Name: combined optogenetic and freeze-fracture replica immunolabeling to examine input-specific arrangement of glutamate receptors in the mouse amygdala
Uploaded: 2016-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala at JoVE.com

Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

microscopia elettronica freeze-frattura è stata una tecnica importante nella ricerca ultrastrutturali per oltre 40 anni. Tuttavia, la mancanza di mezzi efficaci per studiare la composizione molecolare delle membrane ha prodotto un calo significativo nel suo utilizzo. Recentemente, vi è stata una notevole ripresa della microscopia elettronica freeze-frattura a causa dello sviluppo di mezzi efficaci per rivelare proteine ​​integrali di membrana mediante etichettatura immunogold 1, 2, cioè la tecnica FRIL. La tecnica FRIL possiede diversi vantaggi rispetto ad altri metodi ultrastrutturali immunogold. In primo luogo, le proteine ​​sono facilmente accessibili agli anticorpi aumentando la sensibilità. In secondo luogo, l&#39;esposizione di gran parte delle specializzazioni di membrana plasmatica, come la membrana postsinaptica, sulla superficie bidimensionale della replica permette l&#39;ispezione della distribuzione spaziale e contiguità fisica di molecole di interesse senza ricostruzione laborioso e richiede tempo di serisezioni al ultrasottili. In terzo luogo, la disponibilità di entrambe le metà della membrana plasmatica aumenta il numero di proteine ​​che possono essere identificate per ogni singola struttura, forniti anticorpi adatti sono disponibili. Su fratturazione, la faccia idrofoba della membrana scissione è rivestito con carbonio-platino che consolida domini proteici rimanenti sulla superficie fratturata. Questo impedisce l&#39;accesso di anticorpi diretti contro antigeni in questi domini. Per esempio sulla P-faccia di una replica soli epitopi di fronte allo spazio protoplasmatica possono essere rilevati da anticorpi, mentre sul E-faccia solo epitopi fronte spazio exoplasmic può essere vincolato da anticorpi (vedere Figura 2). D&#39;altra parte, la tecnica FRIL soffre anche di alcune limitazioni 2. Come fratture si verificano in modo casuale, potrebbe essere difficile per colpire le cellule o strutture specifiche. Questo può anche portare ad una distorsione di campionamento, ad esempio, in raccolta sinapsi, data la diversa probabilità di fracturing lungo la membrana di strutture con diversa curvatura (ad esempio spine contro alberi). Inoltre, l&#39;assegnazione di proteine ​​di membrana ad una delle due facce è imprevedibile. Pertanto, la distribuzione di una proteina per la P-faccia o E-face, in particolare per studi quantitativi, deve essere attentamente esaminata utilizzando anticorpi reattivi ai domini intracellulari ed extracellulari. Infine, l&#39;identificazione nella replica di alcune strutture, quali terminali assoni presinaptici, può essere difficile quando basata solo sulle caratteristiche morfologiche. Tuttavia, l&#39;uso di anticorpi specifici per proteine ​​marker o la trasduzione di proteine ​​integrali di membrana categoria o canali utilizzando vettori virali offre ulteriori strumenti per facilitare l&#39;identificazione delle membrane fratturati. Ad esempio, questo studio ha approfittato della trasduzione del ChR2-YFP nei neuroni del talamo per identificare i loro efferenze assonale nella amigdala e l&#39;etichettatura per i recettori μ-oppioidi per rivelare me postsinapticombranes di neuroni ITC. Al fine di eseguire la tecnica FRIL con successo, particolare attenzione dovrebbe essere presa per quanto riguarda la fissazione dei tessuti. Strong fissaggio del tessuto (&gt; 2% paraformaldeide) può causare un alto tasso di cross-fratture e una diminuzione della sensibilità etichettatura. D&#39;altra parte, fissazioni deboli rendono la manipolazione dei tessuti e preparazione (ad esempio, il taglio di sezioni) difficile. E &#39;anche importante controllare che lo spessore dei blocchi rifilati corrisponde allo spessore del nastro biadesivo. Se lo spessore del provino è inferiore a quella del nastro, la superficie del tessuto non potrebbero attaccarsi alla superficie dei due vettori di metallo, di conseguenza il campione congelato non si rompe. Se il tessuto è più spessa, verrà compresso con distorsioni strutturali inevitabili quando è fatto il panino dei due vettori di rame. La temperatura alla quale il campione è fratturato (in questo protocollo, -115 ° C) gioca un ruolo importantesulla struttura della replica. Temperature elevate possono produrre un più alto tasso di manufatti quali condensa del vapore acqueo sulla superficie del tessuto