This work was supported by a Howard Hughes Medical Institute Education Grant and an internal grant from the Saint Joseph's University chapter of Sigma Xi. We would also like to thank the three anonymous reviewers who helped strengthen the protocol and interpretations.

Le seguenti metodologie per la custodia, la cura e lo studio di zebrafish sono stati approvati dal di San Giuseppe Università IACUC. 1. Zebrafish alloggio e cure <ol><li> Ottenere il pesce zebra soggetto da un fornitore locale, o da popolazioni catturati in natura. Si prega di notare che gli alloggi il pesce zebra è soggetto alle linee guida IACUC e permessi aggiuntivi sono necessari per abitazioni popolazioni catturati in natura. </li><li> Identificare e zebrafish separata a seconda del sesso. In alternativa, saltare questo passaggio o sostituirlo con un diverso metodo di separazione basato sull&#39;ipotesi di studio. NOTA: caratteristiche sessuali sono difficili da determinare in zebrafish, soprattutto nelle femmine. Fare riferimento a queste linee guida 10 o manuali online utili per distinguere il sesso. </li><li> Casualmente separare le popolazioni ulteriormente nel rapporto appropriato di pesci focale allo stimolo di pesce. Nota: i pesci focale sono i soggetti del test hanno seguito attraverso la serie di behaviosaggi RAL, e pesce di stimolo sono le persone che occuperanno le camere di stimolo nei saggi di aggressione e shoaling. NOTA: Tradizionalmente, tra 1 e 5 pesci di stimolo per i pesci focale nelle analisi shoaling e un 1: 1 di stimolo: sono utilizzati focale rapporto pesce in saggi aggressione 14,17. Tuttavia, il ricercatore ha bisogno di progettare specificamente allo studio con l&#39;ipotesi in mente (ad esempio, dovrebbe stimolo pesce essere mantenuta costante per mantenere la coerenza nel comportamento dei pesci focale, o dovrebbe stimolo pesce essere ruotato tra ogni test per garantire una corretta randomizzazione). </li><li> Conservare tutti i pesci in rack abitative zebrafish (27,5-28,5 ° C) sotto un rigoroso 00:12 ciclo luce / buio. Nutrire tutti gli alimenti focale e di stimolo pesce fiocco giornaliera e settimanale artemie, nei giorni non di ricerca. </li><li> Assicurarsi che tutti i test si fanno tra ZT1 e ZT5 (tempo zeitgeber) per evitare gli effetti del ritmo circadiano 26. </li></ol> 2. Installazione randomizzazione e serbatoio <ol><li> RAndomize tutti gli individui a priori una determinata sequenza di test comportamentali. Impostare uno schema di randomizzazione coerente utilizzando un generatore di sequenza casuale linea 27 o un generatore di sequenza casuale da un pacchetto software statistico (R). <ol><li> Etichetta ogni saggio 1-3 e mantenere questo incarico coerente. Assegnare una sequenza casuale di ogni individuo e mappare la sequenza secondo l&#39;etichetta test comportamentale. Ad esempio, per tre saggi totali (1 mappati a shoaling, 2 mappato audacia, e 3 mappati per aggressione), un dato individuo può avere una sequenza randomizzata di &#39;2,3,1&#39;, che richiederà loro di svolgere la specifica test comportamentali nella sequenza specificata. </li></ol></li><li> Impostare i serbatoi del test (coraggio, aggressività, e shoaling) in laboratorio in luoghi che riducano al minimo la possibilità di stimoli esterni negativi ed essere sicuri di avere abbastanza spazio per una videocamera per catturare l&#39;intero serbatoio. Assicurarsi che la videocamera è enough chiarezza per visualizzare le etichette del serbatoio così come essere in grado di distinguere sottili comportamenti dei pesci focale e messa a punto la videocamera in questa posizione. </li><li> Registra tutti i test comportamentali con la fotocamera mantenuto nella stessa posizione con una vista completa del serbatoio specificata per minimizzare le differenze indesiderate scoring comportamentale come risultato di registrazioni differenziali. NOTA: Evitare di posizionare i serbatoi in aree soggette a traffico pesante e da porte come movimento e suono influenzerà il comportamento zebrafish. </li><li> Stabilire protocolli JWatcher unici 24 per aver eseguito ogni test comportamentale. Fare riferimento al manuale JWatcher per imparare a creare file master focali per assegnare i comportamenti a