tampone fosfato-EDTA. </li><li> Aggiungere 7,5 ml di TCEP magazzino solution (0,075 mmol, 0,5 equivalenti) alla soluzione proteica e lasciare agitazione per 5 minuti per ridurre qualsiasi proteina che può avere dimerizzate causa dell&#39;ossidazione cisteina. Nota: Non aggiungere TCEP se la proteina di interesse non dimerize facilmente. Controllare questo eseguendo un gel di proteina in condizioni non riducenti. </li><li> Aggiungere 600 microlitri della soluzione di acetonitrile di Ru (II) (tpa) 2 -maleimide alla ridotta, soluzione tamponata di citocromo c, e lasciare la miscela di reazione sotto agitazione, al buio, a temperatura ambiente, per 24 ore. </li><li> Concentrare la miscela di reazione con 3,5 filtri di spin kDa MWCO, centrifugazione a 3.000 xg, ripetendo 2-3 volte con freschi 20 mM tampone fosfato fino a quando il filtrato è pulita. Rimuovere il più maleimmide non reagito dalla miscela di reazione possibile entro la successiva fase di purificazione. Nota: A questo punto, la miscela bioconjugation grezza può essere conservato in frigorifero, al buio. E &#39;importante rimuovere reagito colorante maleimmide dal centrifuge dialisi prima della memorizzazione come maleimmide può lentamente e in maniera non specifica reagire con residui di lisina sulla superficie della proteina. </li></ol> 3. Purificazione del citocromo c bioconiugati <ol><li> Sciogliere 2.4 g di sodio diidrogeno fosfato e 29.22 g di cloruro di sodio in 1 L di acqua ultrapura per preparare una soluzione tampone contenente 20 mM NaH 2 PO 4 e 0,5 M NaCl. Questo è il tampone di corsa per la purificazione immobilizzato metal-cromatografia di affinità (IMAC). </li><li> Sciogliere 17 g di imidazolo (M w = 68,077 g mol -1) in 500 ml di 20 mM NaH 2 PO 4 e 0,5 M tampone NaCl. Questo è il buffer di eluizione per la purificazione IMAC. </li><li> Regolare il pH di entrambi i buffer a pH 7 con 1 M NaOH o HCl, e filtrare 0,22 micron membrane di cellulosa rigenerata prima dell&#39;uso nel FPLC. </li><li> Come le colonne IMAC acquistati vengono spediti senza ioni metallici caricati sul colleumn, preparare la colonna per un Ni 2+ purificazione sede lavando la colonna con 3 ml di acqua ultrapura, 3 ml di soluzione di acetato di nichel 100 mM, e 6 ml di acqua ultrapura. Se la colonna non deve essere utilizzata immediatamente lavare con 3 ml di etanolo al 20% e conservare la colonna in frigorifero per prevenire la crescita batterica. </li><li> Collegare un Ni 2+ MOLLA 1 ml di colonna IMAC al FPLC tra il ciclo di iniezione e rivelatore UV-Vis. </li><li> Equilibrare la colonna con 3 volumi di colonna di 20 mM fosfato, 0,5 M NaCl tampone con una portata di 0,5 ml / min. </li><li> Carico 100 pl di miscela di reazione grezza (filtrato attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron) sulla colonna Ni 2+ IMAC. Lavare la colonna con 3 volumi di colonna di tampone di corsa per eluire non reagito cit c, seguito da un gradiente di imidazolo dal 0 a 125 mm oltre 3 volumi di colonna per eluire il rutenio bisterpyridine-citocromo c bioconjugate (Ru (II) -cyt c) . </li><li> Lavare il column con 250 mm tampone imidazolo per 5 volumi di colonna, poi ri-equilibrare la colonna con 20 mM fosfato, NaCl 0,5 M e ripetere il punto 3.7 fino a quando tutte le bioconjugate grezzo è stato purificato. </li><li> In comune le frazioni bioconiugati e concentrarli utilizzando un filtro rotativo 3,5 kDa MWCO, centrifugazione a 3.000 x g. </li><li> Caricare il bioconjugate concentrato in 3,5 cassette dialisi kDa MWCO e dializzare contro ultrapura acqua durante la notte, con 2 cambi di acqua. </li><li> Determinare la concentrazione della soluzione puramente bioconjugate concentrato mediante UV-Vis, utilizzando lo stesso valore di assorbimento molare iso-1 citocromo c (97,6 mM -1 cm -1) a 410 nm. Tipicamente, la concentrazione bioconjugate è dell&#39;ordine di 50 - 100 micron. </li><li> Dividere il bioconjugate in 25 microlitri aliquote e tenere congelato a -20 ° C fino a quando non sono necessari. </li></ol> 4. Caratterizzazione del citocromo c bioconiugati <ol><li> Scoraggiareminazione della massa bioconjugate da MALDI-TOF MS <ol><li> Disciogliere 10 mg di acido caffeico in 1 ml di una soluzione di acetonitrile / acqua / acido trifluoroacetico (80: 20: 0,1, v / v / v). </li><li> Diluire 5 ml di soluzione proteica concentrata con 5 ml di soluzione di acido caffeico. </li><li> Spot 0,5 ml di soluzione di acido caffeico sulla piastra segnale MALDI e consentire la soluzione si asciughi. </li><li> Spot 0,5 ml soluzione campione / matrice in cima a questo luogo acido caffeico, permettono il posto ad asciugare. Spot altri 0,5 ml di matrice del campione in cima a questa a &quot;sandwich&quot; il campione tra gli strati di matrice, e lasciare asciugare. </li><li> Acquisire spettri di massa in modo lineare utilizzando le impostazioni strumento idoneo per le proteine ​​16. </li></ol></li><li> Indagine su bioconiugati con elettroforesi su gel <ol><li> Preparare 10 ml di ogni campione di proteine ​​per essere eseguito diluendo campioni di proteine ​​con premiscelato dodecil solfato di litio (LDS, pH 8.4) del buffer (4x) toa concentrazione finale di circa 20 mg per pozzetto. Per i pozzi che richiedono condizioni riducenti, aggiungere 1 ml di 500 mm ditiotreitolo (DTT) agente riducente (10x). </li><li> campioni di calore a 70 ° C per 10 min. </li><li> Aggiungere 50 ml di premiscelato 1 M MES, 1 base M Tris, 2% SDS, 20 mM EDTA (pH 7.7) in esecuzione miscela tampone (20x) da una fonte commerciale a 950 ml di acqua ultrapura per preparare il buffer di gel in esecuzione. </li><li> Rimuovere il pettine di plastica dal gel e posizionare il gel nel serbatoio gel running. Riempire il serbatoio con tampone di gel di funzionamento in modo che i pozzetti vengono coperti con tampone. </li><li> Caricare i campioni con cura su un prefabbricato 12% Bis-Tris, 1 mm di gel 10-bene con puntali delle pipette lunghi per assistere a carico. Caricare il 10 proteine ​​marker di peso molecolare Prestained (3-188 kDa) in un pozzo mezzo del gel per facilitare l&#39;analisi. </li><li> Attivare il gel a 200 V di tensione costante per 35 min. </li><li> Colorare il gel con una soluzione di blu commerciale Coomassie per 2 ore, e lavare con ultrapacqua ure per 48 ore. </li></ol></li><li> Determinazione della purezza bioconjugate mediante spettroscopia UV-Vis <ol><li> Preparare 120 microlitri di 5 mM soluzioni di Ru (II) (tpa) 2 -maleimide, iso-1 citocromo c, e Ru (II) -cyt c. </li><li> Misurare lo spettro della linea di base della cuvetta di quarzo che contiene solo acqua ultrapura, da 250 nm a 650 nm. </li><li> Misurare lo spettro di ogni componente, garantendo la cuvetta viene sciacquata e asciugata tra una misurazione. </li><li> Tracciare la assorbanza di ciascun componente in funzione della lunghezza d&#39;onda, e confronta la somma lineare dei materiali di partenza con il prodotto finale per determinare se un rapporto 1: 1 di Ru (II) (tpa) 2 -maleimide di cit c ha reagito. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Purificazione dei materiali di partenza prima di una bioconjugation è della massima importanza. Proteine ​​ricombinanti ottenuti da fonti commerciali contengono spesso altre isoforme della proteina di interesse, che può avere diverse chimica di superficie e reattività. Ad esempio, nel bioconjugation descritto, il citocromo c commercialmente disponibile contiene una miscela di entrambi iso-1 e iso-2 cit c 12,14,17. Iso-2 e iso-1 forme di citocromo c sono sostanzialmente omolog...