prima o durante l&#39;evaporazione. Temperature più basse (&lt;-125 ° C) può aumentare il rischio di scissione di materiale durante la fratturazione. Questo materiale può cadere sulla superficie del campione o rimanere in contatto con esso. Questi fiocchi di materiale sono anche rivestito e contrastato producendo macchie scure sull&#39;immagine. Frattura a temperature più basse può anche influenzare la frequenza di cross-fratture in particolare per le piccole strutture pregiati come spine dendritiche. Un ulteriore passo critico nella preparazione di repliche è detergente-digestione. Se la digestione è incompleta, il tessuto non digerito appare come macchie scure sulla replica, confondere l&#39;analisi della struttura al TEM. Inoltre, il tessuto non digerito può non specificamente-trap o legare gli anticorpi, aumentando l&#39;etichettatura di sfondo. D&#39;altra parte, l&#39;uso di detersivos per la digestione tessuto può denaturare le molecole associate replica alterarne le strutture secondarie e terziarie. Pertanto, per alcuni antigeni potrebbe essere necessario diluire gradualmente la concentrazione di SDS con fasi di lavaggio aggiuntivi. Per immunomarcatura, la disponibilità di diverse dimensioni di particelle d&#39;oro coniugata ad anticorpi secondari permette di rilevare contemporaneamente, ma solo qualitativamente, più proteine, anche in microdomini specifici della membrana plasmatica, come la specializzazione postsinaptico. Tuttavia, a causa dell&#39;impedimento sterico, studi quantitativi sono generalmente limitati alla rilevazione di una sola molecola. La dimensione della particella oro può anche influenzare l&#39;efficacia etichettatura. Per l&#39;interpretazione del etichettatura FRIL, va tenuto presente che la particella immunogold può essere posizionato ovunque all&#39;interno di una semisfera con raggio di 20-25 nm dalla dell&#39;antigene causa della forma complessa flessibilecati da l&#39;anticorpo primario e secondario 26. Per ulteriori informazioni sulla teoria e la pratica della FRIL e tecniche correlate, rimandiamo il lettore anche ad altri articoli metodologici 27, 28. La tecnica FRIL è stata utilizzata di recente per alta risoluzione analisi quantitative della localizzazione dei recettori del glutammato in diverse popolazioni sinapsi 29, 30. Inoltre, la sensibilità di rilevazione della tecnica FRIL per AMPA-R è stato stimato alto come una particella immunogold per uno AMPA funzionale -R canale 29. Quindi, questo approccio è nel complesso molto utile per quantificare e analizzare il pattern di espressione post-sinaptica di AMPA-R e NMDA-R a sinapsi centrali. Qui, abbiamo dimostrato la sua applicabilità a livello delle sinapsi PIN / MGN-ITC, un sito molto probabilmente importante per la trasmissione di informazioni degli Stati Uniti durante il condizionamento alla paura. Utilizzando un anticorpo sollevata contro i residui amminoacidici extracellulari altamente conservati delle subunità del recettore AMPA GluA1-GluA4, abbiamo trovato una distribuzione uniforme delle particelle d&#39;oro all&#39;interno di cluster IMP corrispondenti alle specializzazioni membrana post-sinaptica. La densità di AMPA-R in spine ITC era significativamente più alta rispetto a sinapsi albero mirati da PIN / MGN afferenze del talamo. Ad entrambe le sinapsi della colonna vertebrale e degli alberi, è stata rilevata una correlazione positiva tra l&#39;etichettatura per AMPA-R e l&#39;area post-sinaptici, una caratteristica comune ad altre sinapsi glutammatergica 25. La varianza bassa densità di AMPA-R in sinapsi PIN / MGN-ITC indica una distribuzione omogenea simile ad altre sinapsi formate da efferenze talamo 7, ma diverso da sinapsi corticali 25. Al contrario, la densità di NMDA-R è stato più variabile e non differiva tra la colonna vertebrale e dell&#39;albero sinapsi che suggeriscono un regolamento diverso da quello AMPA-R. In futuro, l&#39;alta riproducibilità della tecnica FRIL non solo permetterà di valutare la composizione molecolare basale di sinapsi centrali, ma può facilitare il rilevamento di cHANGES nel numero dei recettori ionotropici del glutammato e distribuzione subsinaptico dopo aver appreso la paura, che completano le registrazioni ex-vivo di proprietà pre e post-sinaptici di questi ingressi. In conclusione, questo approccio potrebbe essere utilizzato da altri ricercatori per ottenere informazioni in rapporti struttura-funzione delle sinapsi eccitatorie specifico ingresso in molti altri circuiti neurali in cui districare l&#39;origine degli ingressi e la natura e la composizione di elementi postsinaptici è cruciale ma problematico .