combinazioni di tasti e archivi di analisi focali per riassumere i dati raccolti. NOTA: JWatcher è un software di punteggio comportamentale che permette di scoring comportamentale affidabile e ripetibile misura 24. </li><li> Definire un sistema di etichettatura per monitorare la data, il numero di pesci, e il numero di test per tutte le analisi del comportamento (ad esempio,&#39;F5-B-123.115&#39; che implica Pesce 5, saggio di audacia, dicembre 31, 2015) e l&#39;etichetta all&#39;esterno del serbatoio con del nastro in vista e nel fuoco della telecamera. Tenere e registrare queste informazioni in un quaderno di laboratorio per una rapida consultazione e controllo di qualità futuro. </li><li> Impostare un serbatoio di acclimatazione che verrà utilizzato tra tutti i dosaggi e subito dopo gli individui sono rimossi dal rack custodia. NOTA: I serbatoi di acclimatazione e serbatoi terminali sono piccoli acquari (40 cm x 20 cm x 25 cm) con ghiaia e un filtro che assomigliano da vicino il rack custodia. </li><li> Dopo che i test sono tutti completati, trasferire l&#39;individuo in un serbatoio terminale separato che servirà come il serbatoio di destinazione finale per tutti gli individui focali utilizzate. Utilizzare un serbatoio che è grande abbastanza per ospitare un gruppo di individui per il resto delle loro vite (ad esempio, 25 litri). NOTA: E &#39;molto importante per mantenere le temperature e le condizioni dell&#39;acqua coerenti e simili Across tutti i serbatoi. Questo include l&#39;alloggio, acclimatazione, e tutti i serbatoi di test. </li></ol> 3. Lo svolgimento del saggio Aggressione <ol><li> Eseguire il test aggressione in una vasca rettangolare 19 L misura 30 cm x 15 cm x 10 cm. Outfit il serbatoio in pareti opache esterne circostanti tre lati del serbatoio aggressione, lasciando il fronte esposto per la visualizzazione, per ridurre stimoli esterni indesiderati. Dividere il serbatoio con una marcatura esterna in quattro quadranti rettangolari uguali e fissare uno specchio permanente (con mastice silicone) all&#39;interno del quadrante inferiore sinistro, inclinata di 22,5 ° formando un triangolo rettangolo contro all&#39;estrema sinistra del serbatoio. </li><li> Assicurarsi che la temperatura dell&#39;acqua nel serbatoio serbatoio di acclimatazione e aggressività è a 2 ° C del rack custodia. Per farlo, hanno acqua fresca età pre-riscaldato a 27,5-28,5 ° C pronti ad aggiungere al serbatoio aggressione. Si prega di notare che è importante per cambiare l&#39;acqua tra ogni test per eliminare ingiustificatistimoli olfattivi. </li><li> Trasferimento, da cupping, un pesce focale dalla rastrelliera custodia ad un serbatoio acclimatazione separata dove sarà acclimatarsi per 10 min. NOTA: E &#39;importante ridurre lo stimolo introdotte per il pesce attraverso un uso improprio. Individui di trasferimento come precedentemente descritto 27. <ol><li> In particolare, manualmente e con attenzione inserire un piccolo, bicchiere di plastica trasparente nel serbatoio di interesse. Senza interrompere il pesce tanto quanto il trasferimento, utilizzando una rete, lentamente raccogliere il pesce nella tazza. </li></ol></li><li> Assicurarsi che la videocamera è pronta a registrare confermando che il serbatoio di dosaggio aggressione (vedi punto 3.1) è a fuoco e subito prima di trasferire l&#39;individuo nel serbatoio aggressione, premere RECORD sul dispositivo. Trasferire il pesce focale tramite coppa dal serbatoio di acclimatazione al serbatoio aggressione. NOTA: E &#39;importante registrare prima che il pesce entrare nel serbatoio di aggressione per monitorare l&#39;ora esatta di entrata. </li><li> Registrare il AggrSerbatoio ESSIONE per 10 min e 30 sec e poi tazza il pesce focale dal serbatoio aggressioni nel serbatoio acclimatazione. </li><li> Durante la visione della registrazione, attendere 30 secondi dopo che il pesce è stato introdotto al serbatoio come un periodo di acclimatazione supplementare prima comportamenti di punteggio. </li><li> Utilizzando il sistema di punteggio JWatcher definito per comportamenti aggressivi, quantificare i seguenti comportamenti per 10 minuti: tempo trascorso vicino a specchio, serie di approcci specchio, il numero di