This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.

1. Preparazione del capillare microreattore <ol><li> Tagliare il diametro interno 100 micron (ID) x 360 micron di diametro esterno (OD) capillare ad una lunghezza di 7-8 cm, e 20 micron ID x 90 micron OD capillare per 3-5 cm con il coltello capillare di vetro; verifica al microscopio che entrambe le estremità capillari hanno un taglio netto, diritta, senza bave sporgenti. </li><li> Inserire il 20 um ID x 90 micron OD capillare in un&#39;estremità del 100 micron ID x 360 micron OD capillare, per una lunghezza di ~ 6 mm; in caso di necessità, osservare questa operazione al microscopio. </li><li> Applicare una piccola goccia di colla E6000 attorno alla giunzione dei 90 micron OD / 100 micron capillari ID con la fine di un Q-tip, e lasciare che la colla cura O / N a temperatura ambiente. </li><li> Tagliare il inserita 20 micron ID x 90 micron OD capillare ad una lunghezza di ~ 10-15 mm; questo sarà l&#39;emettitore Elettrospray. </li><li> Pre-tagliare il 1/32 &quot;OD PEEK, 1/16&quot; OD PEEK e 1/16 &quot;PTFE vasca ODzione in pezzi di 4-5 cm di lunghezza; questi saranno i manicotti utilizzati nei sindacati capillari per la fornitura di una connessione senza perdite. </li><li> Collegare l&#39;estremità opposta del 100 micron ID x 360 micron OD capillare per un&#39;unione PEEK; usare un manicotto 1/32 &quot;PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite. </li><li> Inserire / serrare un pezzo di ~ 5 cm di lunghezza 1/16 &quot;tubo PTFE nella estremità opposta del raccordo. </li><li> Pesare ~ 4 mg di C18 (5 micron) particelle in un pre-pulito / secca 2 ml flacone di vetro; aggiungere 0,5 ml di isopropanolo, chiudere la fiala e disperdere il liquame nella vasca da bagno ultrasonicatore. </li><li> Prelevare con una siringa 250 microlitri di circa 200 pl liquami, inserire l&#39;ago della siringa nel &quot;tubo 1/16 PTFE dell&#39;unione PEEK, e dispensare lentamente l&#39;impasto in 100 micron ID x 360 micron OD capillare, osservare al microscopio come capillare riempie di particelle fino una lunghezza di 2-3 mm di imballaggio è realizzato; questo sarà il microreattore (Figura 1) il 20 μ.m ID capillare trattiene le particelle nel microreattore con un effetto Keystone. 15 </li><li> Risciacquare microreattore con ~ soluzione 50 ml di H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / v, e poi con soluzione ~ 50 ml di H 2 O / CH 3 CN 98: 2 v / v. </li></ol> 2. preparazione di soluzioni campione Nota: Le operazioni che comportano la manipolazione di solventi organici e acidi e la preparazione della soluzione devono essere eseguite in una cappa aspirante. Indossare occhiali, guanti e indumenti protettivi. <ol><li> Risciacquare con CH 3 OH e asciugare alcune fiale di vetro (4 ml) e tubi di polipropilene (15 ml). </li><li> Preparare 10 ml di una soluzione di H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) in una provetta da 15 ml polipropilene miscelando 9,8 ml H 2 O con 200 microlitri CH 3 CN; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Preparare 10 ml di una soluzione di H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) in una provetta da 15 ml polipropilene miscelando 5 ml H 2 &lt;/ sub&gt; O con 5 ml di CH 3 CN; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Preparare 4 ml di una soluzione acquosa acidificata (TFA 0,01% v / v) con l&#39;aggiunta di 4 microlitri TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) in una fiala di vetro 4 ml; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Preparare 4 ml di una soluzione organica acidificata (TFA 0,01% v / v) con l&#39;aggiunta di 4 microlitri TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) in una fiala di vetro 4 ml; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Pesare 16 mg di NH 4 HCO 3 con una microbilancia analitica in una fiala di vetro 4 ml; aggiungere 4 ml di H 2 O / CH 3 CN: soluzione (98 2 v / v) e disperdere per sonicazione; questo si traduce in una soluzione 50 mM di NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) in tampone acquoso. </li><li> Pesare 5 mg di proteina standard (ad esempio, albumina di siero bovino, emoglobina α / β, citocromo C, anidrasi carbonica, α-2-HS-glicoproteina, etc.) con una microbilancia analitica in una fiala di vetro 4 ml; aggiungere 4 ml DI wateR e disperdere mediante ultrasuoni; questo genere si traduce in una soluzione ad elevata concentrazione di livello pM. </li><li> Preparare 1 ml di soluzione proteica (1-2 mM) diluendo la soluzione a concentrazione alto livello mM con un volume adeguato di NH 4 HCO 3 (50 mM) tampone acquoso; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Preparare la soluzione di tripsina (5 mM) sciogliendo 20 mg sequenziamento grado tripsina in 170 microlitri NH 4 HCO 3 (50 mM) tampone acquoso; disperdere mediante ultrasuoni. </li></ol> 3. apparato sperimentale Nota: Il sistema LTQ-MS è dotato di una sorgente ESI modificato che comprende un XYZ stadi casa costruzione che abilita l&#39;interfacciamento dello spettrometro di massa a vari approcci ingresso campione. <ol><li> Scollegare il microreattore capillare dall&#39;unione PEEK e connettersi al PEEK Tee. </li><li> Inserire lunga ~ 2 centimetri di filo Pt nel braccio laterale del PEEK Tee; utilizzare un &quot;manicotto 1/32 PEEK per fornire un-Perdita di connessione e per isolare il filo Pt. </li><li> Collegare un 50 micron ID x 360 micron OD (~ 0,5 m di lunghezza) trasferimento del campione capillare all&#39;estremità opposta del PEEK Tee; usare un manicotto 1/32 &quot;PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite. </li><li> Fissare il Tee PEEK sul XYZ-stage e posizionare la ESI emettitore ~ ​​2 millimetri di distanza dal capillare di ingresso spettrometro di massa. </li><li> Collegare il filo Pt alla sorgente di alimentazione ESI dello spettrometro di massa. </li><li> Collegare l&#39;estremità opposta del capillare trasferimento