La definizione dell&#39;architettura funzionale di biomembrane a scala nanometrica è stata contestata negli ultimi anni dallo sviluppo di una serie di tecniche immunomarcatura adatti per la microscopia elettronica a trasmissione. Tuttavia, queste tecniche, ad esempio, pre e post-embedding immunogold, hanno un certo numero di importanti limitazioni, che includono scarsa rilevazione di antigeni e / o valutazione quantitativa limitata di proteine ​​di membrana. Queste limitazioni diventano particolarmente critico nelle indagini della struttura fine del sistema nervoso, caratterizzato da un elevato grado di diversità delle cellule e sinapsi eterogeneità. Questa eterogeneità risultati di diversità sia strutturale e funzionale dettata dagli elementi pre-e post-sinaptici e con l&#39;espressione differenziale, arricchimento, o interazione di proteine ​​di segnalazione, come ad esempio i recettori, i trasportatori e le molecole effettrici. Un nuovo approccio per immunolabe direttaling di proteine ​​di membrana integrali o reticolate in repliche freeze-frattura detergente-solubilizzato (FRIL) è stata originariamente introdotta da Fujimoto due decenni fa 1. Questo metodo originale aveva, tuttavia, alcune limitazioni, per esempio, una grave frammentazione delle repliche, che hanno ostacolato le correlazioni significative di molecole marcate con celle mappate individualmente in tessuti complessi come il cervello. Circa 10 anni fa, e Shigemoto Fukazawa progressivamente migliorato la tecnica 2. Questo è stato di pari passo con gli sforzi di un altro gruppo di scienziati presso i laboratori Boulder della Colorado State University, che ha anche migliorato in modo significativo la tecnica, in particolare per lo studio delle giunzioni 3. Il miglioramento protocolli freeze-fratturazione e macchine, nonché l&#39;introduzione di congelamento rapido (ad alta pressione), consente ora investigatori di produrre repliche ininterrotta di esemplari di dimensioni relativamente grandi e hiimmagini di qualità gh della maggior parte dei componenti cellulari, senza le limitazioni ed i manufatti prodotti dai forti fissazioni chimici. La tecnica FRIL offre il grande vantaggio di una elevata quantitativa nell&#39;identificazione situ di uno o più proteine ​​(simultaneamente) in istologicamente mappati e cellule citologicamente individuati all&#39;interno dei tessuti complessi come il cervello, con il vantaggio aggiuntivo di una vista in pianta di pre- e postsinaptico elementi in una singola replica. Pertanto, la tecnica FRIL, nonostante i suoi molti ostacoli tecnici, mantiene la promessa per un numero di molto significative scoperte scientifiche, in particolare per la correlazione delle proprietà strutturali e funzionali di singole sinapsi. Durante gli ultimi decenni, una grande quantità di informazioni sono state ottenute sulla struttura, molecolare compongono, e la funzione fisiologica di sinapsi; eppure sinapsi sono morfologicamente e molecolarmente molto diversi a seconda della pa pre e post-sinapticaaffitto neuroni 4. Solo per una manciata di tipi di sinapsi sono stati studi struttura-funzione realizzato finora 5-7. Ciò è dovuto principalmente al vincoli tecnici che impedivano una precisa identificazione della natura degli elementi pre- e postsinaptici. Analisi ultrastrutturale ha fornito spunti critici nella variabilità delle specializzazioni post-sinaptici di membrana attraverso contatti sinaptici distinti, sia in termini di dimensioni sinaptica e contenuti in recettori per i neurotrasmettitori 6, che ha un grande impatto sulla forza e la plasticità della trasmissione sinaptica. Inoltre, un grande corpo di ricerca indica che il numero di recettori del glutammato ionotropici espressi a diversi tipi di sinapsi è regolata in modo afferent- e bersaglio-dipendenti 7-10. Qui, un metodo viene descritto che permette l&#39;analisi della composizione struttura e recettori di membrana specializzazioni postsinaptici Con definireelementi presinaptici d e funzione. Questo approccio sfrutta espressione presinaptica di recente sviluppo proteine ​​algali sensibili alla luce, come Channelrhodopsin2 (ChR2), e della tecnica FRIL per analizzare il pattern di espressione postsinaptico di α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionic L&#39;acido (AMPA-R) e N-metil-D-aspartato (NMDA-R) recettori del glutammato. Questo è dimostrato a livello delle sinapsi formate da assoni provenienti dai nuclei posteriori genicolati talamo-mediali (PIN / MGN) sui neuroni delle masse di cellule intercalate dell&#39;amigdala (ITC). Neuroni ITC sono piccole celle GABAergici spinosi organizzate in cluster che circondano il complesso basolaterale amigdaloideo (BLA) 11, 12. Neuroni ITC sono noti per ricevere input eccitatori da BLA neuroni principali e di indirizzare il nucleo centrale (CEA), fungendo così da un cancello inibitorio per il flusso di informazioni tra il BLA e CEA 12-15. Recentemente, abbiamo dimostrato che l&#39;ITNeuroni C situati nel cluster medio-dorsale tra il BLA e CEA ricevono anche gli ingressi eccitatori diretti e convergenti da sensoriali regioni corticali del talamo e temporali, che sono modificati sulla paura di apprendimento durante pavloviano paura condizionata uditivo 16. La paura condizionata è una delle forme più comprensibili di apprendimento associativo in termini di meccanismi cerebrali. Nel condizionamento alla paura, un inizialmente neutrale stimolo condizionato (CS, ad esempio, un tono) è accoppiato con uno stimolo avversivo incondizionato (Stati Uniti, ad esempio, una scossa piede dolce) con un conseguente associazione CS-US e condizionato risposta di paura 17, 18. Excitatory ingressi da entrambe le aree talamiche e neocorticale, che trasportano le informazioni che rappresentano il CS e gli stati Uniti, rispettivamente, erano noti per convergere su neuroni piramidali del nucleo laterale dell&#39;amigdala (lA) e a subire la plasticità 19. Il nostro lavoro precedente ha rivelato che le informazioni di input sensoriale è anche in parallelo trasmesso ai neuroni ITC <sup&gt; 16. Come primo passo verso una analisi molecolare meccanicistica di input sensoriali singole sinapsi sui neuroni ITC, abbiamo utilizzato un virus adeno-associato (AAV) per esprimere ChR2 etichettato con la proteina fluorescente gialla (YFP). Il AAV è stata iniettata PIN / MGN ei terminali assoni sono stati identificati dal loro espressione di ChR2-YFP. Abbiamo utilizzato entrambe le facce generati dalla tecnica FRIL per valutare la densità di post-sinaptici AMPA-R e NMDA-R a livello delle sinapsi formate con ITC neuroni di terminali degli assoni PIN / MGN.