Bioconjugation comporta covalentemente collegando una biomolecola con un altro o con una molecola sintetica, come un colorante, farmaco o un polimero. Metodi bioconjugation proteine ​​sono ora ampiamente utilizzate in molti chimica, biologia e nanotecnologia gruppi di ricerca con applicazioni che vanno dal fluorescente etichettatura tintura 1,2, rendendo di proteine ​​(anticorpi) -prodrugs 3 (coniugati anticorpo - ADC) sintesi di dimeri di proteine ​​4,5 , fino alla ibridi proteina-polimeri autoassemblanti 6,7 utilizzati in nanomedicina 8 e chimica dei sistemi 9. Specificità della chimica utilizzata per bioconjugation, pur non sempre critico, è di estrema importanza per bioconiugati proteiche più funzionali, in modo da non interferire con il sito attivo della proteina bersaglio. La reazione ideale bioconjugation deve soddisfare diversi criteri, tra cui: i) di targeting siti rare o uniche sulla proteina di interesse,ii) essere selettivo verso questo obiettivo, iii) procedere in condizioni non denaturanti per evitare proteine ​​dispiegarsi e iv) essere ad alto rendimento come la proteina bersaglio è solitamente disponibile solo a concentrazioni sub-millimolare. Il maleimmide - addizione di Michael cisteina si avvicina a soddisfare tutti questi criteri, e ha per questo motivo a lungo sostenuto uno status speciale nel campo della chimica bioconjugate 10. Questo perché i) molte proteine ​​contenenti residui di una sola cisteina sulla loro superficie può essere geneticamente lì, ii) al pH corretto la reazione è altamente selettivo verso cisteina, iii) procede senza intoppi in buffer acquosi e iv) è molto veloce con la seconda costante di velocità dell&#39;ordine di maleimmidi alle proteine ​​cisteina contenenti segnalati per superare i 5.000 m -1 sec -1, in alcuni casi 11. A condizione che la proteina di interesse può tollerare una piccola (≈ 5-10%) quantità di organico cosolvente 12, quasi tutte dye maleimide-funzionalizzata, poLymer, superficie o un&#39;altra proteina può essere collegato alle proteine. Inoltre, maleimmidi sono più specifiche per cisteine ​​su proteine ​​che iodoacetamides, che sono più inclini a reagire con altri nucleofili a pH elevato; e più stabile di coniugazioni disolfuro-based che devono essere mantenuti a pH acido per impedire lo scambio disolfuro 13. Qui riportiamo un protocollo generico per la coniugazione di molecole maleimmide-funzionalizzato ad una proteina contenente un singolo residuo di cisteina utilizzando la reazione tra un Ru (II) cromoforo sede e la proteina redox citocromo c come esempio. Questo protocollo è ugualmente applicabile alla maggior parte altre proteine ​​contenenti un accessibile residui superficiali cisteina e la corrispondente porta maleimide-funzionalizzati, sia un&#39;altra proteina, un colorante fluorescente, un cromoforo o un polimero sintetico.