del campione all&#39;unione di acciaio inossidabile; usare un manicotto 1/16 &quot;PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite. </li><li> Collegare un lungo 4-5 cm 1/16 &quot;tubo in teflon all&#39;estremità opposta del raccordo in acciaio inox e inserire l&#39;ago della siringa 250 microlitri nel tubo PTFE, accendere la pompa e impostare la portata al valore desiderato (ad esempio, 2 microlitri / min). </li><li> tandem Input parametri di acquisizione dati MS nel pacchetto software che controlla lo strumento un MSd salvare come file il metodo per preparare la messa a punto per l&#39;esecuzione di analisi; per il sistema LTQ-MS, utilizzare i parametri di analisi dipendenti seguenti dati: l&#39;esclusione dinamica abilitato per 180 sec con larghezza di massa esclusione ± 1,5 m / z; uno Stato membro scan seguito da uno zoom e MS 2 scansioni su i primi 5 picchi più intensi, zoom larghezza di scansione ± 5 m / z; dissociazione indotta da collisione (CID) parametri impostati in larghezza isolamento 3 m / z, energia di collisione normalizzato del 35%, l&#39;attivazione Q 0.25, e il tempo di attivazione di 30 msec. </li></ol> 4. Configurazione Microfluidic <ol><li> Preparare un dispositivo microfluidico in vetro o substrati polimerici; 16-18 il layout del dispositivo è fornito in Figura 2A, consistente in un microreattore (1) (0,13 mm Lunghezza larghezza x 2 mm x 50 micron di profondità) collegato ad un ingresso (2 ), uscita (3) e una porta laterale (4); i canali comunicanti per le manipolazioni fluidica sono ~110 micron di larghezza e ~ 50 micron in profondità; una struttura multicanale (5), costituito da ~ 1,5-2 micron profondo x 10 micron di larghezza x 100 micron lunghi microcanali posti 25 micron a parte, fungerà da filtro per trattenere le particelle nel microreattore. </li><li> Attiva connessioni fluido consegna al chip incollando connettori specializzati verso le luci di entrata, o escogitando un supporto polimerico che ospita raccordi per la consegna fluido (Figura 2B). 16 </li><li> Preparare una sospensione di particelle di C18 (5 micron), come descritto al punto 1.8; consegnare la sospensione al microreattore con una siringa utilizzando 1/16 &quot;tubo in teflon collegato alla porta lato di chip (4); chiudere la porta dopo il caricamento delle particelle con colla epossidica e la cura per 1 ora in stufa a 90 ° C 16. </li><li> Inserire un capillare (20 micron ID x 90 micron di lunghezza OD x 10 mm) nel porto di uscita, sigillare con la colla E6000, e lasciare che la cura O / N; questo diventerà l&#39;emettitore ESI ( <sTrong&gt; 6). </li><li> Collegare un 50 micron ID x 360 micron OD (~ 0,5 m di lunghezza) trasferimento del campione capillare alla porta di ingresso del circuito integrato (2); collegare l&#39;estremità opposta del capillare ad un microlitri siringa 250 e la pompa a siringa, come descritto in 3.6-3.7. </li><li> Collocare un leggero connettore PEEK Tee sulla linea di trasferimento del campione appena prima luce di ingresso (2) e inserire un filo di Pt sul braccio laterale della T, come descritto in 3.2; questo sarà l&#39;elettrodo ESI. </li><li> Fissare il dispositivo microfluidica sul palco XYZ con l&#39;emettitore ESI posizionato ~ 2 mm di distanza dal capillare spettrometro di massa in ingresso; preparare la MS per l&#39;analisi come descritto in 3.8. </li></ol> 5. Campione Caricamento, proteolitica Digestione e eluizione per MS Analysis Nota: Tutte le fasi di trasferimento soluzione / campione vengono eseguite con l&#39;ausilio di una pompa a siringa e dovrebbe consentire per alcuni minuti supplementari per completare, per compensare la dead-volumes associati alle linee di trasferimento da e per il microreattore; il tempo necessario dipenderà dalle portate coinvolti. <ol><li> Risciacquare microreattore e prepararla per analisi infondendo una soluzione acquosa di NH 4 HCO 3 (50 mM) in H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) a 2 ml / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri. </li><li> Caricare il campione di proteine ​​(1 pM) sul microreattore infondendo la soluzione campione a 2 microlitri / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri. </li><li> Infondere la soluzione di tripsina (5 mM) sopra la proteina adsorbita sul microreattore a 2 microlitri / min per 1-3 min. </li><li> Quench il processo di digestione proteolitica risciacquando il microreattore con una soluzione acquosa acidificata di TFA (0,01% v / v) in H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) a 2 ml / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri. </li><li> Avviare eluendo la proteina digerire dal microreattore infondendo una soluzione organica acidificato di TFA (0,01%v / v) in H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) a 300 Nl / min. </li><li> Accendere il processo di acquisizione dei dati MS e la tensione ESI (~ 2.000 V); acquisire i dati MS utilizzando i parametri di acquisizione dati forniti al punto 3.8; osservare l&#39;eluizione dei peptidi trittico. </li></ol> 6. Elaborazione dati <ol><li> Elaborare i dati in tandem MS con un motore di ricerca compatibile con il formato di dati di MS crudo. <ol><li> Elaborare i file RAW LTQ-MS utilizzando un organismo specifico database di proteine ​​minimamente ridondante; caricare i dati grezzi nel motore di ricerca, impostare le tolleranze di massa genitore e ioni frammento di 2 e 1 Da rispettivamente, e utilizzare frammenti completamente solo triptici con un massimo di due perse spaccature per la ricerca; non consentono modifiche post-; fissare i tassi di rilevamento di alta e media fiducia falsi (FDR) a 1% e il 3%, rispettivamente, e non consentono modifiche post-traduzionali. </li></ol></li><li> Filtrare i dati per selezionare solo di alta fiduciapeptide corrisponde alle proteine ​​presenti nel database; valutare i risultati proteine ​​e livello peptide. </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