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td></tr><tr><td>Stereotactic frame mouse adaptor</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Gas anesthesia mask for mice</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td></tr><tr><td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td></tr><tr><td>Kwik Fill glass capillaries</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia machine, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germany</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperature Controler and heating pad</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td><td>Melag, Germany</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Germany</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1 ml/ml)</td><td>CP Pharma, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>can be replaced by other disinfectants</td></tr><tr><td>Analgesic, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Germany</td><td></td><td>can be replaced by other analgesics</td></tr><tr><td>Bepanthen eye ointment</td><td>Bayer, Germany</td><td>0191</td><td>can be replaced by other eye ointments</td></tr><tr><td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td><td>Nouvag, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Suture Needle</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde EM grade</td><td>Agar Scientific Ltd., United Kingdom</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Saturated picric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental</td><td>Sandoz, Austria</td><td>5,133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GenPure ultrapure water system</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>50131235</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>ISMATEC, Germany</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>MACHEREY-NAGEL, Germany</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scalpel</td><td>Alcon Laboratories, USA</td><td></td><td>can be replaced by other ophthalmic scalpels</td></tr><tr><td>Perfusion cannula</td><td>Vieweg, Germany</td><td>F560088-1</td><td>can be replaced by similar items from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;High-pressure&amp;nbsp; Freezing&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copper carriers</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polish</td><td>Henkel, Germany</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Chamois skin</td><td>Household supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hole punch, 1,5mm</td><td>Stubai, Austria</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Denatured ethanol</td><td>Donauchem, Austria</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Roth, Germany</td><td>9372.5</td><td>CAUTION!</td></tr><tr><td>High Pressure Freezing Machine HPM 010</td><td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Stereo-microscope</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>CAUTION!</td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Roth, Germany</td><td>E309.1</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5015-0001</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5016-0001</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage vessel</td><td>Cryopal, France</td><td>GT38</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Non-ionic detergent (Lavocid)</td><td>Werner &amp;amp; Mertz Professional, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Freeze-fracture and Replication&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>SANDURET 2-K</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21&amp;micro;</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>Freeze Fracture System BAF 060</td><td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic 12 well plate</td><td>Gr&amp;ouml;pel, Austria</td><td>14511</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, USA</td><td>T1503</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>SIGMA, USA</td><td>T3253</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck, Germany</td><td>1,064,041,000</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>SDS, Sodium lauryl sulfate</td><td>Roth, Germany</td><td>5136.1</td><td>CAUTION! ;&amp;nbsp; can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck, Germany</td><td>1,076,871,000</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germany</td><td>5429.3</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Universal Hybridization Oven</td><td>Binder, Germany</td><td>7001-0050</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunolabelling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, USA</td><td>A9647</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Anti-GFP Antibody</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPAR Antibody</td><td>Frontier Institute, Japan</td><td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody</td><td>ImmunoStar, USA</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM goat anti-guinea pig, 5 nm; secondary antibody</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM goat anti-rabbit, 15 nm; secondary antibody</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAR15</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody</td><td>AURION, Netherlands</td><td>DAR 10nm</td><td></td></tr><tr><td>Copper grids, 100 Parallel Bar</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Major Science, USA</td><td>MO-RC</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Pioloform Powder</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Roth, Germany</td><td>3313.1</td><td>CAUTION! ;&amp;nbsp; can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EM analysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada CCD camera</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, imaging software</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combined optogenetic and freeze-fracture replica immunolabeling to examine input-specific arrangement of glutamate receptors in the mouse amygdala