freccette, il numero di tentativi di morsi (apertura della bocca in direzione dello specchio), e il numero di schermi laterali (dorsale, pettorali, anale e caudale erezione fin) 9. </li><li> Segna un singolo test aggressione almeno due volte, fino a quando il test viene segnato con alto accordo tra le iterazioni. </li></ol> 4. L&#39;esecuzione L&#39;audacia Assay <ol><li> Effettuare il test coraggio in un piccolo serbatoio trapezoidale 1.5 L, che misura 15 cm di altezza x 26,5 centimetri sopra x 22,5 cm di larghezza inferiore x 6 cm. Avvolgere carta opaca su tutti i lati of serbatoio ma lasciare il fronte esposto per la visualizzazione. Posizionare un unico pezzo sottile di nastro esterna al serbatoio per delimitare all&#39;inizio dalla parte inferiore del serbatoio. </li><li> Garantire che la temperatura dell&#39;acqua nel serbatoio coraggio è a 2 ° C del rack dell&#39;alloggiamento (vedi punto 3.2) </li><li> Trasferire il pesce focale dal rack custodia al serbatoio acclimatazione (vedi punto 3.3) e lasciare acclimatare per 10 min. </li><li> Assicurarsi che la videocamera è pronta a registrare il test audacia e, una volta pronti a trasferire il pesce focale, premere RECORD sul dispositivo. Trasferire il pesce focale dal serbatoio di acclimatazione al serbatoio audacia e record per 8 min e 30 sec. </li><li> Quando si guarda la registrazione, consentire un ulteriore periodo di acclimatazione 30 sec dopo il pesce viene introdotto nel serbatoio prima di punteggio. </li><li> Utilizzando il software JWatcher, quantificare i comportamenti audacia per 8 min. In particolare, quantificare i seguenti comportamenti: Tempo vicino alla superficie, la latenza di entrare parte superiore, il numero di Transitions nella parte superiore, e il numero di movimenti erratici (freccette) 29. </li><li> Segna un singolo test audacia almeno due volte, fino a quando il test viene segnato con alto accordo tra le iterazioni. </li></ol> 5. L&#39;esecuzione del saggio shoaling <ol><li> Effettuare il test shoaling in un serbatoio 76 L che ha tre scomparti divisi da due divisori di vetro sigillate con mastice siliconico (conseguenti tre scomparti sono costituiti da due zone di stimolo e uno scomparto focale). Esternamente, segnare due zone di preferenza designati 6.35 cm da ciascuno dei divisori in vetro delle zone di stimolo &quot;, indicativo di due lunghezze corpo 30. Applicare pareti opache esternamente attorno a tre lati del serbatoio shoaling, ma lasciare il fronte esposto per la visualizzazione. NOTA: Questa zona preferenza può essere personalizzato per verificare ipotesi specifiche per le specie di dimensioni diverse. </li><li> A seconda della natura dello studio, selezionare banchi stimolo per acclimatare per almeno 12 ore before testare e rimanere nel serbatoio shoaling tutto il corso dell&#39;esperimento. NOTA: banchi di stimolo sono raccolte di singoli pesci che vengono utilizzati per valutare come il pesce focale si comporta in presenza o in assenza di questi banchi. Diverse combinazioni di stimolo del banco possono essere selezionati per testare una serie di diverse ipotesi shoaling. Assicurarsi che i banchi di stimolo sono ruotati tra ogni zona di stimolo per evitare distorsioni lato e sono anche permesso di acclimatare per almeno 12 ore prima del test. </li><li> Trasferire il pesce focale nel serbatoio acclimatazione come descritto in precedenza (vedi punto 3.3) </li><li> Trasferimento, da cupping, il pesce focale dal serbatoio acclimatazione intermedio al compartimento centrale nel serbatoio shoaling. </li><li> Lasciare per un periodo di acclimatazione 10 minuti prima di un periodo di osservazione dal vivo di punteggio 10 min. In alternativa, registrare i saggi shoaling e segnare in seguito utilizzando JWatcher. I pesci sono determinato a essere shoaling quando sono all&#39;interno della zona di preferenza nella cameraospita il banco di destinazione. </li><li> Quantificare il tempo trascorso in ogni zona preferenza e il tempo trascorso nel volume centrale. </li><li> Come misura descrittivo, il calcolo &#39;la forza di shoaling&#39; (SOS). Assegnare un valore compreso tra -1 e +1 in cui la grandezza descrive come spesso un individuo banchi di pesci. </li><li> Calcolare