Il microreattore descritto in questo lavoro fornisce un facile da implementare apparato sperimentale per mineralizzazione enzimatica delle proteine ​​per permettere l&#39;analisi MS e identificazione in meno di 30 min. I vantaggi di questo sistema, rispetto agli approcci convenzionali, comprendono semplicità, velocità, basso consumo di reagenti e bassi costi. In particolare, non vi è alcuna necessità di costosi perline tripsina immobilizzati e cartucce. La preparazione del microreattore capillare è semplice <st...

L&#39;identificazione e la caratterizzazione di proteine ​​purificate si ottiene spesso utilizzando tecniche MS. La proteina viene digerito con un enzima e dei suoi peptidi sono ulteriormente analizzato da MS utilizzando un semplice apparato sperimentale infusione. digestione proteolitica è necessaria per la generazione di piccoli frammenti peptidici che rientrano nel range di massa utile della maggior parte degli analizzatori MS, e che può essere facilmente frammentato attraverso bassa energia di collisione di dissociazione indotta per generare aminoacido informazioni sulla sequenza. Per proteine ​​isolate o semplici miscele proteiche, non vi è alcuna ulteriore necessità di separazione cromatografica dei peptidi prima della rivelazione MS. Una miscela di 25-50 peptidi può essere facilmente analizzato infondendo il campione con una pompa a siringa direttamente nella sorgente MS ioni. Lo spettrometro di massa può eseguire l&#39;analisi e confermare la sequenza di una proteina in un breve lasso di tempo. Con i moderni metodi di acquisizione dati, questo processo può essere realizzato well&#39;ambito pochi minuti o addirittura secondi. Il fattore limitante nel completare l&#39;intero processo in un breve lasso di tempo è la fase di digestione proteolitica. In genere, questa viene eseguita nell&#39;arco di alcune ore (o O / N), in soluzione, a 37 ° C, con substrato: rapporti di enzimi di (50-100): 1. Per ridurre il tempo di digestione enzimatica a minuti o secondi, microreattori enzima immobilizzato, in forma di reattori microfluidici o cartucce disponibili in commercio, sono stati descritti. 1-6 Tipicamente, l&#39;enzima è immobilizzato da covalente, non covalente / adsorbimento fisico, complesso formazione o incapsulamento, 3,6 la maggiore efficienza del processo enzimatico viene abilitato dalla grande superficie-volume e rapporti enzima-to-substrato. Ulteriori vantaggi di reattori immobilizzate comprendono la riduzione autolisi e interferenze da parte dell&#39;enzima in analisi MS, una migliore stabilità enzimatica e riutilizzabilità. Una varietà di approcci, utilizzando il vetro o dispositivi microfabbricate polimerici sono stati descritti,utilizzando enzimi immobilizzati su sfere magnetiche da interazioni antigene-anticorpo, 7,8 intrappolati nelle reti di nanoparticelle d&#39;oro, 9 incapsulato in titanio-allumina sol-gel 10 e nanozeolites, 11 o catturati attraverso Ni-NTA o His-Tag formazione del complesso. In alternativa 6 , sono stati sviluppati capillari aperti tubolari con enzimi immobilizzati, pure. 12 Inoltre, maggiore segmentazione proteolitica è stata dimostrata utilizzando controllata irradiazione a microonde 13 o tecnologia cicli di pressione assistita o pressione (PCT) per ridurre i tempi di reazione a 30-120 min. 14 Nonostante i molteplici vantaggi dei reattori enzima immobilizzato, i costi delle cartucce commerciali è alto, la disponibilità di dispositivi microfluidici per uso di routine è limitato, e l&#39;uso di tecnologie microonde o PCT risultati in necessità di strumentazione aggiuntiva. L&#39;obiettivo di questo lavoro è stato quello di sviluppare un metodo che circumveNTS questi svantaggi, e che può essere facilmente implementato in ogni laboratorio per potenziare ricercatori un approccio semplice ed efficace per l&#39;esecuzione di scissione enzimatica di proteine ​​in preparazione per l&#39;analisi MS in pochi minuti. Questo approccio si basa sull&#39;uso di idrofobici, C18-particelle che sono pre-caricate in un capillare o dispositivo microfluidica, e l&#39;adsorbimento della proteina (s) di interesse nelle particelle seguita da digestione enzimatica durante l&#39;infusione dell&#39;enzima sul letto impaccato e proteine ​​catturato (s). In questo approccio, il substrato viene immobilizzato attraverso interazioni non covalenti, e l&#39;enzima è infuso proteina immobilizzata. L&#39;efficienza proteolitica digestione viene aumentata dalle grandi superfici di particelle che espongono la proteina per la trasformazione enzimatica, distanze e tempi di diffusione da e verso la superficie delle particelle ridotta, migliorato trasferimento di massa, nessun legame covalente che possono influenzare l&#39;attività dell&#39;enzima, capacità rapidamente evaluate combinazioni di diversi enzimi, disponibilità, e multiplexing se il processo viene eseguito in un formato microfluidica. Questo approccio è dimostrato con l&#39;uso di una miscela di proteine ​​standard e tripsina-enzima più comunemente usato per la digestione proteolitica prima della rilevazione ESI-MS. Lo spettrometro di massa utilizzato per la rilevazione in questo studio era uno strumento lineare trappola quadrupolo (LTQ).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ion trap ESI-MS</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>LTQ</td>
			<td>The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ stage</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Multiple parts</td>
			<td>The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>G81-278</td>
			<td>The microscope is used to observe the microreactor packing process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance/Metler</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46600-204</td>