<table><tbody><tr><td>sodium dihydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71691</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73575</td><td></td></tr><tr><td>cytochrome &lt;em&gt;c&lt;/em&gt;, from saccaromyces cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2436</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Tosoh SP-5PW, 07161</td><td>3.3 ml strong cation exchange column</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15&amp;nbsp;</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC900308</td><td>3.5 kDa spin filter</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td><td>Thermo Scientific</td><td>66333</td><td>3.5 kDa dialysis cassetes</td></tr><tr><td>Ru(II) bisterpyridine maleimide</td><td>Lab made</td><td></td><td>see ref (14)</td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3396</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03609</td><td></td></tr><tr><td>tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93284</td><td></td></tr><tr><td>imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>nickel acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244066</td><td></td></tr><tr><td>AcroSep IMAC Hypercell column</td><td>Pall</td><td>via VWR: 569-1008</td><td>1 ml IMAC column</td></tr><tr><td>0.2 micron cellulose membrane filter</td><td>Whatman</td><td>Z697958</td><td>47 mm filter for buffers</td></tr><tr><td>0.2 micron PVDF membrane filter</td><td>Merck-Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>syringe filters for proteins</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84426</td><td>Extremely corrosive! Use caution.</td></tr><tr><td>caffeic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60018</td><td>MALDI matrix</td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91707</td><td>extremely corrosive! Use caution</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC6060</td><td>Coomassie blue solution</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0342BOX</td><td>precast protein gels</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC5925</td><td>premade protein ladder</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td>premade gel sample buffer</td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0004</td><td>premade gel reducing agent</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0002</td><td>premade gel running buffer</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acta FPLC</td><td>GE</td><td></td><td>Fast Protein Liquid Chromatography</td></tr><tr><td>Cary 50 Bio Spectrophotometer</td><td>Varian-Agilent</td><td></td><td>UV-Vis</td></tr><tr><td>Milli-Q ultrapure water dispenser</td><td>Merck-Millipore</td><td></td><td>ultrapure water</td></tr><tr><td>Low volume UV-Vis Cuvette</td><td>Hellma</td><td>105-201-15-40</td><td>100 microliter cuvette</td></tr></tbody></table>