il rapporto fra tempo dedicato shoaling divisa per l&#39;area delle zone shoaling e sottrarre la proporzione di tempo trascorso non shoaling e l&#39;area delle zone non shoaling. Inserire questa quantità rispetto alla somma del tempo trascorso in ciascuna zona divisa per il volume di ogni singola zona. Maggiori informazioni su questo calcolo può essere trovato in uno studio precedente 14. </li></ol> 6. Controllo di qualità dei dati <ol><li> Analizzare i dati utilizzando i dati tradizionali strumenti di analisi 31-32. </li><li> Test per l&#39;omogeneità della varianza con il test non parametrico di Levene per tutti i comportamenti. Se un comportamento è non omogenea effettuare un log-trasformazione33. </li><li> Verificare che non vi sono effetti sequenza (ad esempio, che l&#39;ordine randomizzazione non ha influenzato il comportamento degli individui) utilizzando un Kruskal-Wallis ANOVA sui dati omogenei 34. </li><li> Verificare che non vi siano pregiudizi laterali per il dosaggio shoaling creando modelli lineari generali univariati su indici sos con lato come un fattore fisso 35. NOTA: Se non ci sono poco o nessun problema con i dati, le analisi possono essere condotte a valle. Se ci sono problemi, riconciliarsi con le trasformazioni aggiuntive, razionalizzare con spiegazioni biologicamente plausibile, e / o aumentare le dimensioni del campione. </li></ol> 7. Analisi dei dati <ol><li> Calcolare a due code di Spearman correlazioni 36 per tutti i comportamenti a parte all&#39;interno dei saggi audacia e aggressione. </li><li> Calcolare i coefficienti di correlazione intraclasse (ICC) come un modello misto a due vie con coerenza per i test comportamentali che sono stati condotti più di un time per un dato individuo 36. In questo contesto, la Corte penale internazionale è una misura di quanto costantemente un pesce comportato in un determinato dosaggio misurato più di una volta. </li><li> Pre-elaborazione audacia e aggressione comportamenti di centraggio e norming tutti i comportamenti di prepararsi per l&#39;ingresso ad una analisi delle componenti principali (PCA) 25. NOTA: Pre-elaborazione delle misure per la centratura e norming è un passo fondamentale. Senza questa pre-elaborazione comportamenti passo che si verificano con maggiore frequenza e più variabile sarà eccessivamente influenzare le interpretazioni dei componenti estratti. Il processo di centraggio e norming rimuoverà questo pregiudizio. </li><li> Eseguire un PCA con una matrice di correlazione per determinare se l&#39;audacia e l&#39;aggressione sono collegati tra loro da una sindrome comportamentale. Interpretare carichi comportamentali di ogni significativa componente a&gt; 0,6. Vedere Budaev 2010 24 per una guida completa per la segnalazione PCA per studi comportamentali. Un grafico decrescente sarà informativo su cui eigenvectors dovrebbero essere tenuti per l&#39;interpretazione. </li><li> Utilizzando software statistico, come R o SPSS 31,32, estrarre i punteggi per ogni componente per ogni individuo. Le colonne rappresentano quante comportamento dell&#39;individuo proposta può essere spiegato dal componente particolare. </li><li> Calcola Spearman correlazioni rango tra i punteggi di regressione dei fattori e la forza del shoaling 36. NOTA: una sindrome comportamentale è considerato presente se audacia e aggressione comportamenti caricare sullo stesso componente o, se qualsiasi componente con notevoli carichi interpretabili si correla con la forza di shoaling. Si noti inoltre che la forza di shoaling non è incluso nel PCA per consentire una migliore interpretazione delle quantificazioni comportamentali più complessi (audacia e aggressività). La PCA si ortogonalmente crollare coraggio e aggressività caratteristiche in autovettori per massimizzare la quantità di variazione spiegata ed è adatto per queste misure complesse. Interpretazionela conseguente autovettori e regressione la nostra forza di misurazioni shoaling su ciascuno di loro dà un&#39;interpretazione molto più intuitivo di come ciascuno dei comportamenti complessi (coraggio e aggressività) si riferiscono ad una misurazione shoaling binario più ben definito (ad esempio, il pesce è shoaling o non shoaling). </li></ol>