			<td>The balance is used to weigh the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath/Branson</td>
			<td>VWR</td>
			<td>33995-540</td>
			<td>The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump 22</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>552222</td>
			<td>The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q ultrapure water system&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ZD5311595&#160;</td>
			<td>The MilliQ water system is used to prepare purified DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor/Eppendorf (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53513-410</td>
			<td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor/Eppendorf (100 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53513-406</td>
			<td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor/Eppendorf (10 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53513-402</td>
			<td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (100 &#181;m ID x 360 &#181;m OD)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP100375</td>
			<td>This capillary is used for the fabrication of the microreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (20 &#181;m ID x 100 &#181;m OD)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP020090</td>
			<td>This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (50 &#181;m ID x 360 &#181;m OD)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP050375</td>
			<td>This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary cleaver</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>23740-U</td>
			<td>This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>Eclectic Products</td>
			<td>E6000 Craft</td>
			<td>This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Epo-Tek</td>
			<td>353NDT</td>
			<td>This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed phase C18 particles (5 &#181;m)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Zorbax 300SB-C18</td>
			<td>These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe/glass (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81130-1725RN</td>
			<td>The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal reducing PEEK Union (1/16&#8221; to 1/32&#8221;)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>ZRU1.5FPK</td>
			<td>This union is used to connect the 250 &#181;L syringe to the microreactor for loading the 5 &#181;m particle slurry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel union (1/16&#8221;)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>ZU1XC</td>
			<td>The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume PEEK Tee connector (1/32&#8221;)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>MT.5XCPK</td>
			<td>The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tee connector (light weight)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>C-NTXFPK</td>
			<td>This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pt wire (0.404 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66260-126</td>
			<td>The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/16&#8221; OD)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>TTF115-10FT</td>
			<td>The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing (0.015&#8220; ID x 1/16&#8221; OD)</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td>1565</td>
			<td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 &#181;m ID transfer capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing (0.015&#8221; ID x 1/32&#8221; OD)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>TPK.515-25</td>
			<td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean-cut polymer tubing cutter</td>
			<td>Valco</td>
			<td>JR-797</td>
			<td>This cutter is used to pre-cut the 1/16&#8221; and 1/32&#8217; Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber vial (2 mL)</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>HP-5183-2069</td>
			<td>The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber vial (4 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-948</td>
			<td>The vials are used to prepare sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube (15 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-286D</td>
			<td>The vials are used to prepare buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylinder (100 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24710-463</td>
			<td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylinder (10 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24710-441</td>
			<td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-386</td>
			<td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (100 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53503-781</td>
			<td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (10 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53511-681</td>
			<td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass substrates</td>
			<td>Nanofilm</td>
			<td>B270 white crown, 3&#8221; x 3&#8221;</td>
			<td>These are glass substrates for microchip fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male nut fitting (1/16&#8221;)</td>
			<td>Upchurch</td>
			<td>P203X</td>
			<td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport assembly</td>
			<td>Upchurch</td>
			<td>N-122H</td>
			<td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standards</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Multiple #</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast enzymatic processing of proteins for ms detection with a flow-through microreactor