synthesis of protein bioconjugates via cysteine-maleimide chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

La sintesi di bioconiugati è confermato da tre metodi principali: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Spettrometria di Massa (MALDI-TOF MS), SDS-PAGE e ultravioletta-visibile spettroscopia (UV-Vis), come illustrato nelle figure 2, 3 e 4. Un aumento di massa corrispondente alla massa della piccola molecola aggiunto, e la mancanza di una proteina non reagito dimostra il legame covalente successo di Ru (II) (tpa) 2 -maleim...

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Dettagli Questo protocollo i passi importanti necessari per la bioconjugation di un cisteina contenente proteine ​​per un maleimmide, tra cui la purificazione dei reagenti, condizioni di reazione, di purificazione e caratterizzazione bioconjugate bioconjugate.

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

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38.5K Views.  The University of New South Wales.  Dettagli Questo protocollo i passi importanti necessari per la bioconjugation di un cisteina contenente proteine ​​per un maleimmide, tra cui la purificazione dei reagenti, condizioni di reazione, di purificazione e caratterizzazione bioconjugate bioconjugate. 

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Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. The most common techniques utilized are imaging modalities such as Magnetic Resonance Imaging (MRI), Positron Emission Topography (PET), and Computed Topography (CT) and are optimal for understanding the physical structure of the disease but can only be performed once every four to six weeks due to the use of imaging agents and overall cost. With this in mind, the development of &#8220;point of care&#8221; techniques, such as biosensors, which evaluate the stage of disease and/or efficacy of treatment in the clinician&#8217;s office and do so in a timely manner, would revolutionize treatment protocols.1 As a means to exploring ferrocene based biosensors for the detection of biologically relevant molecules2, methods were developed to produce ferrocene-biotin bio-conjugates described herein. This report will focus on a biotin-ferrocene-cysteine system that can be immobilized on a gold surface.