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P., Krause, J., Couzin, I. D., Pitcher, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+fish+shoals+meet:+outcomes+for+evolution+and+fisheries.">When fish shoals meet: outcomes for evolution and fisheries.</a> Fish Fish. 4, 138-146 (2003).</li><li>Brown, M. B., Forsythe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Tests+for+the+Equality+of+Variances.">Robust Tests for the Equality of Variances.</a> J Am Stat Assoc. 69 (346), (1974).</li><li>Kruskal, W. H., Wallis, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ranks+in+One-Criterion+Variance+Analysis.">Use of Ranks in One-Criterion Variance Analysis.</a> J Am Stat Assoc. 47 (260), 583-621 (1952).</li><li>Nelder, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EthoVision:+a+versatile+video+tracking+system+for+automation+of+behavioral+experiments.">EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments.</a> Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).</li><li>Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personality+traits+and+dispersal+tendency+in+the+invasive+mosquitofish+(Gambusia+affinis).">Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis).</a> Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).</li><li>Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explaining+leptokurtic+movement+distributions:+intrapopulation+variation+in+boldness+and+exploration.">Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration.</a> Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).</li><li>Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+syndromes+differ+predictably+between+12+populations+of+three-spined+stickleback.">Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback.</a> J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).</li></ol>

The authors (GW and SPM) have no competing financial interests or conflicts of interest.