La grande maggioranza di spettrometria di massa (MS) a base di metodi di analisi di proteine ​​implicano un&#39;attività digestione enzimatica prima della rivelazione, tipicamente con tripsina. Questo passo è necessario per la generazione di piccoli peptidi peso molecolare, generalmente con MW &lt;3000-4000 Da, che rientra nell&#39;intervallo di scansione effettiva della strumentazione di spettrometria di massa. protocolli convenzionali coinvolgono O / N digestione enzimatica a 37 ° C. I recenti progressi hanno portato allo sviluppo di una varietà di strategie, tipicamente coinvolge l&#39;uso di un microreattore con enzimi immobilizzati o di una serie di processi fisici complementari che riducono il tempo necessario per proteolitica digestione per alcuni minuti (per esempio, microonde o ad alta pressione). In questo lavoro, si descrive un approccio semplice e conveniente che può essere implementato in qualsiasi laboratorio per la realizzazione rapida digestione enzimatica di una proteina. La proteina (o miscela di proteine) è adsorbito sulla alta perf C18-bonded fase inversaormance particelle di silice cromatografia liquida (HPLC) precaricate in una colonna capillare, e tripsina in tampone acquoso viene infusa in particelle per un breve periodo di tempo. Per attivare il rilevamento on-line MS, i peptidi triptici vengono eluite con un sistema solvente con maggiore contenuto organico direttamente nella sorgente MS ioni. Questo approccio consente di evitare l&#39;uso di particelle ad alto prezzo degli enzimi immobilizzati e non richiede alcun aiuto per il completamento del processo. Protein digestione e l&#39;analisi del campione completo può essere realizzato in meno di ~ 3 min e ~ 30 minuti, rispettivamente.