microscopia elettronica freeze-frattura è stata una tecnica importante nella ricerca ultrastrutturali per oltre 40 anni. Tuttavia, la mancanza di mezzi efficaci per studiare la composizione molecolare delle membrane ha prodotto un calo significativo nel suo utilizzo. Recentemente, c&#39;è stata una grande rinascita in freeze-frattura di microscopia elettronica grazie allo sviluppo di modi efficaci per rivelare proteine ​​integrali di membrana mediante l&#39;etichettatura immunogold. Uno di questi metodi è noto come detergente-solubilizzato Fermo-frattura Replica immunomarcatura (FRIL). La combinazione della tecnica FRIL con optogenetics consente un&#39;analisi correlata delle proprietà strutturali e funzionali delle sinapsi centrali. Usando questo approccio, è possibile identificare e caratterizzare neuroni sia pre-e post-sinaptici dai rispettivi espressione di un channelrhodopsin etichettato e marcatori molecolari specifici. L&#39;aspetto distintivo della specializzazione membrana post-sinaptica di GlutamatErgic sinapsi consente inoltre, su etichettatura dei recettori del glutammato ionotropi, per quantificare e analizzare la distribuzione intrasynaptic di questi recettori. Qui, diamo una descrizione step-by-step delle procedure richieste per la preparazione repliche associato e come immunolabel loro. Discuteremo anche gli avvertimenti e le limitazioni della tecnica FRIL, in particolare quelli associati con potenziali errori di campionamento. L&#39;elevata riproducibilità e la versatilità della tecnica FRIL, quando combinato con optogenetics, offre un approccio molto potente per la caratterizzazione dei diversi aspetti della trasmissione sinaptica a microcircuiti neuronali identificate nel cervello. Qui, forniamo un esempio di come questo approccio è stato utilizzato per acquisire conoscenze in relazioni struttura-funzione delle sinapsi eccitatorie in neuroni delle masse di cellule intercalate dell&#39;amigdala mouse. In particolare, abbiamo studiato l&#39;espressione dei recettori del glutammato ionotropici agli ingressi identificate oiginated dal intralaminare posteriore del talamo e nuclei genicolati mediale. Queste sinapsi sono stati mostrati per trasmettere informazioni sensoriali rilevanti per l&#39;apprendimento e la paura di subire cambiamenti plastici sulla paura condizionata.