Il protocollo determinerà se ci sono associazioni coerenti in coraggio, aggressività e comportamenti shoaling in zebrafish. Se vi sono associazioni consistenti in una data popolazione tra uno di questi comportamenti, quindi una sindrome comportamentale è presente. Studiando sindrome comportamentale naturale di una popolazione, i ricercatori possono avere una comprensione più completa della sua dinamica comportamentale, struttura della popolazione, e la storia evolutiva possibilmente 3. Inoltre, manipoland...

Vi è un crescente corpo di letteratura indagare le associazioni tra comportamenti distinti all&#39;interno dei singoli animali da una data popolazione. Queste associazioni sono denominate sindromi comportamentali, e le misure includono tipicamente coraggio, aggressività, comportamento esplorativo, e la socialità 1-5. sindromi comportamentali sono preziosi per ragioni sia diretti che indiretti. Direttamente, la conoscenza delle sindromi comportamentali in grado di fornire una visione più completa della teoria evoluzionistica, la struttura della popolazione, e la dinamica della popolazione 3. Indirettamente, la conoscenza per quanto riguarda le associazioni di comportamento può informare i campi che quantificano il comportamento, come la farmacologia 6, tossicologia 7, genetica comportamentale 8,9, ed endocrinologia 10. A causa di questi benefici diretti e indiretti, una maggiore conoscenza delle sindromi comportamentali è particolarmente importante in organismi modello di uso comune come il pesce zebra. Gli studi che utilizzano zebrafish si trovano ina varietà di discipline, tra cui l&#39;analisi delle sindromi comportamentali 11-13. Per progredire le conoscenze nel campo della ricerca sindrome comportamentale, e perché altre discipline usano anche misure comportamentali per la verifica di ipotesi, sono necessarie descrizioni affidabili e succinte di comportamento per le analisi e interpretazioni validi e protocolli standardizzati faciliterà il confronto inter-studio all&#39;interno delle specie. Il nostro protocollo è stato sviluppato per misurare una sindrome comportamentale audacia-aggressione-shoaling in una popolazione di zebrafish laboratorio-allevati 14. Tuttavia, in base al protocollo (monitoraggio singoli pesci, garantire una corretta randomizzazione, e le analisi del caso) può essere facilmente modificato per una serie di misure comportamentali alternativi. Inoltre, saggi di audacia, aggressione, o shoaling possono essere eseguiti singolarmente per la verifica delle ipotesi distinte. Pertanto, mentre è il nostro obiettivo di descrivere come condurre uno studio sindrome comportamentale e il protocollo per il successo l individualela misurazione del comportamento evel, ogni aspetto di questa procedura può stare da solo. La letteratura sulle sindromi comportamentali estende su diversi gruppi tassonomici, da artropodi all&#39;uomo 4 e, per misurare una sindrome comportamentale, almeno due contesti comportamentali devono essere quantificati. Purtroppo, vi è spesso scarsa coerenza nei saggi che vengono utilizzati per quantificare la misura del comportamento di tutti gli assi di comportamento. Ad esempio, nel pesce, l&#39;audacia può essere misurata mediante saggi T-labirinto, test in campo aperto, o l&#39;introduzione di un romanzo o di stimolo stranieri 15. Studi aggressione nei pesci potrebbero comportare interazioni diade, saggi video di stimolo, o saggi modello in creta 12,16,17. Analogamente, l&#39;analisi del comportamento shoaling, che in genere comporta la misurazione di preferenza shoalmate, può essere eseguita in diversi tipi di serbatoi, con metodi differenti per determinare il tempo sezione 21-23. In questo protocollo un sottogruppo specifico del overall comportamento saggio repertorio è presentato. In particolare, questo protocollo presenta una metodologia per monitorare gli individui attraverso l&#39;audacia, l&#39;aggressività, e saggi shoaling in modo da facilitare il confronto all&#39;interno di individui per determinare se i confronti sono coerenti in tutti gli individui all&#39;interno di una popolazione. Abbiamo effettuato questo protocollo con zebrafish e amatitlania nigrofasciata (Amatitlania nigrofasciata) in studi precedenti 14,18, e funzionerà con tutti i pesci d&#39;acqua dolce di dimensioni simili. saggi Boldness sono condotti in un serbatoio trapezoidale 1,5 L che ha una linea orizzontale che delimita aree uguali dimensioni in porzioni superiore e inferiore del serbatoio. comportamenti quantificati includono il numero di transizioni dal pesce di prova tra la parte superiore e inferiore del serbatoio, il tempo trascorso in ciascuna porzione, il numero di freccette, e la latenza di entrare nella porzione superiore. Il dosaggio aggressione avviene in una vasca rettangolare 19L che comprendeuno specchio 3 pollici x 5 pollici inclinato di circa 22 ° situato nell&#39;angolo in basso a sinistra della vasca 19. Comportamenti quantificati comprendono la quantità totale di tempo trascorso dai pesci bersaglio interagire con lo specchio 20, insieme a specifici indicatori aggressivi - il numero di punture, schermi laterali, freccette tra i pesci di prova e il suo riflesso. Per questi indicatori specifici, punture sono definiti come affondi rapidi verso lo specchio con una bocca aperta, schermi laterali sono definiti come la svasatura di alette laterali, pettorali, anale e dorsale nella direzione dello specchio, e freccette eventuali movimenti erratici che sono non diretto verso lo specchio. Infine, il saggio shoaling quantifica il comportamento di un pesce di prova nel centro della camera di un serbatoio tri-incamerata. Le camere laterali della vasca sono vuote, o contengono una &quot;target banco&quot; di pesce, e il momento in cui il pesce di prova passa in prossimità di ogni camera laterale viene misurata 21-23. Un unico punteggio composito, denominato Strength di shoaling (SOS), viene calcolato per ogni pesce singolo test, specifico agli stimoli, e può essere usato in analisi valle 14. Tutti i comportamenti sono segnati da un unico spettatore, o più spettatori del software gratuito quantificazione del comportamento noto come JWatcher 24. Verifica la presenza di una sindrome comportamentale è in primo luogo uno sforzo statistico, e si consiglia di seguire le linee guida così come presentato dal Budeav 2010 25. In particolare, si consiglia di eseguire una analisi delle componenti principali (PCA) in data centrati e normati in cui il gli ingressi sono i vettori di comportamenti di un individuo in analisi con più misure comportamentali (ad esempio, l&#39;audacia e l&#39;aggressione). Il PCA, eseguita su una matrice di correlazione, riduce la dimensionalità delle misure comportamentali, ed estrae quindi la conoscenza più importante che spiega la maggioranza della variazione. I componenti estratti possono quindi essere interpretate based in alti carichi di fattore per il comportamento individuale di interesse e di regressione colonne possono essere estratte per ogni individuo sulla base dei componenti esplicativi. Questi punteggi di regressione possono poi essere confrontati alla misurazione SoS e altre varie misurazioni non-comportamentali come la dimensione del pesce o il sesso. Questo flusso di lavoro è stato implementato in uno studio delle sindromi comportamentali zebrafish in cui è stato scoperto una sindrome comportamentale specifica il sesso che esiste tra audacia e shoaling 14. In questa situazione, più audaci maschi zebrafish sono più propensi ad associare con, specie più aggressiva grandi (D. albolineatus), ma questa associazione si perde nelle femmine. Questo flusso di lavoro è stata implementata anche in uno studio di giovane detenuto parente ciclidi (Amatitlania nigrofasciata) 18, in cui una sindrome comportamentale non è stato scoperto, potenzialmente indicando la plasticità comportamentale della specie. Pertanto, il seguente protocollo è presentato wesimo un obiettivo di delineare la natura dei tre saggi specifici (coraggio, aggressività, e shoaling) nel quadro di studiare una sindrome comportamentale livello individuale.