Un risultato rappresentativo di un processo di digestione proteolitica eseguito contemporaneamente su una miscela di proteine, con le microreattori sopra descritti (figure 1 e 2), è fornita in Tabella 1. La tabella comprende le sequenze peptidiche uniche che identificano una proteina particolare, la croce punteggio correlazione (Xcorr) (ossia, un punteggio che caratterizza la qualità della partita sperimentale-to-teorico per lo spettro di mass...

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Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Veloce enzimatica Trattamento di proteine ​​per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Video: Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

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Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

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Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

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Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

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A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. However, to achieve robust sample manipulation it is necessary to address device integration with the macroscale environment. To realize repeatable, sensitive particle separation with microfluidic devices, this protocol presents a complete automated and integrated microfluidic platform that enables precise processing of 0.15&#8211;1.5 ml samples using microfluidic devices. Important aspects of this system include modular device layout and robust fixtures resulting in reliable and flexible world to chip connections, and fully-automated fluid handling which accomplishes closed-loop sample collection, system cleaning and priming steps to ensure repeatable operation. Different microfluidic devices can be used interchangeably with this architecture. Here we incorporate an acoustofluidic device, detail its characterization, performance optimization, and demonstrate its use for size-separation of biological samples. By using real-time feedback during separation experiments, sample collection is optimized to conserve and concentrate sample. Although requiring the integration of multiple pieces of equipment, advantages of this architecture include the ability to process unknown samples with no additional system optimization, ease of device replacement, and precise, robust sample processing.

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Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
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A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Sintesi di cationizzata Magnetoferritin per la magnetizzazione ultra-veloce di celle

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Piattaforma microfluidica con multiplex di rilevamento elettronico per spaziale monitoraggio di particelle

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Veloce enzimatica Trattamento di proteine per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine e piccole molecole

Elaborazione Postproduzione di fibre elettrofilate per l'ingegneria tissutale

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali

Hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine a basso Abbondanza

Una piattaforma per l'elaborazione di precisione Microfluidic piccola Volume del campione e il suo uso per Dimensione particelle biologiche separate con un Microdevice Acoustic

Rilevazione sensibile di Proteopathic Semina attività con FRET Citometria a flusso

Forno a microonde-driven sintesi di ossido di ferro Nanoparticelle per il rilevamento rapido di aterosclerosi

Sintesi di cationizzata Magnetoferritin per la magnetizzazione ultra-veloce di celle

Piattaforma microfluidica con multiplex di rilevamento elettronico per spaziale monitoraggio di particelle

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

Veloce enzimatica Trattamento di proteine ​​per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

Riepilogo

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Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

Elaborazione Postproduzione di fibre elettrofilate per l'ingegneria tissutale

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Hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine ​​a basso Abbondanza

Una piattaforma per l'elaborazione di precisione Microfluidic piccola Volume del campione e il suo uso per Dimensione particelle biologiche separate con un Microdevice Acoustic

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Sintesi di cationizzata Magnetoferritin per la magnetizzazione ultra-veloce di celle

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Hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine a basso Abbondanza