La tecnica FRIL, quando combinato con l&#39;espressione di attuatori optogenetic di origine microbica 21, vale a dire, i canali integrati nella membrana plasmatica ed efficace trasportati anterogradely lungo gli assoni, permette di esaminare quantitativamente l&#39;espressione post-sinaptica di AMPA-R e NMDA-R in un sottogruppo definito delle sinapsi. Questo è mostrato qui per gli assoni provenienti da nuclei del talamo distinti (ad esempio, PIN / MGN) sui neuroni ITC nell&#39;amigdala. Questo approccio consente una analisi molecolare di singole sinapsi di input sensoriali sui neuroni ITC, un gruppo di cellule che sono stati refrattari ad una caratterizzazione anatomica e molecolare dettagliato finora. Quattro settimane dopo l&#39;iniezione stereotassica del rAAV-ChR2-YFP nella PIN / MGN, assoni ChR2-YFP-positivi densamente innervati il ​​LA, l&#39;area amygdalostriatal di transizione (Astria) e il paracapsular I mediale<html> TC cluster nel amigdala, un modello pienamente coerente con tracciamento studi precedenti 16, 22. Abbiamo anche rilevato intenso oro immunomarcatura per il ChR2-YFP sul P-faccia degli assoni e terminali in freeze-frattura replica da rAAV-ChR2-YFP- topi iniettati (Figura 5A), ma non in repliche di topi non iniettati. La specializzazione membrana post-sinaptica di sinapsi glutammatergica in una replica può essere osservata come un gruppo di particelle intramembrane (PIM) sulla E-faccia della membrana plasmatica 2, 23, ed è spesso accompagnata dalla P-faccia della sua membrana plasmatica presinaptica 7 (Figura 5B-C). Queste caratteristiche hanno permesso di identificare la specializzazione postsinaptica delle sinapsi glutammatergica formate da terminali degli assoni PIN / mgN (figura 5 e 6). Abbiamo etichettato AMPA-R con un anticorpo che riconosce tutti i quattro subunità (GluA1-4), mentre NMDA-R sono state rilevate utilizzando un anticorpo contro l&#39;essenziale subunità NR1. S copi &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; A causa della mancanza di strumenti per rilevare sulla stessa replica se queste sinapsi sono stati realizzati con spine dendritiche o alberi di neuroni ITC, abbiamo identificato il volto replica corrispondente per μ recettori oppioidi, come neuroni esprimono ITC postsinaptica elevati livelli di questi recettori 24. Questo necessari all&#39;identificazione degli stessi profili postsinaptici nei due repliche (Figura 5C-F e Figura 6A-D) utilizzando una strategia che impiega punti di riferimento (Figura 4E) . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> Figura 5. Individuazione di ChR2-YFP e ionotropi glutammato recettori sulla replica da Immunogold particelle. (A) un terminale cross-fratturato assone (azzurro) e piccole porzioni del suo P-faccia marcato con particelle d&#39;oro 15 nm rilevazione ChR2-YFP. All&#39;interno del terminale, la membrana of numerose vescicole sinaptiche possono essere osservati (sv). Nota la specificità del immunomarcatura in gran parte ristretta alla membrana plasmatica. Etichettatura per ChR2 identifica il terminale come proveniente da PIN / MGN. Il terminale forma un sinapsi asimmetrica con una spina dorsale. La specializzazione membrana post-sinaptica (PSD) sulla E-viso mostra un cluster caratteristica di particelle intramembrane ed è identificata con particelle d&#39;oro 5 nm rivelano AMPA-R. (B) Il P-volto di un assone ChR2 che esprimono (marcato con 15 particelle d&#39;oro nm) viene mostrato al confine con due dendriti, uno di loro possiede due PSD marcati con particelle d&#39;oro 5 nm rivelano NMDA-R. (CD) facce opposte delle membrane pre e post-sinaptici di una sinapsi PIN / MGN-ITC. (C) Il P-faccia del terminale esprime ChR2 (marcato con particelle d&#39;oro 15 nm) e si estende per l&#39;E-volto di due alberi dendritiche, uno dei quali contiene due PSD etichettati per AMPA-R (5 particelle nm oro). ( <strong&gt; D) La corrispondente P-face dei due dendriti è etichettato per i recettori μ-oppioidi (10 particelle nm oro). (EF) viste ingrandite delle zone indicate dalle linee tratteggiate. Barre di scala:. 