<table><tbody><tr><td>Zebrafish Rack System</td><td>Aquaneering Inc</td><td>Cat. # ZS550</td><td></td></tr><tr><td>Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g</td><td>Pet Valu</td><td>Cat. # 31700</td><td></td></tr><tr><td>Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 L Trapezoidal Tank</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>Cat. # itsts-a</td><td></td></tr><tr><td>19 L rectangular tank</td><td>That Fish Place</td><td>211932</td><td></td></tr><tr><td>76 L rectangular tank</td><td>That Fish Place</td><td>212180</td><td></td></tr><tr><td>Hitachi KP-D20A CCD Camera</td><td>Prescott&#039;s, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3&quot; x 3&quot;</td><td>Michaels</td><td>Cat. # 10334162</td><td></td></tr><tr><td>Jwatcher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS Statistics Base</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

boldness, aggression, and shoaling assays for zebrafish behavioral syndromes

Una sindrome comportamentale esiste quando specifici comportamenti interagiscono in diversi contesti. Zebrafish sono stati soggetti di prova in studi recenti ed è importante standardizzare protocolli per garantire analisi adeguate e interpretazioni. Nei nostri studi precedenti, abbiamo misurato coraggio monitorando una serie di comportamenti (tempo in prossimità della superficie, la latenza nelle transizioni, numero di transizioni, e freccette) in una vasca trapezoidale 1.5 L. Allo stesso modo, abbiamo quantificato l&#39;aggressione da punture di osservazione, display laterali, freccette, e il tempo vicino a uno specchio inclinato in una forma rettangolare serbatoio 19 l. Dividendo un serbatoio di 76 L in tre parti, abbiamo anche esaminato le preferenze shoaling. Il saggio shoaling è un test altamente personalizzabile e può essere adattata per specifiche ipotesi. Tuttavia, protocolli per questo test anche devono essere standardizzati, però sufficientemente flessibile per la personalizzazione. In studi precedenti, camere di testa erano o vuoto, conteneva 5 o 10 zebrafish, o 5 danios Pearl (D. albolineatus). Nel following manoscritto, vi presentiamo un protocollo dettagliato e dati rappresentativi che accompagnano applicazioni di successo del protocollo, che permetterà per la replica degli esperimenti sindrome comportamentale.

A seconda della natura dello studio e protocollo specifico impiegato, diversi risultati distinte sono possibili in un esperimento sindromi comportamentale. Le tabelle e le figure, nei casi indicati di seguito, sono adattati dal nostro precedente studio pubblicato sulla rivista Behavioural Processes 14 e la rivista Zebrafish 17. Quando la proposta (come descritto sopra) è condotta nella sua interezza, due serie di risultati, &#39;entro correlazioni dosaggio&#39; e &...

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Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

L&#39;audacia, l&#39;aggressività e saggi shoaling per Zebrafish comportamentali Sindromi

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

boldness-aggression-shoaling-assays-for-zebrafish-behavioral

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K Views.  Saint Joseph’s University. This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

Video: Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Ricerca

Biologia

Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of stress-related diseases and psychiatric disorders, yet further studies into the genetic and neuronal regulation of stress are still required to develop better therapeutics. The zebrafish provides a powerful genetic model to investigate the neural underpinnings of stress, as there exists a large collection of mutant and transgenic lines. Moreover, pharmacology can easily be applied to zebrafish, as most drugs can be added directly to water. We describe here the use of the 'novel tank test' as a method to study innate stress responses in zebrafish, and demonstrate how potential anxiolytic drugs can be validated using the assay. The method can easily be coupled with zebrafish lines harboring genetic mutations, or those in which transgenic approaches for manipulating precise neural circuits are used. The assay can also be used in other fish models. Together, the described protocol should facilitate the adoption of this simple assay to other laboratories.