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Metodologia sintetico per Asymmetric Ferrocene derivati ​​sistemi bio-coniugati attraverso Solid Metodologia Resina a base di fase

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

Ricerca

Chimica

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

Analisi della accessibilità al solvente dei residui di cisteina in<em&gt; Mais Rayado Fino virus</em&gt; Particelle virus-simili Prodotto in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Piante e Cross-linking di peptidi a VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Immunologia e infezioni

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Costruzione di peptidi elicoidale Via foto-indotta del tiolo-ene/yne Hydrothiolation Thioether/vinile solfuro-tethered

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different positions. Preclinical studies have shown that the therapeutic index of these traditional ADCs can be improved by the site-specific linkage of toxins. However, current approaches to produce homogeneous ADCs have several limitations, such as low protein expression and slow reaction kinetics. In this protocol we describe how to set up an expression system to incorporate a cyclopropene derivative of lysine (CypK) into antibodies using genetic code expansion. This minimal bioorthogonal handle allows rapid conjugation of tetrazine derivatives through an inverse-demand Diels-Alder cycloaddition. The expression system here reported enables the facile production and purification of trastuzumab bearing CypK in each of the heavy chains. We explain how to link the antibody to the toxin monomethyl auristatin E and characterize the immunoconjugate by hydrophobic interaction chromatography and mass spectrometry. Finally, we describe assays to assess the stability in human serum of the dihydropyridazine linkage resulting from the conjugation and to test the selective cytotoxicity of the ADC for breast cancer cells with high levels of HER2 receptor.

Incorporating a cyclopropene derivative of lysine into antibodies allows the site-specific, rapid and efficient linkage of tetrazine-bearing molecules to generate antibody-drug conjugates.

Codifica genetica di un aminoacido Non-canonica per la generazione di anticorpo-farmaco coniugati attraverso una reazione di Bioorthogonal veloce

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Sintesi e determinazione della struttura di µ-conotossina PIIIA isomeri con bisolfuro diverse connettività

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Preparation of Site-Specific Cytotoxic Protein Conjugates via Maleimide-thiol Chemistry and Sortase A-Mediated Ligation

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as growth factor receptors on their surface. This feature enables development of highly selective therapeutics, the protein bioconjugates, composed of targeting proteins (antibodies or receptor ligands) connected to highly cytotoxic drugs by a specific linker. Due to very high affinity and selectivity of targeting proteins the bioconjugates recognize marker proteins on the cancer cells surface and utilize receptor-mediated endocytosis to reach the cell interior. Intracellular vesicular transport system ultimately delivers the bioconjugates to the lysosomes, where proteolysis separates free cytotoxic drugs from the proteinaceous core of the bioconjugates, triggering drug-dependent cancer cell death. Currently, there are several protein bioconjugates approved for cancer treatment and large number is under development or clinical trials.
One of the main challenges in the generation of the bioconjugates is a site-specific attachment of the cytotoxic drug to the targeting protein. Recent years have brought a tremendous progress in the development of chemical and enzymatic strategies for protein modification with cytotoxic drugs. Here we present the detailed protocols for the site-specific incorporation of cytotoxic warheads into targeting proteins using a chemical method employing maleimide-thiol chemistry and an enzymatic approach that relies on sortase A-mediated ligation. We use engineered variant of fibroblast growth factor 2 and fragment crystallizable region of human immunoglobulin G as an exemplary targeting proteins and monomethyl auristatin E and methotrexate as model cytotoxic drugs. All the described strategies allow for highly efficient generation of biologically active cytotoxic conjugates of defined molecular architecture with potential for selective treatment of diverse cancers.

<meta charset="utf8"></head><body>Preparazione di coniugati proteici citotossici sito-specifici mediante chimica maleimmide-tiolo e legatura mediata dalla sortasi A

Here we provide detailed protocols for a site-specific labeling of proteins with cytotoxic drugs using maleimide-thiol reaction and sortase A-mediated ligation.

Preparazione di coniugati proteici citotossici sito-specifici mediante chimica maleimmide-tiolo e legatura mediata dalla sortasi A

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as ...

Biochimica

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Funzionalizzazione superficiale delle nanoparticelle di Virus di epatite E utilizzando metodi di coniugazione chimica

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

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Preparazione di coniugati proteici citotossici sito-specifici mediante chimica maleimmide-tiolo e legatura mediata dalla sortasi A

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