500 nm <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Immunoparticelle per AMPA-R nelle sinapsi PIN / MGN-ITC sono stati trovati in tutto il cluster IMP, suggerendo una distribuzione omogenea all&#39;interno della specializzazione post-sinaptica (Figura 5E). A significativamente più alta (spaiato t-test p &lt;0.018) Densità di etichettatura AMPA-R è stata osservata in PIN / MGN sinapsi su spine ITC (715 ± 38 particelle d&#39;oro / micron 2, n = 32) rispetto alle sinapsi Onto dendriti ITC (590 ± 44 particelle d&#39;oro / micron 2, n = 32). Nel complesso, la densità di AMPA-R in PIN sinapsi / MGN-ITC ha mostrato un relativamente bassovarianza (Coefficiente di variazione, CV = 0,37) conformemente ad una distribuzione omogenea. Immunoparticelle per NMDA-R nelle sinapsi PIN / MGN-ITC sono stati spesso osservato equamente distribuiti all&#39;interno di cluster IMP post-sinaptici (Figura 5B). La densità di etichettatura NMDA-R è stata simile (spaiato t-test p = 0.39) tra il PIN / MGN sinapsi su spine ITC (1070 ± 153 particelle d&#39;oro / micron 2, n = 8) e dendriti ITC (812 ± 183 particelle d&#39;oro / micron 2, n = 9). A differenza di quanto osservato per AMPA-R, la densità di NMDA-R in PIN sinapsi / MGN-ITC era molto variabile (CV = 0,54). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> Figura 6. AMPA-R e NMDA-Rs immunomarcatura a identificati PIN / MGN-ITC sinapsi. (AB) facce opposte delle membrane pre e post-sinaptici di un PIN / MGN-ITCsinapsi fatta su una spina dendritica in cui il P-faccia del terminale esprime ChR2 (etichettato con 15 particelle d&#39;oro nm) e la PSD su una spina dendritica è etichettato per AMPA-R (5 particelle nm oro). (CD) viste ingrandite delle aree contornate dalla linea tratteggiata. Queste zone sono stati ruotati di circa 45 ° in senso antiorario per permettere una migliore visione del PSD. (E) a dispersione del numero di particelle AMPA-R contro zona sinaptica in spine ITC e dendriti. In entrambe le strutture, una correlazione positiva è stata osservata. (F) a dispersione del numero di particelle NMDA-R contro zona sinaptica in spine ITC e dendriti. Una significativa correlazione positiva è stata rilevata solo in spine dendritiche. Barre di scala:. 500 nm <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Perchéil P-faccia della membrana plasmatica presinaptica spesso sovrapposto nella parte del cluster PIM post-sinaptica, potremmo stimare l&#39;area sinaptica di solo il 30% delle sinapsi (spine: significano zona 0,032 micron 2, gamma: 0,007-0,063 um 2, n = 8; dendriti: 0,047 micron 2, gamma: 0.024 a 0,166 micron 2, n = 11). Questi erano in una gamma simile come precedentemente analizzato glutamatergica telencefalico sinapsi 25. In entrambe le spine e dendriti, il numero di immunoparticelle oro per AMPA-R in singole sinapsi era correlata positivamente con l&#39;area sinaptica (Spearman, spine: r = 0.88, dendriti: r = 0.60, p &lt;0,0001) (Figura 6E). Viceversa, il numero di immunoparticelle oro per NMDA-Rs è risultata correlare con la zona sinaptica spine (Spearman, spine: r = 0,90, p &lt;0.002) ma non in dendriti (r = 0,21, p = 0,29) (Figura 6F ).