This manuscript describes a simple method to measure stress behaviorally in adult zebrafish. The approach takes advantage of the innate tendency that zebrafish prefer the bottom half of a tank when in a stressful state. We also describe methods for coupling the assay with pharmacology.

Approcci comportamentali allo studio dello stress innato nel zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

Comportamento

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizzati high-throughput analisi comportamentali nelle larve Zebrafish

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Neuroscienze

The Three-Chamber Choice Behavioral Task using Zebrafish as a Model System

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or cognitive impairment. We have modified and developed a three-chamber choice cognitive task similar to that used with rodents for use with hyperglycemic zebrafish. The testing chamber consists of a centrally located starting chamber and two choice compartments on either side, with a shoal of conspecifics used as the reward. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task at least 8 weeks later. Our data indicate that zebrafish respond robustly to this reward, and we have identified cognitive deficits in hyperglycemic fish after 4 weeks of treatment. This behavioral assay may also be applicable to other studies related to cognition and memory.

We present a behavioral chamber designed to assess cognitive performance. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task 8 weeks later. We also show that hyperglycemic zebrafish have altered cognitive performance, indicating that this paradigm is applicable to studies assessing cognition and memory.

L'attività comportamentale di scelta a tre camere utilizzando Zebrafish come sistema modello

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or ...

Modeling Fetal Alcohol Spectrum Disorders in Zebrafish to Characterize the Impact of an Adverse Embryonic Environment on Adult Social Behavior

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, and cognitive abnormalities are associated with FASD. Social difficulties are common behavioral abnormalities associated with FASD and often result in serious health issues. Animal models are critical to understanding the mechanisms responsible for ethanol-induced social defects. Zebrafish are social vertebrates that produce externally fertilized transparent eggs; these characteristics provide researchers with a precise yet simple procedure for creating the FASD phenotype and an innate behavior that can be leveraged to model the social deficits associated with FASD. Thus, zebrafish are ideal for characterizing the social deficits of FASD. The goal of the current protocol is to provide the user with a simple behavioral assay that can be used to characterize the consequences of a negative environment early during development and the effects it can have on social behavior in adulthood. The protocol can be used to characterize the effect mutations or teratogens have on adult social behavior. The protocol outlined here demonstrates how to characterize the social behavior of individual fish during a 20-min social assay. Furthermore, the data obtained using the current protocol provides evidence that the protocol can be used to characterize the effects of embryonic ethanol-induced social defects in adult zebrafish.

The goal of the current protocol is to outline the steps necessary to establish and use a social preference assay for adult zebrafish and demonstrate that it can be used to characterize ethanol-induced social defects.

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

Analisi comportamentale e fisiologica in un modello di zebrafish di epilessia

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The presented automatic video tracking system accomplishes this by using a mirror system and a calibration procedure that corrects for the considerable error introduced by the transition of light from water to air. With this system it is possible to record both single and groups of adult zebrafish. Before use, the system has to be calibrated. The system consists of three modules: Recording, Path Reconstruction, and Data Processing. The step-by-step protocols for calibration and using the three modules are presented. Depending on the experimental setup, the system can be used for testing neophobia, white aversion, social cohesion, motor impairments, novel object exploration etc. It is especially promising as a first-step tool to study the effects of drugs or mutations on basic behavioral patterns. The system provides information about vertical and horizontal distribution of the zebrafish, about the xyz-components of kinematic parameters (such as locomotion, velocity, acceleration, and turning angle) and it provides the data necessary to calculate parameters for social cohesions when testing shoals.

The use of a 3D automatic video system that can track individual and groups of zebrafish is described. As application example we explore the effects of the NMDA-receptor antagonist MK-801 on shoals of zebrafish.

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Batteria di test comportamentali per valutare gli effetti neurotossici nel pesce zebra adulto

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Autore in primo piano: Valutazione dei cambiamenti comportamentali ambientali e indotti da farmaci nel pesce zebra adulto 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

L'audacia, l'aggressività e saggi shoaling per Zebrafish comportamentali Sindromi

Riepilogo

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