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Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Combinato optogenetic e Freeze-frattura Replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-Input di glutammato recettori nell&#39;amigdala mouse

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K Views.  Medical University of Innsbruck. This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

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Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Ricerca

Comportamento

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Neuroscienze

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

Indicatori di sinapsi singola di Soldamento Release e Uptake in Acute Brain Slices da Topi Normali e Huntington

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this purpose, an in vivo imaging technique that detects calcium transients in neurons using genetically encoded calcium indicators (GECIs), a miniaturized fluorescence microscope, and a gradient refractive index (GRIN) lens has been developed and successfully applied to many brain structures1,2,3,4,5,6. This imaging technique is particularly powerful because it enables chronic simultaneous imaging of genetically defined cell populations for a long-term period up to several weeks. Although useful, this imaging technique has not been easily applied to brain structures that locate deep within the brain such as amygdala, an essential brain structure for emotional processing and associative fear memory7. There are several factors that make it difficult to apply the imaging technique to the amygdala. For instance, motion artifacts usually occur more frequently during the imaging conducted in the deeper brain regions because a head-mount microscope implanted deep in the brain is relatively unstable. Another problem is that the lateral ventricle is positioned close to the implanted GRIN lens and its movement during respiration may cause highly irregular motion artifacts that cannot be easily corrected, which makes it difficult to form a stable imaging view. Furthermore, because cells in the amygdala are usually quiet at a resting or anesthetized state, it is hard to find and focus the target cells expressing GECI in the amygdala during baseplating procedure for later imaging. This protocol provides a helpful guideline for how to efficiently target cells expressing GECI in the amygdala with head-mount miniaturized microscope for successful in vivo calcium imaging in such a deeper brain region. It is noted that this protocol is based on a particular system (e.g., Inscopix) but not restricted to it.

In vivo microendoscopic calcium imaging is an invaluable tool that enables real-time monitoring of neuronal activities in freely behaving animals. However, applying this technique to the amygdala has been difficult. This protocol aims to provide a useful guideline for successfully targeting amygdala cells with a miniaturized microscope in mice.

Imaging di calcio in vivo di successo con un microscopio miniaturizzato head-mount nell'amigdala del topo che si comporta liberamente

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

<a href='https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53853/combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to'>Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)</a>This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica is mounted on a grid and visualized under an electron microscope.

Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a procedure for analyzing synaptic connectivity between medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala neurons using acute amygdala brain slices from mice. The mPFC neurons in these mice express channelrhodopsin fused to a fluorescent protein. The channelrhodopsins facilitate ion influx and action potential generation in the mPFC neurons upon light activation. Consequently, mPFC neurons release neurotransmitters that bind to postsynaptic amygdala neurons, triggering postsynaptic currents that are recorded to visualize mPFC-amygdala connectivity.

Visualizzazione e mappatura dei percorsi neuronali in una fetta di cervello dell'amigdala

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Visualization and ...

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Generation of Tilted Amygdala Slices from a Mouse Brain

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates the generation of tilted amygdala slices from a mouse brain. The brain is positioned at an angle on the vibratome specimen stage to obtain slices containing the amygdala and axons from the medial prefrontal cortex that form synaptic connections with the amygdala. The brain slices are maintained at the physiological temperature to preserve the tissue for further experiments.

Generazione di fette di amigdala inclinate da un cervello di topo

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Acute Slices

	...

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Generating a Coronal Brain Slice Exposing the Amygdala Regions from a Mouse Brain

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the preparation of thin coronal brain slices from a murine brain, exposing the amygdala regions rich in synaptic connections from the medial prefrontal cortex. The slices are then recovered in oxygenated artificial cerebrospinal fluid to maintain neuronal viability.

Generazione di una fetta di cervello coronale che espone le regioni dell'amigdala da un cervello di topo

1. Preparation of Acute Slices

	Prepare ACSF, cutting solution, tools (scissors, scalpel, forceps, spatula, Pasteur pipette), and agar blocks.
	NOTE: 1 L ...

Combinato optogenetic e Freeze-frattura Replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-Input di glutammato recettori nell'amigdala mouse

Riepilogo

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